沈陽(yáng)地區(qū)漢族急性冠狀動(dòng)脈綜合征合并糖尿病患者SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布

高璐，李潞，趙紅麗，張曉丹，于淼

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)專業(yè)2016級(jí)碩士研究生，遼寧 沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管五科）

近年來(lái)，血脂異常越來(lái)越受到人們關(guān)注，根 據(jù)2016《中國(guó)成人血脂異常防治指南》顯示，針對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）合并糖尿病這一極高危人群，首選推薦他汀類藥物口服治療［1］。盡管他汀類藥物作用強(qiáng)大，但其降脂效果存在很大的個(gè)體差異，即使調(diào)整他汀類藥物劑量，仍有部分患者達(dá)不到預(yù)期效果，其不良反應(yīng)（諸如轉(zhuǎn)氨酶異常、肌溶解等）也同樣存在個(gè)體差異。ACS合并糖尿病患者作為極高危人群，如何安全有效降低血脂水平，減少主要心血管事件的發(fā)生成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究顯示，該差異除受患者的性別、年齡、肝腎功能和藥物相互作用等因素影響外，還與參與藥物代謝的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及藥物靶受體等基因多態(tài)性密切相關(guān)［2］。SLC O1B1和Apo E基因作為影響他汀類藥物藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)的2個(gè)重要基因［3］，在評(píng)估使用該類藥物有效性和安全性方面發(fā)揮巨大作用。本研究擬探討沈陽(yáng)地區(qū)漢族ACS合并糖尿病這一極高危人群其SL C O1 B1和ApoE基因分布特點(diǎn)，為臨床該類患者基于基因檢測(cè)的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2016年9月至2018年1月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院收治的203例ACS合并糖尿病患者，其中，男103例，女100例，年齡35～90歲，所有入選人群均為沈陽(yáng)地區(qū)漢族人群。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2013年版）》［4］；ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷和治療指南（2016）》［5］及《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》［6］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 H1650R臺(tái)式高速冷凍醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），Mini-6K微型低速離心機(jī)、MK2000-2干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），人類SLCO1B1和ApoE基因檢測(cè)試劑盒（武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司）。

1.3 方法 抽取ACS合并糖尿病患者空腹靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管中，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ⊙獦?00μl，進(jìn)行DNA提取，應(yīng)用PCR-熒光探針?lè)▽?duì)受檢血樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而讀取S L CO1B1和ApoE基因。記錄患者的基線資料：性別、年齡、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），對(duì)比各基因型患者間的性別、年齡以及TC、TG、LDL、HDL水平的差異。

1.3.1 提取DNA及PCR擴(kuò)增（1）將200μl血樣置入離心管中，加入200μl緩沖液GB以及20μl蛋白酶K，充分顛倒混勻，56℃放置10 min，取出后室溫放置2～5 min。（2）加入350μl緩沖液BD，充分顛倒混勻后，放入吸附柱中（吸附柱放于收集管中），12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中廢液。（3）向吸附柱加入500μl緩沖液GDB，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中廢液。（4）向吸附柱加入600μl漂洗液PWB，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中廢液。（5）重復(fù)操作步驟（4）后，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，室溫放置2 min。（6）將吸附柱轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加80μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，所得溶液即為提取的DNA。（7）分別取23μl的SLC O1B1*1b反應(yīng)液、SL C O1 B1*5反應(yīng)液、ApoE2反應(yīng)液、ApoE4反應(yīng)液置于反應(yīng)管中。（8）將2μl待測(cè)樣本DNA提取液、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照，分別加入已裝有4種PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中，制成總體積為25μl的反應(yīng)管。（9）將反應(yīng)管放入全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，擴(kuò)增條件：37℃10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃60 s，40個(gè)循環(huán)。（10）熒光通道FAM收集野生型熒光信號(hào)，熒光通道VIC收集突變型熒光信號(hào)，而熒光通道ROX作為內(nèi)標(biāo)熒光信號(hào)，根據(jù)所得擴(kuò)增曲線讀取DNA。

1.3.2 試劑盒和樣本有效性判定 試劑盒有效性判定——空白對(duì)照：FAM、VIC、ROX通道無(wú)循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值），或Ct值≥38，通道無(wú)擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照：FAM、VIC通道Ct值≤32，有明顯的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值＜38，有明顯的擴(kuò)增曲線。樣本有效性判定：所有樣本ROX通道Ct值＜38，有明顯的擴(kuò)增曲線。

1.3.3 基因型判定 根據(jù)擴(kuò)增曲線判讀基因型，F(xiàn)AM通道Ct值＜38，VIC通道無(wú)Ct值，或Ct值≥38，則為純合野生；FAM通道Ct值＜38，VIC通道Ct值＜38，則為雜合突變；FAM通道無(wú)Ct值，或Ct值≥38，VIC通道Ct值＜38，則為純合突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 本研究203例ACS合并糖尿病患者血液樣本中共檢測(cè)到7種SLCO1B1基因型，見(jiàn)表1；5種ApoE基因型，見(jiàn)表2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，SL CO1 B1及ApoE基因的多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率觀察值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

表1 沈陽(yáng)地區(qū)漢族203例ACS合并糖尿病患者SLCO1 B1基因分布情況

表2 沈陽(yáng)地區(qū)漢族203例ACS合并糖尿病患者ApoE基因分布情況

2.2SL CO1 B1三種基因表型間一般資料比較 根據(jù)他汀類藥物橫紋肌溶解、肌病風(fēng)險(xiǎn)及藥物耐受劑量情況，SLCO1B1基因可分為三種表型，以耐受較高型（*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b）最多，其所占比例為76.35%；耐 受 中 等 型（*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15）占21.67%；耐受較低型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）占1.97%。SL O C O1 B1三組基因表型在性別、年齡分布以及血脂水平上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 SL C O1B1三種基因表型間一般資料比較

2.3ApoE三種基因表型間一般資料比較ApoE基因根據(jù)其降脂的療效以及相關(guān)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)程度（如阿爾茨海默病、腦梗死、黃斑變性等）可分為三種表型，以一般型（E2/E4、E3/E3）所占最多，占67.48%；有害型（E3/E4、E4/E4）占22.17%；有益型（E2/E2、E2/E3）占10.34%。ApoE三組基因表型在性別、年齡分布以及血脂水平上，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 A po E三種基因表型間一般資料比較

3 討論

他汀類藥物廣泛應(yīng)用于臨床，在降低LDL、TC、TG，升高HDL的同時(shí)，還具有抗炎、穩(wěn)定粥樣斑塊等作用。根據(jù)2018 AHA/ACC膽固醇管理指南［7］的推薦，針對(duì)ACS合并糖尿病這一極高危人群，應(yīng)起始高強(qiáng)度他汀類藥物并維持，使LDLC的水平下降達(dá)到或超過(guò)50%，以1.8 mmol/L以下作為目標(biāo)。但相關(guān)文獻(xiàn)指出，應(yīng)用高強(qiáng)度的他汀類藥物治療，會(huì)增加其不良反應(yīng)的發(fā)生，如肝功能異常表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶升高，他汀類相關(guān)肌肉不良反應(yīng)表現(xiàn)為肌痛、肌炎、橫紋肌溶解，認(rèn)知功能異常，其他如頭痛、失眠、抑郁以及相關(guān)消化道反應(yīng)癥狀［1］。如何降低不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，安全有效使用他汀類藥物已成為人們研究的熱點(diǎn)，隨著科技的不斷發(fā)展，通過(guò)基因的個(gè)體化治療將成為一種趨勢(shì)。

SLCO1B1基因定位于12號(hào)染色體上，編碼有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP1B1這個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白參與多種藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，在他汀類藥物代謝中負(fù)責(zé)將血液中的藥物轉(zhuǎn)移至肝臟中，并決定藥物是否直接發(fā)揮藥效或代謝轉(zhuǎn)化為有活性物質(zhì)［8］。SLC O1B1具有基因多態(tài)性，可形成4種單倍 型：SL CO1 B1*1a、SL CO1 B1*1b、SLC O1B1*5、SL C O1 B1*15，其中后二者為突變基因型，可導(dǎo)致編碼的OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力減弱，使肝臟攝取藥物能力下降，導(dǎo)致他汀類藥物血藥濃度上升，增加其肝毒性，并加重橫紋肌溶解癥及肌病的風(fēng)險(xiǎn)［9-10］。有研究表明：攜帶有*5位點(diǎn)與他汀性肌病的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［11］，他汀類藥物相關(guān)肌病的發(fā)生為劑量依賴性，目前臨床上已有相關(guān)病例報(bào)道攜帶S L CO1B1*5等位基因是發(fā)生橫紋肌溶解癥的主要原因［12］。*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b型患者，其具有正常橫紋肌溶解癥或肌病風(fēng)險(xiǎn)，可考慮使用較大劑量他汀類藥物；*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15型患者，其具有中度橫紋肌溶解癥或肌病風(fēng)險(xiǎn)，可考慮使用中等劑量他汀類藥物；*5/*5、*5/*15、*15/*15型患者，其具有高度橫紋肌溶解癥或肌病風(fēng)險(xiǎn)，可考慮使用較低劑量他汀類藥物。

A po E基因定位于19號(hào)染色體上，所編碼的載脂蛋白通過(guò)多種途徑參與機(jī)體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，是影響機(jī)體血脂水平的重要內(nèi)在因素［13］。其同樣具有基因多態(tài)性，可以形成3種單倍體，分別為Apo E2、ApoE3、ApoE4以及三種基因表型。不同ApoE基因表型血脂水平不同［14］，并且與動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病、脂蛋白腎小球病、阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等多種疾病存在密切聯(lián)系［15-17］。ApoE4等位基因頻率上升是冠心病的重要標(biāo)志［18］。有研究顯示，E3/E4、E4/E4型患者其罹患腦梗死、冠心病、阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)最高，為高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病人群，其所占比例為27.59%［19］。此外，ApoE基因型與他汀類藥物的降脂療效有關(guān)，有研究顯示：ApoE3/E3基因型的患者經(jīng)阿托伐他汀治療后血脂水平及A po E基因表達(dá)的下調(diào)程度均高于ApoE3/E4型患者［20］。而對(duì)于糖尿病患者，有研究顯示，ApoE基因多態(tài)性可能與2型糖尿病周圍神經(jīng)病變有關(guān)，ApoE基因多態(tài)性是2型糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的危險(xiǎn)因素［21］，并且ApoE基因多態(tài)性與2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病足具有相關(guān)性，ApoE3/E4基因型和攜帶E4位點(diǎn)基因可能是2型糖尿病患者并發(fā)糖尿病足的危險(xiǎn)因素［22］。

本研究入選了203例ACS合并糖尿病患者，通過(guò)對(duì)其SL CO1 B1和A po E的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SL CO1 B1和Apo E基因在性別、年齡分布，以及血脂水平上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與既往相關(guān)文獻(xiàn)［19，23］一致，其可能與患者本身遺傳因素以及樣本量較少有關(guān)。約有76.35%的患者可耐受較高劑量的他汀類藥物，具有較低的肌病及肌溶解風(fēng)險(xiǎn)，攜帶有*5和（或）*15位點(diǎn)的患者占23.65%，應(yīng)關(guān)注其肌肉不良反應(yīng)。77.82%的患者服用他汀類藥物可獲得良好的降脂效果，但仍有22.17%的患者降脂療效較差，且罹患阿爾茨海默病、腦梗死、糖尿病相關(guān)并發(fā)癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)較高，在臨床上應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。目前針對(duì)患者基因型與臨床實(shí)際治療效果是否相驗(yàn)證的文獻(xiàn)較少，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步研究沈陽(yáng)地區(qū)漢族ACS合并糖尿病患者這一極高危人群SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)，本研究的樣本量過(guò)少，仍需臨床上大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步的研究。對(duì)于已服用或想要服用他汀類藥物的患者，建議其進(jìn)行SLCO1B1以及Apo E基因測(cè)定，可有效評(píng)估該患者適合劑量，預(yù)測(cè)患者有老年相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病人群，可提早進(jìn)行降脂干預(yù)，達(dá)到防范于未然的目的。