NF-κB靶向放療增敏作用及其機制研究進展

申麗君綜述 陳始明審校

迄今為止，惡性腫瘤仍舊是居民致死的主要原因之一，其治療手段有單純的手術、放療、化療、手術聯(lián)合放化療、免疫治療以及近期新興的基因療法等。雖然腫瘤治療的手段已越來越多，放射療法仍是一種有效的且高性價比的治療方法。放射療法殺死腫瘤細胞的生物學效應取決于輻射的種類、總劑量、分布率和目標器官[1]。放射線導致腫瘤細胞死亡的形式有細胞凋亡、壞死、自噬、有絲分裂突變、程序性壞死和衰老等[2]。早期鼻咽癌和非小細胞肺癌對放射治療極為敏感，患者放療后生存率很高；乳腺癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤等對放射療法不敏感，患者放療后生存率較低[3]。盡管放射療法是一種十分有效的治療方法，但大部分患者在經過幾個療程的放射治療后，會出現(xiàn)放療敏感性降低或放療耐受的情況，從而導致放射療法的治療效果降低或腫瘤復發(fā)轉移的情況。

近年來，研究腫瘤放療抵抗的原因及其相關機制的報道不斷增多。如PI3K/Akt[4]、Wnt/β-catenin[5]、ATM[6]、NF-κB[7]等信號異常與放療抵抗的關系。在這些信號當中，NF-κB的激活被認為是保護細胞、阻礙細胞凋亡的關鍵因子。因此，靶向NF-κB的放療增敏具有較大的研究前景。本文就NF-κB轉錄因子的組成、功能，其在放療過程中激活的分子機制以及其靶向抑制劑在放療增敏中的作用等分別進行綜述。

1 NF-κB轉錄因子的發(fā)現(xiàn)、組成及其作用

David Baltimore于1986年發(fā)現(xiàn)了核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)，其分布廣泛，可由細菌和病毒抗原、T和B細胞、有絲分裂素、細胞因子、氧化低密度脂蛋白以及超氧自由基、一氧化氮等多種刺激劑誘導而成。它存在于細胞核中并結合B細胞中免疫球蛋白kappa鏈的啟動子。在哺乳動物細胞中,NF-κB家族轉錄因子是由RelA (p65)、c-Rel、RelB、p50 (NF-κB1)和p52 (NF-κB2)等5個不同亞基組成的同質二聚體和異質二聚體。

NF-κB信號轉導由經典路徑和非經典路徑2條主要的路徑組成，其主要涉及NF-κB、IκB激酶(IKK)、IκB和NF-κB的家族成員[8]。經典信號通路和非經典信號通路都能引起NF-κB的激活。在經典信號通路中，配體與表面受體結合導致IKK復合物的招募和激活，隨后IKK復合物磷酸化IκB，最后導致其蛋白酶體的降解及NF-κB轉位至細胞核激活靶基因。在非經典通路中，配體與受體結合導致NF-κB誘導激酶的激活，與IKKα共同作用引起磷酸化依賴性泛素化和p100的加工，以及形成RelB/p52活性異二聚體[9]。

NF-κB參與調控許多形式的免疫和炎性應答。它是細胞凋亡及細胞周期的重要調控因素。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB是處于抑制狀態(tài)的，并且通過與抑制蛋白IκBs結合隱藏于細胞質之中。NF-κB調控的基因與細胞增殖和抗凋亡途徑相關，使得NF-κB被激活的腫瘤細胞更容易出現(xiàn)放療敏感性降低、放療抵抗的情況。多種分子或信號通路能夠激活NF-κB，繼而以這些重要分子或信號通路為靶點，靶向抑制NF-κB的活性，從而提高腫瘤的放療敏感性。

2 NF-κB激活的分子機制

2.1 ATM及DNA-PK信號通路 放射線照射后，NF-κB信號通路在細胞的DNA損傷過程中扮演著重要角色，Veuger等[10]報道ATM對NF-κB的激活具有重要作用。He等[11]的研究也闡述了ATM在腫瘤細胞放療環(huán)境下對NF-κB信號通路的影響：IKK直接使IkB磷酸化，從而激活NF-κB。根據目前的實驗研究，ATM與IKK之間聯(lián)系主要有兩方面。首先是ATM激酶，DNA雙鏈斷裂后，Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)復合體迅速募集到斷裂的DNA雙鏈周圍，隨后使ATM磷酸化。通過TRAF結合基序，ATM激活TRAF6，從而導致Ubc13介導的k63關聯(lián)的聚氨酯合成。聚氨酯的形成觸發(fā)了導致TAK1磷酸化的cIAP1、TAK1/TAB2和IKK復合物的生成[12]。激活的TAK1使IKK磷酸化，磷酸化的IKK能導致IκBα的磷酸化和泛素端依賴降解并釋放NF-κB(主要是p50/p65二聚體)。這些釋放物在細胞核中可自由活動。

其次是P53誘導的死亡結構域蛋白(PIDD)。PIDD經過兩處結構化處理，最后生成了一個48kDaN末端片段和一個包含死亡域(DD, PIDD-C)的51kDa終端片段，后者經進一步裂解產生37kDa片段(PIDD-CC)[13]。研究發(fā)現(xiàn)：細胞一旦接受電離輻射，PIDD-C轉移到細胞核中并形成一個RIP1 (受體相互作用蛋白1)和IKKγ的復合體。此復合體可促進IKKγ SUMO化。當ATM與IKKγ結合并使IKKγ磷酸化時，兩個級聯(lián)反應匯聚后IKKγ出現(xiàn)泛素化。磷酸化和泛素化的IKKγ仍舊與ATM結合，轉移出核內，然后與ELKS(富含谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和絲氨酸的蛋白質)結合，活化IKK復合體，激活的IKK使IκBα磷酸化并使IκBα隨后泛素化，靶向降解蛋白酶體[14]，激活NF-κB。

此外，細胞暴露于電離輻射會導致DNA雙鏈的斷裂，而DNA-PK的調節(jié)亞基與雙鏈DNA的末端結合，從而導致DNA-PKcs的激活。表皮生長因子受體(EGFR)被電離輻射激活的Src磷酸化，然后穿梭到細胞核中[14]。EGFR向細胞核的易位伴隨著細胞核中Ku70和Ku80蛋白的增加，最終導致DNA-PK的核激酶活性增加。最后使IκBβ磷酸化，激活NF-κB。因此，DNA-PK以不同的方式激活NF-κB，而且并不是由細胞質轉移到細胞核內的NF-κB，而是核內磷酸化的NF-κB與IκBβ結合使NF-κB激活。

NF-κB激活后，其下游的細胞生存及抗凋亡方面的靶基因相應的高表達，腫瘤放療敏感性相應下降。

2.2 VEGF/PLC-γ/PKC/NF-κB信號通路 血管內皮生長因子(VEGF)已經被證明是一種生存因子，它能對抗電離輻射誘導的細胞凋亡，從而起保護腫瘤細胞及正常細胞的作用。Yadav等[15]發(fā)現(xiàn)VEGF能夠降低電離輻射后的細胞損傷并增強放療抵抗作用。此外，腦腫瘤患者放療后血清VEGF增高，并且在多種人源腫瘤細胞系中，單次10 Gy照射24 h后即可誘導VEGF的分泌增加[16]。因此，電離輻射后，VEGF通路被激活。VEGF與其受體VEGFR2(KDR)結合并活化磷脂酶C(PLC)-γ的催化活性；而抗KDR抗體可以阻礙PLC-γ酪氨酸磷酸化[17]?；罨腜LC通過水解磷脂酰肌醇4、5-二磷酸[PtdIns(4,5)P2]生成肌醇1,4,5-三磷酸腺苷[Ins(1,4,5)P3]和1,2-二酰基甘油(DAG)，然后增加細胞質中磷酸二酰肌醇(DAG)和三磷酸三醇(IP3)的濃度。Ins(1,4,5)P3介導內質網(ER)中Ca2+釋放，DAG招募并激活蛋白激酶C (PKC)。凝血酶可以激活PKCα和c-Src激酶活性，而后誘導PKCα與IKKα/β之間的相互作用。同時，凝血酶也可以誘發(fā)c-Src和IKKα/β聯(lián)合，并最終激活PI-PLC/PKCα/c-Src/IKKα/β信號通路誘導激活NF-κB。此外，Karki等[18]的研究發(fā)現(xiàn)：c-Src和IKK復合體之間的直接相互作用導致IKKβ的磷酸化，且這種磷酸化依賴于PKC。反過來講，c-Src和IKK復合體誘導IκBα的磷酸化和激活NF-κB。

2.3 Gadd45α/p38/bcl-2/NF-κB信號通路 生長阻滯和DNA誘導損傷45(Gadd45)蛋白作為壓力傳感器發(fā)揮著重要作用。對生理變化或環(huán)境變化的反應研究發(fā)現(xiàn)：Gadd45參與了細胞周期阻滯、DNA修復、細胞存活或細胞凋亡等過程[19]。在低至2Gy的X射線照射下，Gadd45 mRNA水平在人源細胞中迅速升高[20]。此外，γ射線不僅在培養(yǎng)的細胞中可以誘導Gadd45 mRNA上升，在體外γ射線照射下，肝臟和其他一些組織中也能誘導Gadd45 mRNA的產生。Wingert等[21]證實在紫外線照射之下，通過Gadd45α/p38/NF-κB介導的生存途徑，激活Gadd45α活化NF-κB通路，進而促進了造血細胞的生存。

3 NF-κB靶向抑制劑在放療增敏中的作用

3.1 NF-κB特異性抑制劑 Kozakai及其團隊研究發(fā)現(xiàn)新型NF-κB抑制劑DHMEQ可增強前列腺癌細胞的放療敏感性[22]。在Kozakai的研究中，他們對LNCaP 和 PC-3兩種前列腺癌的細胞系進行放射線照射及NF-κB抑制劑的處理，實驗結果顯示，放療聯(lián)合NF-κB抑制劑顯著抑制了前列腺癌細胞的增殖，促進其凋亡，且抑制劑濃度越高，促凋亡的效果越明顯。動物實驗結果顯示皮下成瘤至64 d時，DHMEQ抑制劑聯(lián)合放療組的平均瘤體體積分別是空白對照組、單獨抑制劑組、單獨放療組的85.1%、 77.1%、64.7%，且通過評估裸鼠臟器及皮膚，未發(fā)現(xiàn)抑制劑DHMEQ有明顯的毒副作用及不良反應。該結果證實新型NF-κB抑制劑DHMEQ聯(lián)合放療具有顯著的抗腫瘤作用，并且這種特異性抑制劑所引起的毒副作用及不良反應較少。

還有研究發(fā)現(xiàn)，非甾體類藥物如布洛芬可通過直接抑制IκBα激酶來抑制NF-κB活性，從而提高放療敏感性；對于人源的前列腺癌細胞系DU145，聯(lián)合COX-2抑制劑NS398比單獨放療的抗腫瘤作用更明顯。然而以上抑制劑并沒有特異性的抑制NF-κB活性，故發(fā)生不良反應的機會可能更大。此外還有文獻報道靶向NF-κB的基因治療可抑制前列腺癌細胞中NF-κB的活性[23]，提高放療敏感性，但此方法應用于臨床仍有較長的路要走。天然成分中的姜黃素和染料木素具有抑制NF-κB活性的作用，其是否能增加腫瘤放射治療的敏感性也值得深入探討[24]。

3.2 NF-κB活化后靶基因抑制劑——PARP-1抑制劑(AG-014699) 多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)是一種核酶，它能調節(jié)DNA損傷時的細胞反應，可作為細胞應對放射線照射后單鏈和雙鏈DNA損傷的感受器。PARP-1在轉錄因子的協(xié)同調節(jié)中的作用可能是通過染色質結構的局部修飾和/或通過直接結合基因調控序列調控轉錄因子活性，或與包括Oct-1、NF-κB、AP-1和HIF-1a等轉錄因子在內的蛋白質之間的物理交互作用而實現(xiàn)。Veuger等[25]證實，與單獨輻射的細胞系相比，敲除PARP-1的細胞系的放療敏感性提高4倍，并且通過使用PARP-1小分子抑制劑AG-14361得到驗證。

Hunter及其團隊使用PARP-1抑制劑AG-014699研究了PARP-1在NF-κB活化后的作用，發(fā)現(xiàn)抑制劑AG-014699提高放療敏感性的作用機制是由于抑制了NF-κB活化后的下游靶基因的表達[26]。其細胞實驗結果顯示：PARP-1-/-MEFs細胞的放療敏感性是PARP-1+/+MEFs細胞的2.7倍；抑制劑AG-014699處理的PARP-1+/+MEFs細胞是單獨放療組的1.3倍。轉錄因子NF-κB在先天性和適應性免疫應答中具有重要作用，所以長時間使用NF-κB抑制劑可能會引起免疫缺陷。然而，在Hunter等[26]的研究結果中提到通過體外體內實驗的驗證，抑制劑AG-014699并沒有引起潛在的不良反應或免疫缺陷，顯示出良好的應用前景。

3.3 膠霉毒素抑制NF-κB的表達 用膠霉毒素(一種抗菌、抗病毒的因子)治療肝癌細胞時發(fā)現(xiàn)：它可以通過抑制由輻射誘導的Gadd45α、p38、NF-κB的表達，從而提高實驗細胞的放療敏感性。Hur等[27]研究發(fā)現(xiàn)，膠霉毒素和射線照射聯(lián)合使用對肝癌細胞HepG2的致死效果大約是單獨使用射線照射的2.5倍；HepG2細胞在4Gy的輻射劑量下，72 h后流式檢測凋亡結果顯示，膠霉毒素和射線照射聯(lián)合組的凋亡細胞數(shù)量為21.4%，較單純放療組、膠霉毒素組分別高17.1%、5.3%。此外，研究還證實：在受輻射照射的肝癌細胞中，膠霉毒素主要是通過抑制Gadd45a-P38-NF-κB介導的細胞存活途徑來促進細胞的凋亡、提高放療敏感性的[27]。因此，膠霉毒素聯(lián)合放射治療可被認為是提高肝癌細胞放療敏感性的有效治療策略之一。

Tang等[24]研究發(fā)現(xiàn)電離輻射能誘導Gadd45β的表達。Wang等[28]的研究進一步證實，暴露于電離輻射后，人乳腺癌MCF-7細胞中Gadd45β的表達將明顯增加，且這種增加是由于NF-κB的激活所引起的。由NF-κB誘導的Gadd45β可以下調促凋亡的JNK表達。Hwang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線的輻射之下，NF-κB/Gadd45β通路活化能抑制MKK7-JNK通路活性從而促進造血細胞的生存。NF-κB的亞基p65與胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)的相互作用形成一個輻射誘導的適應性反應網絡。反過來講，Gadd45β進一步增強了NF-κB和ERK的活性，形成一個環(huán)狀聯(lián)系，從而延長細胞的生存時間[28]。因此，理論上可以通過使用這3種分子中的任何一種抑制劑來破壞這個環(huán)狀關系，從而開發(fā)出一種增強放射敏感性的方法。然而，目前關于這方面的抑制劑還未在實驗中得到證實，值得今后深入研究。

4 展 望

NF-κB是一個保護腫瘤細胞免受放射線照射損害的關鍵因素。因此，NF-κB成為腫瘤放療中極有吸引力的放療增敏靶基因。隨著研究的不斷深入，科研工作者已經通過細胞及動物實驗的研究，發(fā)現(xiàn)了一些特異性極強的抑制劑，這些抑制劑或者直接抑制NF-κB，或者通過抑制激活NF-κB信號的關鍵分子從而達到使腫瘤對放射線治療更加敏感的目的。這為NF-κB靶向的分子抑制劑在臨床的使用奠定了基礎，更為臨床上的腫瘤放療患者提供了更好的選擇。今后的重點和焦點將是研發(fā)更多高效的、特異的NF-κB靶向抑制劑并開展相應的臨床前及臨床應用研究，從而應用于惡性腫瘤的臨床放射治療。這對耐放射性治療的惡性腫瘤及放射治療后復發(fā)的惡性腫瘤治療具有重要的意義。