不同載體微球在p300與RORγt Co-IP實(shí)驗(yàn)效率的比較

王秀男，滕 霄，劉 彪，殷浩程，任翠平，劉 淼，沈際佳

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)作為檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典且常用方法被現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究廣泛使用，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、可信度高、自然狀態(tài)下可操作且能夠?qū)Φ鞍装攵糠治龅葍?yōu)點(diǎn)[1-4]。腺病毒E1A結(jié)合蛋白p300(adenovirus E1A binding protein p300，p300)是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，分子量為300 ku。維甲酸相關(guān)孤兒核受體(retinoid-related orphan receptor gamma t，RORγt)是輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)的特異性關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，分子量為72 ku。由于p300與RORγt蛋白大小懸殊較大且兩者相互作用，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)由于p300與RORγt蛋白質(zhì)分子量差別較大，進(jìn)行Co-IP時(shí)使用Protein A/G-磁珠或者Protein A/G-瓊脂糖珠很難做出真正顯示出其蛋白表達(dá)量且清晰準(zhǔn)確的目的蛋白條帶，因此為解決此問(wèn)題，本文選取p300與RORγt兩目的蛋白探究如何準(zhǔn)確選取Protein A/G-磁珠或者Protein A/G-瓊脂糖珠進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源Myc-RORγt、Flag-p300等相關(guān)質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所李斌研究員提供。

1.2 主要試劑抗-RORγt(# 14-6988-82)購(gòu)自上海EB生物公司；抗-p300(sc-48343)購(gòu)自德國(guó)Santa Cruz生物公司；抗β-actin(BM0627)購(gòu)自上海BOSTER生物公司；蛋白抑制劑Cocktail(#083M4021V)和抗-Myc(#2276)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；抗-Flag (AT002) 抗體購(gòu)自青島CMC生物公司；Opti-MEM培養(yǎng)基和抗-CD3/CD28 (11161D)Dynal beads購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Protein A/G-磁珠 (LSKMAGA10)購(gòu)自美國(guó)MILLIPORE公司；Protein A/G-瓊脂糖珠(A10001) 購(gòu)自美國(guó)Abmart公司，重組人白介素6(recombinant human interleukin 6，rhIL-6)、rhIL-21、rhIL-23、重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(recombinant human transforming growth factor β，rhTGF-β)、rhIL-1β、白介素4抗體(interleukin 4 antibody，anti-IL-4)、γ干擾素抗體(interferon-γ antibody ，anti-IFN-γ)均購(gòu)自北京R&D公司。

1.3 HEK293T細(xì)胞人胚腎細(xì)胞系293T(human embryonic kidney 293T cells, HEK293T)培養(yǎng)于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Gibco公司) [內(nèi)含1%青霉素(即100 U/ml)、1%鏈霉素(即100 mg/ml)、1%谷氨酰胺]。

1.3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞以每孔1×106個(gè)鋪于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，細(xì)胞密度生長(zhǎng)達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行換液，Opti-MEM培養(yǎng)基900 μl /孔置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。以1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300為例，將1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300的質(zhì)粒DNA和100 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混合后加入12 μl 聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)并渦旋振蕩2 s，混合均勻，點(diǎn)動(dòng)離心，室溫靜置10 min。將上述質(zhì)粒和PEI混合液緩慢滴加到HEK293T細(xì)胞中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。5 h后去除含有轉(zhuǎn)染混合液的培養(yǎng)基，更換成含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為摸索最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3組濃度對(duì)比，分別為：Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶2 μg或1 μg ∶3 μg或1 μg ∶4 μg。

1.3.2Co-IP實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入300 μl 細(xì)胞裂解液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，100 W超聲5 s后，4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)30 min。然后離心取上清液30 μl，加入30 μl 2×SDS上樣緩沖液作Input。將剩余約270 μl上清液中加入3 μg anti-Myc抗體于4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)3 h。洗滌Protein A/G-瓊脂糖珠或者Protein A/G-磁珠加入裂解的細(xì)胞中4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。清洗珠子，然后每管加40 μl上述洗滌液和10 μl 5×上樣緩沖液(SDS)，100 ℃，煮沸10 min，置于冰上冷卻進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜：p300 (約300 ku)：110 v，3 h；RORγt (72 ku)；β-actin(42 ku)：110 V，1.5 h；封閉1 h后孵育一抗，4 ℃滾動(dòng)搖床過(guò)夜，最后洗滌，室溫孵育二抗1 h，顯影。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn)96孔板每孔5 000個(gè)HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)24 h，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行CCK8 (CK04，上海東仁化學(xué)科技有限公司)檢測(cè)。

1.5 Th17細(xì)胞分化收集人臍血分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用EasySepTMHuman Na?ve CD4+T Cell Isolation Kit(#28067)分選試劑盒分選出Na?ve T細(xì)胞，在anti-CD3/CD28 dynal beads的刺激下，50 ng/ml rhIL-6、25 ng/ml rhIL -21、100 ng/ml rhIL-23、 10 ng/ml rhIL-1β和1 ng/ml rhTGF-β等細(xì)胞因子和10 ng/ml anti-IL-4和10 ng/ml anti-IFN-γ兩個(gè)抗體條件下，Na?ve CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，培養(yǎng)至第6天，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 選取1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞鋪板(6孔板)，培養(yǎng)24 h后，共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶2 μg和1 μg ∶3 μg和1 μg ∶4 μg，見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶3 μg時(shí)轉(zhuǎn)染效果最佳(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上)。

圖1 過(guò)表達(dá)Myc-RORγt和Flag-p300入HEK293T細(xì)胞

2.2 CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為了排除轉(zhuǎn)染試劑PEI影響細(xì)胞活性而導(dǎo)致蛋白表達(dá)不均一的可能，實(shí)驗(yàn)使用HEK293T細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，分別設(shè)置了PEI 8、10、12、14 μl，圖2顯示PEI 8、10、12 μl時(shí)細(xì)胞活性并未受影響，PEI 14 μl與8 μl比較時(shí)細(xì)胞活性略受影響(F=4.78，P=0.032)，為了保證細(xì)胞活性不受影響且能夠保證轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)最終選擇PEI 12 μl進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

圖2 CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 與PEI 8 μl比較：*P<0.05

2.3 HEK293T細(xì)胞中選取磁珠捕獲p300蛋白而選取瓊脂糖株捕獲RORγt體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共轉(zhuǎn)染Flag-p300和Myc-RORγt 入HEK293T細(xì)胞48 h后進(jìn)行Co-IP，細(xì)胞裂解液用Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，見(jiàn)圖3A；細(xì)胞裂解液用Myc抗體進(jìn)行免疫沉淀，見(jiàn)圖3B，泳道1指使用磁珠捕獲蛋白，泳道2指使用瓊脂糖珠捕獲蛋白，圖3A、B可以看出使用磁珠比使用瓊脂糖珠捕獲p300蛋白效果要好，而捕獲RORγt蛋白效果則相反；圖3C(t=6.52，P=0.007，P<0.01)和圖3D(t=2.89，P=0.003，P<0.01)分別為對(duì)圖3A和圖3B 中目的蛋白灰度值比值統(tǒng)計(jì)分析，圖3C、3D數(shù)值來(lái)源于其對(duì)應(yīng)的目的蛋白與對(duì)應(yīng)的β-actin的比值，并且實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

圖3 共轉(zhuǎn)染Flag-p300和 Myc-RORγt入HEK293T細(xì)胞免疫共沉淀

A：用磁珠捕獲p300蛋白進(jìn)行Co-IP；B：用瓊脂糖株捕獲RORγt蛋白進(jìn)行Co-IP；C：兩種珠子捕獲p300蛋白效果的統(tǒng)計(jì)圖；與磁珠比較：**P<0.01；D：兩種珠子捕獲RORγt蛋白效果的統(tǒng)計(jì)圖；與瓊脂糖珠比較：**P<0.01

2.4 Th17細(xì)胞中捕獲p300蛋白適合選取磁珠而捕獲RORγt適合選取瓊脂糖珠體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，收集誘導(dǎo)分化第6天的Th17細(xì)胞進(jìn)行Co-IP，結(jié)果與HEK293T細(xì)胞結(jié)果一致，即捕獲p300大蛋白更適合使用磁珠而捕獲RORγt適合選取瓊脂糖株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Th17-p300：t=6.893，P=0.008，P<0.01；Th17-RORγt：t=2.803，P=0.005，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

3 討論

Co-IP是用于蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，其中捕獲蛋白步驟在Co-IP實(shí)驗(yàn)過(guò)程中占據(jù)重要地位，首先篩選出質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染最佳比例，本研究結(jié)果顯示，Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶3 μg時(shí)轉(zhuǎn)染效果最佳；轉(zhuǎn)染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，同等條件下共轉(zhuǎn)染Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶4 μg時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較差，Western blot顯示其β-actin表達(dá)較弱可能由于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)變差。本研究發(fā)現(xiàn)在保證轉(zhuǎn)染試劑PEI既不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性有毒性又保證轉(zhuǎn)染效率的情況下，共轉(zhuǎn)染Flag-p300和Myc-RORγt質(zhì)粒條件相同時(shí)，收取細(xì)胞進(jìn)行Co-IP，結(jié)果顯示用磁珠捕獲p300蛋白比用瓊脂糖珠捕獲蛋白效果較好，而RORγt則相反，于是本研究得出結(jié)論對(duì)于大分子蛋白來(lái)說(shuō)，使用磁珠進(jìn)行Co-IP效果更佳，而中小分子蛋白則適合使用瓊脂糖珠。

圖4 Th17細(xì)胞免疫共沉淀

A：用磁珠捕獲p300蛋白進(jìn)行Co-IP效果較好；B：用瓊脂糖株捕獲RORγt蛋白進(jìn)行Co-IP效果較好；C：p300蛋白分別用磁珠和瓊脂糖珠捕獲蛋白進(jìn)行Co-IP條帶灰度值統(tǒng)計(jì)分析；與磁珠比較：**P<0.01；D： RORγt蛋白分別用磁珠和瓊脂糖珠捕獲蛋白進(jìn)行Co-IP條帶灰度值統(tǒng)計(jì)分析；與瓊脂糖珠比較：**P<0.01

由于目的蛋白分子量大小懸殊過(guò)大，兩者相互作用進(jìn)行Co-IP可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。查閱很多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Co-IP 步驟類似，其中捕獲蛋白使用的載體珠不同，總結(jié)出在分子量為35～110 ku蛋白使用Protein A/G-瓊脂糖珠捕獲蛋白[5-7]，分子量為114～290 ku 的范圍使用Protein A/G-磁珠捕獲蛋白[8-9]，當(dāng)然也有較少文獻(xiàn)[10]使用Protein A/G-磁珠捕獲中分子量蛋白(65 ku)，也有較少文獻(xiàn)使用Protein A/G-瓊脂糖珠捕獲較大分子量蛋白(164 ku)[11]，本研究對(duì)使用Protein A/G-磁珠和Protein A/G-瓊脂糖珠在Co-IP過(guò)程中捕獲不同大小的蛋白，能夠幫助研究者們?cè)谶M(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)選取較符合自己實(shí)驗(yàn)試劑和方案方法。本實(shí)驗(yàn)有利于研究者根據(jù)自己的試驗(yàn)?zāi)康倪x取正確的載體微球進(jìn)行Co-IP，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差而影響試驗(yàn)?zāi)康牡呐袛?。?jīng)檢索中外文數(shù)據(jù)庫(kù)，均沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)層析介質(zhì)進(jìn)行比較的研究報(bào)道。兩種微球在捕獲不同分子量蛋白效率不同，是由于其組成介質(zhì)的不同，抑或是Protein A/G比例用量以及偶聯(lián)方法不同等因素的影響，這是試劑研發(fā)和試劑使用選擇時(shí)值得關(guān)注的問(wèn)題。