富血小板凝膠在兔糖尿病潰瘍模型中的研究

方 穎，曹東升，謝 娟，呂 陽

傷口愈合是一個復(fù)雜的過程，它涉及多個細(xì)胞群、細(xì)胞外基質(zhì)和可溶性介質(zhì)，如生長因子和細(xì)胞因子[1]。如果正常的愈合過程被中斷，糖尿病潰瘍會由于缺乏生長因子和細(xì)胞因子而在本質(zhì)上成為慢性潰瘍。糖尿病潰瘍傳統(tǒng)治療方法傷口愈合緩慢，治療時間長，治療成本高，給患者帶來痛苦。自體富血小板凝膠(autologous platelet-rich gel,APG)是一種生物活性化合物，自1985年問世以來，由于其具有激活和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和血管生成，加速傷口愈合的優(yōu)點，被廣泛運用于治療創(chuàng)面[2]。該研究通過制作兔糖尿病皮膚潰瘍動物模型，將富血小板凝膠應(yīng)用于糖尿病兔潰瘍創(chuàng)面，觀察其療效，分析該方法的臨床效果和可行性，為臨床治療難治性糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗對象24只新西蘭雄性白兔，約3月齡，2.5～3 kg，在環(huán)境溫度為(22±2) ℃，濕度為(55±5)%的條件下，在安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。保持室內(nèi)通風(fēng)良好，實驗前預(yù)飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境。在整個實驗期間，兔子隨意喂食和水。

1.2 糖尿病兔模型及皮膚創(chuàng)面的建立

1.2.1糖尿病兔建模 將5 g四氧嘧啶(北京索萊寶科技有限公司)溶解在100 ml氯化鈉中，制備5%四氧嘧啶溶液。在每只兔子通過體重秤稱重后，立即通過無菌注射器取出試劑以120 mg/kg將其注射到耳靜脈中。然后按照一只一籠送回飼養(yǎng)籠，每日三餐予以正常喂養(yǎng)，每餐兔糧予以適當(dāng)加量，正常飲水。每日上午空腹測血糖，直到血糖持續(xù)7 d高于11.0 mmol/L，表明糖尿病兔模型成功建立[3]。

1.2.2創(chuàng)面的形成 將糖尿病兔背部備皮，將直徑為2.5 cm的圓紙片放置于糖尿病兔脊柱兩側(cè)，分別用亞甲藍(lán)標(biāo)記。稱重后，按3 ml/kg的注射劑量，用1%戊巴比妥鈉注入耳緣靜脈。麻醉效果滿意后固定于手術(shù)臺上，消毒鋪巾后，用剪刀片沿著標(biāo)記線切開皮膚至筋膜層，完全去除皮膚層。創(chuàng)面出血點血管鉗夾閉止血，生理鹽水沖洗后無菌紗布加壓包扎固定，術(shù)后預(yù)防性使用青霉素鈉20萬單位肌肉注射。余下兔子重復(fù)上述操作。

1.3 APG的制備從糖尿病兔耳緣靜脈中取10 ml血液，放入管底已有1 ml枸櫞酸鉀的無菌離心管內(nèi)，混合后，2 000 r/min離心4 min，并將上部血漿吸引至1 mm的紅細(xì)胞層。移至另一個無菌離心管中，4 000 r/min離心6 min，吸出3/4上清液棄去。搖動剩余的下層并富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)。將凝血酶1 000 U溶于10%氯化鈣注射液1 ml配置成凝血酶-鈣劑，使PRP和凝血酶鈣劑以10 ∶1比例混合，等待自然凝固后即可形成APG凝膠備用。見圖1。

圖1 APG的制備A：兔全血；B：一次離心后；C：APG凝膠；D：APG覆蓋創(chuàng)面

1.4 干預(yù)治療潰瘍創(chuàng)面形成之后將所有的實驗動物的背部脊柱左側(cè)創(chuàng)面標(biāo)記為a，脊柱右側(cè)創(chuàng)面標(biāo)記為b，a缺損用APG覆蓋治療，b缺損用無菌生理鹽水清洗后用0.5%的安多福常規(guī)換藥，用紗布和繃帶固定。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1創(chuàng)面面積 記錄所有傷口并在傷口形成時，干預(yù)后3、7、14 d用數(shù)碼相機編號。將圖片上傳至Image J圖片分析軟件中，得出每次創(chuàng)面的面積大小。

1.5.2免疫組織化學(xué)檢查 分別在干預(yù)治療后1周末、2周末取創(chuàng)面新鮮肉芽組織進(jìn)行石蠟包埋，免疫組化標(biāo)記血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGF)，VEGF染色及IGF染色陽性呈不同程度的棕色。采用光學(xué)顯微鏡拍照及 Image Plus Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)測定VEGF及IGF含量。隨機選擇每個切片的4個高倍視野視圖，并測量它們各自的平均光密度并取平均值。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察糖尿病兔成功建模后，水和尿量明顯增加，體質(zhì)量下降，實驗動物全部存活。創(chuàng)面治療前，兩組創(chuàng)面大小基本相同；治療1周后，實驗組創(chuàng)面面積跟對照組相比明顯縮??；治療2周后，實驗組創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組(圖2)。

圖2 創(chuàng)面形成后治療1周和2周時創(chuàng)面愈合情況

A：實驗組創(chuàng)面治療前；B:對照組創(chuàng)面治療前；C:APG治療1周；D:常規(guī)換藥治療1周；E、F:治療2周；a:APG組；b：對照組

2.2 創(chuàng)面面積及容積變化治療前創(chuàng)面大小無統(tǒng)計學(xué)意義；相比于空白對照組，APG組治療后的皮膚潰瘍面積減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。以3周末為終末觀察點，實驗組創(chuàng)面有23個愈合，愈合率為95.8%，對照組創(chuàng)面有11個愈合，愈合率為45.8%。

表1 治療前及治療后潰瘍面積變化

2.3 免疫組化VEGF、IGF平均光密度值在第1周末和第2個周末，通過免疫組化照片可以明顯看出APG組中VEGF和IGF的陽性率與空白對照組中的陽性率顯著不同，見圖3、4，實驗組的陽性率均高于對照組。在第1周末和第2周末，APG治療組中VEGF及IGF的平均光密度值與對照組中VEGF及IGF的平均光密度值相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖3 治療組及對照組VEGF免疫組化表達(dá)情況 ×400

A：第1周末APG組VRGF標(biāo)記后；B:第1周末對照組VRGF標(biāo)記后；C:第2周末APG組VRGF標(biāo)記后；D:第2周末對照組VRGF標(biāo)記后

圖4 治療組及對照組IGF免疫組化表達(dá)情況 ×400

A：1周末APG組IGF標(biāo)記后；B:1周末對照組IGF標(biāo)記后；C:2周末APG組IGF標(biāo)記后；D:2周末對照組IGF標(biāo)記后

表2 各組創(chuàng)面組織不同時間的VEGF及IGF的

3 討論

在本研究中，APG被用作糖尿病潰瘍的非侵入性治療方法，應(yīng)用于糖尿病兔潰瘍創(chuàng)面中并且獲得了良好的結(jié)果。一般傷口愈合包括止血、炎癥、增殖和重塑四個過程[4]，然而糖尿病潰瘍的愈合過程并未遵循。糖尿病潰瘍正常的愈合過程經(jīng)常被中斷，導(dǎo)致傷口在一個或多個上述愈合階段停滯[5]。由于缺乏生長因子和細(xì)胞因子，潰瘍可能變成慢性、延緩愈合過程[6]。

血液不僅僅是向各種細(xì)胞和器官輸送氧氣和營養(yǎng)，也是一個具有相互作用的細(xì)胞和基質(zhì)的完整組織。在凝血過程中，該組織僅在受傷部位以固體形式聚集和穩(wěn)定自身。血小板濃縮物通常是天然血凝塊的人工版本，它們也應(yīng)該模擬凝血的內(nèi)在功能，創(chuàng)建組織再生的指導(dǎo)基質(zhì)[7]。因此，血小板濃縮物應(yīng)被視為組織，而不是藥物佐劑，對這些生物材料特性的評估與凝血和愈合本身的研究一樣復(fù)雜。與所有組織一樣，血小板濃縮物聚集了許多協(xié)同作用的成分，參與愈合過程。

本實驗在第1周末及第2周末分別取兔子新生肉芽組織及皮膚進(jìn)行免疫組化標(biāo)記VEGF及IGF，APG組蛋白平均光密度均高于對照組。VEGF是血管生成的中介，其刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并且還是血管生成的有效誘導(dǎo)物，其影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[8]。IGF由血小板大量釋放，在血液中以循環(huán)形式存在,這一因素不僅在傷口愈合和凝血過程中很重要，而且是當(dāng)前生物體生存的中介，其功能依賴于局部情況，對細(xì)胞增殖分化有積極影響，但主要是誘導(dǎo)存活信號，保護細(xì)胞免受各種凋亡刺激[9]。

作為局部敷料，APG的作用是為傷口愈合提供所需的生長因子[10]，愈合的初始階段由血小板分泌的生長因子介導(dǎo)。血小板由凝血酶激活，凝血酶是一種促進(jìn)傷口愈合的天然血小板活化劑。利用凝血酶-鈣劑來激活血小板，在生長因子釋放和促進(jìn)凝膠形成方面取得了良好的效果。此外，使用凝血酶-鈣劑也帶來了一些實際的好處，使制備凝膠形成的時間更短，重現(xiàn)性更高。Anitua et al[11]在血小板活化后24 h內(nèi)觀察到生長因子釋放的動力學(xué)。通過掃描電子顯微鏡(SEM)發(fā)現(xiàn)生長因子釋放有顯著的高水平，這些高水平可以歸因于凝血酶-鈣劑和氮循環(huán)的差異，氮循環(huán)用于溶解血塊并釋放血塊內(nèi)的所有生長因子，從而增加濃度。葡萄糖酸鈣的加入促進(jìn)了天然凝血酶的逐漸形成，它模仿了生理凝血過程，使生長因子持續(xù)釋放[12]。APG促進(jìn)基質(zhì)的合成和沉積，促進(jìn)纖維肉芽組織的形成，改善膠原合成，并在創(chuàng)傷后上皮再生、間質(zhì)增生和新血管形成中起重要作用。

本實驗將自體血小板凝膠治療糖尿病兔創(chuàng)面取得了良好的療效，為以后臨床廣泛應(yīng)用自體血小板凝膠提供動物試驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。