魁蚶Ets家族9個(gè)基因的克隆及其在病毒感染應(yīng)答中的表達(dá)分析*

魏智薪 辛魯生 白昌明 李亞楠 張淑敏 李成華 王崇明

魁蚶Ets家族9個(gè)基因的克隆及其在病毒感染應(yīng)答中的表達(dá)分析*

魏智薪1,3辛魯生2,3白昌明2,3李亞楠3張淑敏3李成華1王崇明2,3①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

Ets蛋白是宿主MAPK信號(hào)通路下游的一類可參與調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過(guò)基因克隆成功獲得魁蚶() Ets家族9條基因(分別命名為)，開放閱讀框(ORF)大小分別為1065、1290、1569、912、1344、1404、1521、1968和1191 bp，并分別編碼354、429、522、303、447、468、506、655和396個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分類表明，本研究所獲得的基因均屬Ets家族。對(duì)ETS-1和ETS-3的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)分析表明，其均含有高度保守的ETS結(jié)構(gòu)域。在不同水溫條件下，通過(guò)人工注射牡蠣皰疹病毒(OsHV-1)對(duì)魁蚶進(jìn)行感染，并對(duì)病毒拷貝數(shù)和的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，和只在高溫陽(yáng)性組中相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，與病毒拷貝數(shù)在高溫條件下增長(zhǎng)趨勢(shì)呈正相關(guān)；和只在低溫陽(yáng)性組中相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，但在高溫陽(yáng)性組中和的相對(duì)表達(dá)量與病毒拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)；初步研究結(jié)果顯示，從魁蚶基因中篩選出2條基因(和)，在高溫條件下(16±2)℃，其可能參與正向調(diào)控病毒OsHV-1的復(fù)制過(guò)程。本研究為進(jìn)一步探索魁蚶在夏季因感染牡蠣皰疹病毒(OsHV-1)而導(dǎo)致的大量死亡提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

魁蚶；Ets家族；OsHV-1；克隆；溫度

魁蚶()屬瓣鰓綱(Lamelli- branchia)、翼形亞綱(Pteriomorphia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae)(劉寒苗等, 2017; 李瑤瑤等, 2018)，是一種底棲冷水性大型貝類，主要分布于中國(guó)黃渤海、日本海、朝鮮半島及俄羅斯東南部等沿海地區(qū)(毛雪英等, 2007; 張啟剛等, 2007)；在近海岸水深3 m到外海近60 m處的泥沙質(zhì)或泥質(zhì)海底均有分布(梁超等, 2010)。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高、口感鮮美，深受消費(fèi)者喜愛，成為中國(guó)對(duì)外出口創(chuàng)匯的重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一(劉錫胤等, 2002)。

持續(xù)擴(kuò)大的市場(chǎng)需求和有限的養(yǎng)殖環(huán)境使貝類養(yǎng)殖業(yè)向高密度養(yǎng)殖發(fā)展，隨之而來(lái)的則是大規(guī)模的病害暴發(fā)，在高溫季節(jié)，病害問題尤為嚴(yán)重，嚴(yán)重制約著海水貝類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。貝類的病原(Elston, 1997; Hine, 2000)可分為細(xì)菌、病毒和寄生蟲類等，其中，病毒類病原以致死率高、感染速度快等特征引起廣泛關(guān)注，尤以牡蠣皰疹病毒OsHV-1 (Ostreid herpesvirus 1)的危害最為嚴(yán)重(胡宗福等, 2017; Roque, 2012; Webb, 2007; Barbosa- Solomieu, 2005)。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，該疫病就在法國(guó)和美國(guó)牡蠣養(yǎng)殖海域連年暴發(fā)，隨后蔓延至歐、美、亞等牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Renault, 2001; Segarra, 2010)。在中國(guó)，OsHV-1已造成了扇貝(Ren, 2013)和魁蚶的大規(guī)模死亡(Xia, 2015)。

病毒復(fù)制過(guò)程依賴宿主細(xì)胞，包括必需的能量和功能蛋白元件等均需要宿主細(xì)胞供給(Ruelas, 2013)。OsHV-1屬于雙鏈DNA病毒，需在宿主細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄復(fù)制(Jouaux, 2013; 胡宗福等, 2017)。Ets(E-Twenty-Six)轉(zhuǎn)錄因子家族是含有ETS結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，是宿主細(xì)胞核中一類可參與調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制的重要轉(zhuǎn)錄因子。Ets轉(zhuǎn)錄因子在MAP激酶、Ca2+依賴的信號(hào)通路以及TGF-β等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)下，參與調(diào)控胚胎的發(fā)育、細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，進(jìn)而調(diào)控許多生理和病理過(guò)程(曾紅等, 2017; Suico, 2017)。Pleschka等(2001)研究表明，流感病毒的傳播受到RAF/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)的抑制。Bosselut等(1990)對(duì)HTLV-1的研究發(fā)現(xiàn)，人的Ets1和Ets2蛋白參與調(diào)控HTLV-1病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程。本研究基于Ets的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能和OsHV-1中存在Ets結(jié)合位點(diǎn)，初步推斷Ets轉(zhuǎn)錄因子可能參與OsHV-1的復(fù)制調(diào)控過(guò)程。本研究采用基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)克隆魁蚶Ets轉(zhuǎn)錄因子，研究其在感染OsHV-1后的表達(dá)變化，以及進(jìn)一步對(duì)Ets轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)表達(dá)量變化與病毒拷貝數(shù)變化進(jìn)行相關(guān)性分析。以期為OsHV-1感染魁蚶的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用魁蚶捕撈自渤海海域。隨機(jī)選取2齡魁蚶[殼長(zhǎng)為(6.0±1.0) cm，殼高為(5.0±1.5) cm，體重為(90±10) g)]，實(shí)驗(yàn)室室溫暫養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用魁蚶暫養(yǎng)分為(16±2)℃的高溫暫養(yǎng)和(10±2)℃的低溫暫養(yǎng)，暫養(yǎng)時(shí)間為1周。暫養(yǎng)期間，每天更換1次海水，每次更換1/2體積；魁蚶日常投喂適量小球藻()，并始終充氧。魁蚶病料為自然感染OsHV-1個(gè)體，?80℃保存(用于制備病毒懸液)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 采用Trizol (TaKaRa)法進(jìn)行樣本總RNA提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量。使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)量其濃度。以提取的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remove(TOYOBO)合成第一鏈cDNA，實(shí)驗(yàn)方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。?80℃保存cDNA備用。

1.2.2 魁蚶Ets家族基因開放閱讀框(ORF)的克隆及測(cè)序 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的魁蚶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得Ets家族的部分基因的全序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ORF引物(表1)，并利用KOD酶進(jìn)行擴(kuò)增。采用擴(kuò)增體系(20 μl)：cDNA模板1 μl、KOD酶0.4 μl、前引物0.5 μl、后引物0.5 μl、2×KOD酶緩沖液10 μl、超純水3.6 μl、2 mmol/L dNTP 4 μl；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，58.0℃退火 30 s，68℃延伸2.0 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa)將目的條帶進(jìn)行切膠回收。隨后，將回收的目的片段與pMD19-T載體(3∶1)在16℃連接過(guò)夜，取5 μl連接產(chǎn)物與50 μl大腸桿菌()DH5α感受態(tài)細(xì)胞在42℃熱激30 s。利用載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的引物RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAG)和M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)對(duì)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽(yáng)性單克隆經(jīng)驗(yàn)定后送生派生諾(青島)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 魁蚶Ets家族基因的生物信息學(xué)分析 將測(cè)序結(jié)果正確的目的基因進(jìn)行BLAST(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)同源性比對(duì)，利用在線網(wǎng)址(http:// www.expasy.org/)將基因的cDNA序列推導(dǎo)成氨基酸序列；使用MEGA7.0進(jìn)行進(jìn)化樹分析；利用生物在線網(wǎng)站(https://zhanglab.ccmb.med.umich. edu/cgi-)bin/itasser_submit.cgi)對(duì)、編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)、ETS結(jié)構(gòu)域及酶催化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 OsHV-1病毒懸液的制備及拷貝數(shù)檢測(cè) 將本課題組?80℃保存的自然感染OsHV-1的魁蚶放置冰上解凍，隨后取外套膜組織1~2 g，將樣本潤(rùn)洗2~ 3次。無(wú)菌剪刀剪碎，按1∶9(g∶ml)加入無(wú)菌海水(0.22 μm過(guò)濾)，50 ml無(wú)菌管組織勻漿(5~10 s/3次)。低速離心去除雜質(zhì)：1000 g，4℃，5 min。取上清液 4倍稀釋，過(guò)濾濾膜(5 μm–2 μm–0.45 μm–0.22 μm)，4℃保存。按Roche High Pure Viral Nucleic Acid Kit試劑盒說(shuō)明書提取病毒懸液DNA。將提取后產(chǎn)物的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。檢測(cè)體系(20 μl)：2× Mix 10 μl、BF引物0.8 μl、B4引物 0.8 μl、探針0.4 μl、超純水0.4 μl；反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s， 60℃ 15 s，72℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)。使用的探針序列：BP6FAM-ATCGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTATBHQ-1；使用的引物序列為BF-GTCGCATCTTTGGA- TTTAACAA；B4-ACTGGGATCCGACTGACAAC。定量后的OsHV-病毒懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物序列

Tab.1 Sequences of primers used in this study

1.2.5 OsHV-1感染魁蚶實(shí)驗(yàn) 從實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)的魁蚶中選取80只，隨機(jī)分為4組：(16±2)℃高溫陰性組與高溫陽(yáng)性組，(10±2)℃低溫陰性組與低溫陽(yáng)性組，每組分別為20只。高溫陽(yáng)性組和低溫陽(yáng)性組通過(guò)腹足注射的方式每只魁蚶注射100 μl濃度約為105copies/μl的病毒懸液。高溫陰性組和低溫陰性組則注射100 μl健康魁蚶組織懸液。注射完成后，將魁蚶靜置10 min，隨后放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)。分別在注射后的0、6、12、24、48和72 h進(jìn)行組織樣品采集。隨機(jī)從各組中選取3只魁蚶，采集血淋巴樣品：用一次性注射器采集魁蚶血液，混勻后分裝到1.5 ml EP管中，每管1 ml，4℃800 g離心5 min后，除去血清，并加入800 μl Trizol (TaKaRa)，混勻后?80℃保存。

1.2.6 魁蚶感染OsHV-1病毒后的表達(dá)研究 按照Trizol法提取血細(xì)胞總RNA，對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)后，以總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMcDNA Synthesis Kit, TaKaRa)合成模板，操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。以魁蚶RL15作為內(nèi)參基因(Xin, 2018)，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)定量引物(表2)，對(duì)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。檢測(cè)使用Universal qPCR Master Mix試劑盒(NEB)，反應(yīng)體系(20 μl)：SYBR?Premix ExⅡ10 μl、前引物1 μl、后引物1 μl、模板2 μl、超純水6 μl；反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)均實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2?ΔΔCt方法對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，利用SPSS 20.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

表2基因定量引物

Tab.2 Quantitative primers of Ets genes

2 結(jié)果與分析

2.1 魁蚶Ets家族基因的cDNA開放閱讀框(ORF)的克隆

從本課題組魁蚶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的9條序列片段，成功克隆獲得9條基因的完整的ORF序列，從到對(duì)其進(jìn)行分別命名。這9條基因的開放閱讀框(ORF)大小分別為1065、1290、1569、912、1344、1404、1521、1968和1191 bp，并分別編碼354、429、522、303、447、468、506、655和396個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 魁蚶Ets家族基因克隆

M：Marker；1~9：~

2.2 Ets家族進(jìn)化樹分析

通過(guò)NCBI在線獲取其他物種Ets蛋白序列并與獲得的魁蚶Ets家族基因進(jìn)行多序列比對(duì)，利用Mega 7.0軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，魁蚶Ets高度保守，與蝦夷扇貝()的轉(zhuǎn)錄因子(OWF55447.1)進(jìn)化關(guān)系較近，與丘疹旋毛蟲的轉(zhuǎn)錄因子(KRZ74488.1)關(guān)系較遠(yuǎn)；與蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄因子(XP_021347939.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄因子(XP_021366637.1)進(jìn)化關(guān)系較近，與卡羅萊納箱龜()的轉(zhuǎn)錄因子(XP_024065379.1)關(guān)系較遠(yuǎn)；與長(zhǎng)牡蠣()轉(zhuǎn)錄因子(XP_ 019928533.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與長(zhǎng)牡蠣的轉(zhuǎn)錄因子(XP_019917945.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄因子(XP_021352365.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄因子(XP_021360845.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與長(zhǎng)牡蠣的轉(zhuǎn)錄因子(EKC21903.1)進(jìn)化關(guān)系較近；與蝦夷扇貝的(XP_ 021365446.1)進(jìn)化關(guān)系較近(圖2)。

2.3 OsHV-1感染后的病毒拷貝數(shù)檢測(cè)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OsHV-1感染魁蚶后在不同時(shí)間段的病毒拷貝數(shù)的變化。結(jié)果顯示，在低溫陰性組和低溫陽(yáng)性組中，魁蚶均能夠正常生長(zhǎng)，OsHV-1拷貝數(shù)變化均在0~100 copies/ng范圍內(nèi)，屬于本底水平，病毒沒有增殖；在高溫組中，高溫陰性組正常生長(zhǎng)，OsHV-1拷貝數(shù)變化在0~100 copies/ng范圍內(nèi)，屬于本底水平，病毒沒有增殖，但在高溫陽(yáng)性組中，病毒拷貝數(shù)隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒拷貝逐步上升，在0~6 h，病毒拷貝數(shù)處于本底水平，在6~ 12 h，病毒拷貝數(shù)增長(zhǎng)至1.0×103copies/ng，在12~24 h，拷貝數(shù)增長(zhǎng)至約6.0×104copies/ng，在24~48 h，病毒拷貝數(shù)呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)，約為3.4×106copies/ng，并持續(xù)增長(zhǎng)，在72 h，病毒拷貝數(shù)達(dá)到最大值(7.4× 106copies/ng)，此時(shí)魁蚶均已死亡(圖6)。

2.4 魁蚶感染OsHV-1病毒后Ets基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)OsHV-1感染魁蚶后基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況分析。結(jié)果顯示，在高溫陽(yáng)性組中，和的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)，其中，在12、24、48和72 h分別比高溫陰性組上調(diào)3.9、2.8、7.4和15.6倍；低溫陰性組與低溫陽(yáng)性組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異；低溫陰性組與高溫陰性組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖7A)。在高溫陽(yáng)性組中，在48 h后相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，48和72 h分別比高溫陰性組上調(diào)3.0和22.6倍；低溫陰性組、低溫陽(yáng)性組和高溫陰性組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖7C)。在低溫陽(yáng)性組中，和相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)，其中，在24、48和72 h分別比低溫陰性組上調(diào)4.3、7.0和8.2倍；高溫陽(yáng)性組、高溫陰性組和低溫陰性組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異 (圖7D)。在低溫陽(yáng)性組24和48 h分別比低溫陰性組上調(diào)2.4和1.8倍；高溫陽(yáng)性組、高溫陰性組和低溫陰性組相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖7H)。其余5條轉(zhuǎn)錄因子(、、、、)相對(duì)表達(dá)量變化無(wú)明顯規(guī)律(圖7B、圖7E、 圖7F、圖7G、圖7I)。

圖2 基于NJ法構(gòu)建的魁蚶Ets氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 ETS-1堿基和氨基酸序列

紅色下劃線表示ETS結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；黑色下劃線表示BLLF1 superfamliy結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

The red underlined indicates the amino acid sequence of the ETS domain; the black underlined indicates the amino acid sequence of the BLLF1 superfamliy domain

圖4 ETS-3堿基和氨基酸序列

紅色下劃線表示ETS結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；黑色下劃線表示SAM superfamliy結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

The red underlined indicates the amino acid sequence of the ETS domain; the black underline indicates the SAM amino acid sequence of the superfamliy domain

圖5 Ets蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)

2.5 ETS-1和ETS-3生物信息學(xué)分析

對(duì)和進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，和除了含有ETS結(jié)構(gòu)域外，還含有BLLF1 superfamliy結(jié)構(gòu)域(圖3)，而還含有SAM superfamliy結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(圖4)，通過(guò)I-TASSER對(duì)、3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，的結(jié)構(gòu)主要由4條α-螺旋環(huán)繞成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，ETS結(jié)構(gòu)域是保守的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”結(jié)構(gòu)，無(wú)酶催化位點(diǎn)；的結(jié)構(gòu)主要是由11個(gè)α-螺旋構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，ETS結(jié)構(gòu)域是保守的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”結(jié)構(gòu)，并且具有酶催化位點(diǎn)(圖5)。

3 討論

Ets轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)顯著特征是均含有1個(gè)約85個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)化保守的ETS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)Ets蛋白與富含嘌呤的序列為GGAA/T和額外的側(cè)翼核苷酸DNA序列發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Graves, 1998)。本研究對(duì)魁蚶家族基因進(jìn)行了克隆鑒定，共獲得了9個(gè)家族成員分子，生物信息學(xué)分析表明，其基因結(jié)構(gòu)域高度保守。

Ets家族蛋白是MAPK信號(hào)通路下游級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的執(zhí)行者(Oikawa, 2003; Wang, 2017; Wasylyk, 1998)。在高等生物中，Ets轉(zhuǎn)錄因子不僅參與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化等生理過(guò)程(Sharrocks, 2001)，還可參與病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程(Panagoulias,2017)，例如，Ets家族蛋白可參與調(diào)控HIV-1病毒復(fù)制過(guò)程(Seth, 1993)；人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)域?qū)IV復(fù)制至關(guān)重要，其包含相鄰的E-box和Ets 2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。Sieweke等(1998)發(fā)現(xiàn)，Ets-1與USF-1(Upstream stimulatory factor)蛋白相互作用，并分別與HIV-1病毒的E-box和Ets結(jié)合位點(diǎn)(?130~ ?166)結(jié)合，激活病毒復(fù)制。Ets在貝類中的功能有待研究(Ma, 2009)。OsHV-1是目前貝類中流行的主要病毒性病原，頻繁造成全球范圍內(nèi)養(yǎng)殖貝類的大規(guī)模死亡。前期分析OsHV-1基因組序列時(shí)，鑒定出諸多Ets轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，初步推斷魁蚶Ets轉(zhuǎn)錄因子可能參與病毒的復(fù)制調(diào)控?？涝诟邷丨h(huán)境中感染OsHV-1后，和相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，與病毒的拷貝數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)呈正相關(guān)?？涝诘蜏丨h(huán)境中感染OsHV-1后，病毒拷貝數(shù)不增加，和的相對(duì)表達(dá)量處于本底水平狀態(tài)。以上結(jié)果表明，和與病毒的復(fù)制密切相關(guān)，可能參與了病毒的復(fù)制調(diào)控過(guò)程。但它們是通過(guò)何種機(jī)制參與的、在病毒復(fù)制過(guò)程中是否起主導(dǎo)作用仍需要進(jìn)一步研究。

圖6 OsHV-1感染后魁蚶血液中病毒拷貝數(shù)變化

圖7 OsHV-1感染后魁蚶血細(xì)胞Ets表達(dá)水平

*表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異顯著(<0.05)

*indicated the difference between experiment and control group was statistically significant (<0.05)

本研究成功克隆出魁蚶9個(gè)Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員。通過(guò)OsHV-1人工感染魁蚶后對(duì)9個(gè)家族成員基因表達(dá)模式分析，初步確定了和參與病毒的復(fù)制調(diào)控。為深入研究魁蚶在夏季感染OsHV-1后暴發(fā)大規(guī)模死亡提供了一定的理論數(shù)據(jù)。

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Cloning of Nine Genes in the Ets Family of Ark Clam () and Their Expression in Response to Oyster Herpes Virus (OsHV-1) Infection

WEI Zhixin1,3, XIN Lusheng2,3, BAI Changming2,3, LI Yanan3, ZHANG Shumin3, LI Chenghua1, WANG Chongming2,3①

(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

Ets transcription-factor networks represent a model for how combinatorial gene expression is achieved. The characteristic feature of Ets factors is the conserved ETS domain (Helix-Turn-Helix). Thus, the Ets proteins bind to a core GGAA/T consensus sequence and regulate expression of several genes and play an important role in various cellular functions (mitosis, growth, development, differentiation, and apoptosis) and the regulation of immunity. In this experiment, 9genes (named, respectively) of the Ark clam () were successfully obtained by gene cloning technology, and the open reading frames (ORFs) were 1065 bp, 1290 bp, 1569 bp, 912 bp, 1344 bp, 1404 bp, 1521 bp, 1968 bp, and 1191 bp, respectively. Moreover, they encoded respectively 354, 429, 522, 303, 447, 468, 506, 655, and 396 amino acids. Evolutionary relationships of taxa showed that all genes in this chapter belonged to thefamily genes. The qPCR detection showed that the expression of twogenes (,) was significantly increased. Thus, the present study showed that the Ark clamandare involved in the replication process of the OsHV-1 under high temperature conditions (16±2)℃. In conclusion, the results of this study provide a scientific basis for further study concerning the large number of deaths of Ark clams due to infection with OsHV-1 in summer.

; Ets family; OsHV-1; Gene cloning; Temperature

S917.4

A

2095-9869(2019)06-0121-10

10.19663/j.issn2095-9869.20190304001

http://www.yykxjz.cn/

魏智薪, 辛魯生, 白昌明, 李亞楠, 張淑敏, 李成華, 王崇明. 魁蚶Ets家族9個(gè)基因的克隆及其在病毒感染應(yīng)答中的表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(6): 121–130

Wei ZX, Xin LS, Bai CM, Li YN, Zhang SM, Li CH, Wang CM. Cloning of nine genes in the Ets family of ark clam () and their expression in response to oyster herpes virus (OsHV-1) infection. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(6): 121–130

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系專項(xiàng)資金(CARS-49)、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022017007; 20603022018014)共同資助[This work was supported by China Aquaculture Research System (CARS-49), and Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute (20603022017007; 20603022018014)]. 魏智薪，E-mail: weizhixin315@yeah.net

王崇明，研究員，E-mail: wangcm@ysfri.ac.cn

2019-03-04,

2019-03-11

WANG Chongming, E-mail: wangcm@ysfri.ac.cn

(編輯 馬璀艷)