飼用溶菌酶對吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響*

王 壇 趙金鑫 劉東來 孔 純 華雪銘,2,3 吳 釗 王 剛 馮 悅,2,3 楊景豐,2,3 劉 韜,2,3

飼用溶菌酶對吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響*

王 壇1,4趙金鑫4劉東來5孔 純1華雪銘1,2,3①吳 釗1王 剛1馮 悅1,2,3楊景豐1,2,3劉 韜1,2,3

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室 上海 201306；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心 上海 201306；4. 廣東海大集團股份有限公司 廣州 511400；5. 安徽省巢湖市中旱鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心水產(chǎn)站 巢湖 238054)

為了解飼用溶菌酶對吉富羅非魚()消化道組織結(jié)構(gòu)發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)利用的影響，本研究設(shè)計5種飼料溶菌酶添加水平：18 mg/kg (L18)、36 mg/kg (L36)、54 mg/kg (L54)、72 mg/kg (L72)和90 mg/kg (L90)，以不添加溶菌酶的飼料(L0)為對照，進行為期60 d的飼養(yǎng)。結(jié)果顯示，飼料中添加溶菌酶對吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活性產(chǎn)生了不同程度的影響。L36、L54和L72組的胃、前腸和中腸蛋白酶活性顯著高于對照組(<0.05)，肝臟、前腸脂肪酶活性在L54和L72組均顯著高于對照組(<0.05)，淀粉酶活性在除前腸、中腸外的L72和L90組顯著高于對照組(<0.05)。L36、L54和L72組魚的腸道不同部位腸絨毛密度、高度和寬度較對照組顯著提高，在肌層厚度上，溶菌酶添加組在前腸和后腸部位有下降趨勢，L18、L36和L90組顯著低于對照組(<0.05)，而在中腸部位，肌層厚度隨添加水平升高而呈先升后降的變化趨勢，L36、L54和L72組在數(shù)值上高于對照組，但無顯著性差異(>0.05)；杯狀細胞數(shù)量在L54和L72組均顯著高于對照組(<0.05)。肝臟切片圖顯示，L36和L54組肝細胞排列整齊、形狀飽滿，相較于對照組更致密，但高劑量添加組的肝臟健康程度有下降趨勢。消化吸收率方面，在飼養(yǎng)Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組對粗蛋白的表觀消化率顯著高于對照組，到飼養(yǎng)Ⅲ期和Ⅳ期，L36~L90組對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均有顯著提高(<0.05)。研究表明，在本實驗條件下，36、54 mg/kg溶菌酶添加水平具有最穩(wěn)定的作用效果，吉富羅非魚通過肝腸發(fā)育和消化酶活性的提高來促進對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收。

吉富羅非魚；溶菌酶；消化吸收率；消化酶；肝腸組織形態(tài)

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由細菌、病毒引起的水產(chǎn)動物病害也日益凸顯，持續(xù)制約著養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)效益的提高。抗生素雖是解決這一問題的有效方法，但藥物殘留、機體耐藥性、環(huán)境污染等弊端以及對人類健康構(gòu)成的潛在威脅，顯然已不能在養(yǎng)殖生產(chǎn)實際中首選使用。溶菌酶是一類具有天然抗菌活性的蛋白多肽類物質(zhì)，對包括細菌、真菌等在內(nèi)的病原微生物具有廣譜抑菌作用，已作為一種新型綠色的飼用酶制劑而應(yīng)用于動物生產(chǎn)中。在畜禽動物上的研究發(fā)現(xiàn)(王軍等, 2013; 張世卿等, 2008; 顧維智等, 2008; 王曉可等, 2008)，日糧中添加溶菌酶對家畜家禽有不同程度的促生長以及提高飼料利用率和自身抗病力的作用，可以完全或部分替代抗生素，但由于水產(chǎn)動物特殊的生活環(huán)境和生理生化特點，加之溶菌酶活性易受水產(chǎn)飼料加工等因素的影響，飼用溶菌酶在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用研究還較少，且作用效果仍存在一定程度的差異(邢思華等, 2013; Chen, 2014)。研究表明，溶菌酶不僅是一種有活性的免疫調(diào)節(jié)因子，同時又是一種主要的消化酶，與動物的消化系統(tǒng)密切相關(guān)(Nilsen, 1999)。此外，飼料中外源性酶制劑的添加能改變魚類內(nèi)源消化酶的活性，進而對其消化能力產(chǎn)生影響(張璐等, 2007; 黎軍勝等, 2006; 葉元土等, 1993)。雖然魚的不同種類、不同食性和消化道結(jié)構(gòu)及不同生長期和養(yǎng)殖環(huán)境均與機體的消化功能存在一定關(guān)系，但對于溶菌酶是否與其他酶制劑一樣影響?zhàn)B殖魚類營養(yǎng)物質(zhì)消化利用和消化機能，尚未見報道。

吉富羅非魚()是經(jīng)遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚。該品系羅非魚因其生長速度快、出肉率高、肌肉必需氨基酸種類齊全且含量豐富，是一種經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值均較高的魚類，在我國南方有廣泛的養(yǎng)殖。然而，在實際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，該魚攝食量大而雜，尤其在集約化養(yǎng)殖模式中，更易聚積過多殘餌和糞便，對魚的消化機能和組織健康造成威脅。為此，本研究在吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的溶菌酶制品，通過比較各組魚對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力、消化酶活性及消化道器官發(fā)育和健康程度三方面來綜合評估飼用溶菌酶對吉富羅非魚營養(yǎng)物質(zhì)消化和消化道組織健康的影響，以期為溶菌酶在以羅非魚為代表的雜食性有胃魚類健康養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計與飼料

根據(jù)吉富羅非魚的營養(yǎng)需求(NRC, 2011)，以魚粉、豆粕、花生粕和菜籽粕為主要蛋白源，以魚油和豆油為主要脂肪源，配制成粗蛋白、粗脂肪和總能水平分別為35.41%、5.77%和22.87 kJ/g的基礎(chǔ)飼料，在此基礎(chǔ)上，分別添加18、36、54、72和90 mg/kg，即9×104、1.8×105、2.7×105、3.6×105和4.5×105U/kg的溶菌酶制品(上海沈李科工貿(mào)公司；初始酶活性5×103U/mg)，分別記為L0(對照組)、L18、L36、L54、L72和L90。飼料原料粉碎過40目篩，微量成分采用逐級擴大的方法添加，與大宗原料混合均勻后用制粒機(SLP-45, 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所)制成粒徑為2.0 mm的硬顆粒飼料，制粒溫度控制在(75±5)℃。自然風(fēng)干后于-20℃冰箱冷藏備用。實驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(%, 風(fēng)干基礎(chǔ))

Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet for GIFT tilapia (%, air-dry basis)

注: 1) 維生素預(yù)混料為每千克飼料提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet: 硫胺素thiamine 20.00 mg, 核黃素 riboflavin 20.00 mg, 吡哆醛 pyridoxine 10.00 mg, 尼克酸 nicotinic acid 10.00 mg, 泛酸鈣 calcium pantothenate 50.00 mg, 生物素 biotin 1.0 mg, 葉酸 folic acid 5.0 mg, 肌醇 inositol 500 mg, VC100 mg, VE50 mg, VA2 mg, VB120.02 mg, VK310 mg, VD30.05 mg

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供Mineral premix provided the following per kg of the diet: ZnSO4·7H2O 525.5 mg, MnSO4·H2O 49.2 mg, KI 5.23 mg, FeSO4·7H2O 238.8 mg, MgSO4·7H2O 4.62 g, CuSO4·5H2O 11.8 mg, CoCl2·6H2O 0.2 mg, Na2SeO40.66 mg, KCl 600 mg, NaCl 107.1 mg

1.2 實驗用魚與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)實驗在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進行。選用規(guī)格一致、平均體重為(11.35±0.08)g的吉富羅非魚960尾，隨機分配于24個等大尼龍網(wǎng)箱中(分為6組, 每組4個重復(fù))，每網(wǎng)箱40尾。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，5個實驗組分別對應(yīng)飼喂L18~L90組的實驗飼料。實驗用魚飼養(yǎng)于室外水泥池中的24口等大尼龍網(wǎng)箱(1.2 m×1.8 m×1.2 m)中，水源為天然河水。用基礎(chǔ)飼料馴化7 d，待其攝食正常后開始正式實驗。日投喂采取定量投喂方式，每天定點投喂3次(08:00、12:00和17:00)，日投餌率為魚體重的3%~8%，根據(jù)生長階段、天氣、攝食狀況調(diào)整投喂量。實驗期間24 h充氣，定期換水，水溫為26~34℃，溶氧>5 mg/L，氨氮含量<0.3 mg/L，養(yǎng)殖周期為60 d。

1.3 消化實驗

實驗期間，按照基礎(chǔ)飼料配方以0.5%的Cr2O3作為指示劑進行不同時期的消化率實驗，實驗前預(yù)飼7 d。每天08:00投料30 min后收集糞便，取具包膜、結(jié)構(gòu)完整者風(fēng)干后65℃恒溫烘干，保存于干燥器中，連續(xù)收集4次(1~15 d/Ⅰ期; 16~30 d/Ⅱ期; 31~45 d/Ⅲ期; 46~60 d/Ⅳ期)。每網(wǎng)箱每一階段的魚糞混合均勻后稱重，作為分析樣品。測定實驗飼料和糞便樣品中的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和Cr2O3含量，以計算飼料常規(guī)營養(yǎng)成分的表觀消化率(Apparent digestibility coefficients,ADCs)。其中，水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法測定；粗蛋白含量采用凱氏定氮法(總氮×6.25)測定；粗脂肪含量采用氯仿–甲醇提取法測定；Cr2O3用高氯酸–硝酸濕式灰化后進行定量測定。

飼料營養(yǎng)物質(zhì)(干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪)ADCs的計算方法如下所述：

ADC(%)=100×[1–(×cr)/(×cr)]；

式中，為糞便中的營養(yǎng)物質(zhì)含量；為飼料中營養(yǎng)物質(zhì)含量；cr為飼料中Cr2O3的含量；cr為糞便中Cr2O3的含量。

1.4 肝臟和胃腸道消化酶測定

飼養(yǎng)實驗結(jié)束后，禁食24 h，用丁香酚溶液麻醉，解剖取樣。每網(wǎng)箱取6尾魚的肝臟和胃腸道組織，并根據(jù)Cataldi等(1987)和Garcia等(2001)的方法分離出前、中、后腸，各部分組織用0.86%的預(yù)冷魚用生理鹽水洗去內(nèi)容物，裝袋保存于–20℃冰箱。檢測前，將肝臟或胃腸道組織在4℃冰箱解凍，按照質(zhì)量∶體積=1 : 9的比例用上述生理鹽水勻漿，然后4℃、4000 r/min離心10 min，取上清液并稀釋不同倍數(shù)后進行消化酶比活力的測定，并于24 h內(nèi)測完。其中，蛋白酶和淀粉酶比活力測定部位是肝臟、胃和前、中、后腸，脂肪酶僅測定其生理性發(fā)生和存量最多的肝臟和前腸部位。蛋白酶活力采用福林酚法測定，酶活力定義：每毫克蛋白40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位(U/mg prot) (施兆鴻等, 2016)。其中，胃蛋白酶在pH=2.4的酸性介質(zhì)條件下測定，腸道和肝臟蛋白酶在pH=7.5中性介質(zhì)條件下測定(劉愛君等, 2009)。淀粉酶(AMS)活力采用碘-淀粉比色法測定，酶活力定義(施兆鴻等, 2016)：每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位(U/mg prot)。

脂肪酶(LPS)活力使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，酶活力定義：37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol的底物為1個酶活力單位(U/g prot) (施兆鴻等, 2016)，以下檢測結(jié)果中統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為(U/mg prot)。

組織樣本中總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。

上述組織淀粉酶、脂肪酶和總蛋白含量均使用南京建成生物工程研究所提供的專業(yè)試劑盒進行測定，檢測方法和酶活力定義均按照說明書進行。

1.5 肝臟和腸道組織切片觀察

飼養(yǎng)實驗結(jié)束時，每網(wǎng)箱隨機取2尾魚，取約1 cm3肝臟和2~3 cm的前、中、后腸組織塊(根據(jù)1.4方法劃分腸道，并在各腸段和肝臟的中間處取材)，用0.86%魚用生理鹽水輕輕沖洗，濾干水分后，用Bouin氏液固定，24 h后，轉(zhuǎn)移至70%酒精中用于石蠟切片的制作。切片制作過程中，組織樣本經(jīng)過常規(guī)系列梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(5 μm)和H&E染色后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍攝并測量腸絨毛高度(HF)、寬度(HW)、密度(HD)和肌層厚度(tML)，統(tǒng)計杯狀細胞數(shù)量(dGC)，每個樣本取5張染色結(jié)果較好的切片進行拍照。其中，HF和HW均選取一個腸道橫截面中的5根最高絨毛為測量對象；HD是以一個腸道橫截面的全部絨毛數(shù)量為測量值；dGC為橫切面上5根最高腸絨毛上皮層中的杯狀細胞數(shù)目；tML為橫切面上表征整個腸壁肌肉層的最大厚度(李志剛等, 2007; 黃玉章等, 2010; 于朝磊等, 2014)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用SPSS 17.0分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若影響顯著，則采用Duncan氏法進行多重比較，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼用溶菌酶對不同飼養(yǎng)時期吉富羅非魚飼料營養(yǎng)成分表觀消化率的影響

經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，各添加組魚在不同生長期對飼料營養(yǎng)成分的表觀消化率見表2。在飼養(yǎng)Ⅰ期，各組魚對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表現(xiàn)消化率分別為60.48%~69.03%、82.38%~87.62%和70.71%~76.20%，其中，L36和L54組魚對干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率顯著高于對照組(<0.05)，在L54組達到最大值。各溶菌酶添加組魚對粗脂肪的表觀消化率均顯著低于對照組(<0.05)，L72組最低；在飼養(yǎng)Ⅱ期，各組魚對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率分別為69.24%~74.30%、88.04%~92.00%和80.82%~88.24%，隨溶菌酶添加量的增加，實驗魚對粗蛋白的表觀消化率整體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，L54~L90組顯著高于對照組，此時3組魚對干物質(zhì)、粗脂肪的表觀消化率存在顯著下降(<0.05)；在飼養(yǎng)Ⅲ期，各組魚對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率為63.32%~ 71.67%、84.32%~88.79%和81.44%~88.58%，L36~L90組的干物質(zhì)、粗蛋白表觀消化率均顯著高于對照組，且L90組顯著高于其他各組(<0.05)，同時，粗脂肪表觀消化率在組間也整體呈現(xiàn)上升趨勢，顯著高于對照組(<0.05)；在飼養(yǎng)Ⅳ期，各組魚對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率分別為59.25%~66.06%、79.63%~87.46%和64.78%~75.09%，除L54組外，其他各溶菌酶添加組魚對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率均顯著高于對照組(<0.05)，在L90組呈現(xiàn)最大值。

2.2 飼用溶菌酶對消化酶活力的影響

由表3可見，飼用溶菌酶對吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活力產(chǎn)生了不同程度的影響。與對照組相比，溶菌酶的添加對羅非魚胃、前腸和中腸蛋白酶活力具有顯著促進作用，在L36、L54和L72組呈現(xiàn)最大值(<0.05)，后腸蛋白酶活力在組間無顯著性差異(>0.05)；淀粉酶方面，在高劑量添加劑組(L72和L90)的肝臟、胃和后腸部位顯著高于對照組(<0.05)，前腸中L54組顯著高于對照組，但在L72和L90組顯著低于對照組(<0.05)，中腸部位在除L72組外的其余添加組均顯著高于對照組(<0.05)；脂肪酶方面，L54和L72組在肝臟和前腸部位的酶活力顯著高于對照組和其他各添加組(<0.05)。

2.3 肝臟組織結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)過60 d養(yǎng)殖實驗后，各組魚肝臟組織切片結(jié)果見圖1A~F。對照組和L18組魚出現(xiàn)較多的肝細胞核偏移和個別細胞核消失現(xiàn)象(圖1箭頭所示)；L36和L54組魚肝細胞排列整齊，形狀飽滿，相較于L0和L18組更致密，大小均一；高劑量添加組(L72和L90)魚肝細胞排列相對稀疏，出現(xiàn)較多的核消失、移和濃縮現(xiàn)象，L90組伴有纖維化趨勢(圖1箭頭所示)。

表2 飼用溶菌酶對吉富羅非魚不同飼養(yǎng)時期營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響(%)

Tab.2 Effects of dietary lysozyme supplementation on apparent digestibility coefficients (ADCs) of GIFT tilapia at different feeding stages (%)

注: 不同上標字母表示顯著性差異。下同

Note: Different superscript letters represent significant difference. The same as below

表3 飼用溶菌酶對吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活力的影響(U/mg prot)

Tab.3 Effects of dietary lysozyme supplementation on digestive enzyme activities of GIFT tilapia in the liver and gastrointestine (U/mg prot)

圖1 飼用溶菌酶對吉富羅非魚肝臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×400)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組 C: 細胞質(zhì); N: 細胞核; NM: 核偏移; ND: 核消失; NE: 核濃縮; FT: 纖維化

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group C: Cytoplasm, N: Cell nucleus, NM: Nuclear migration, ND: Nuclear disappear, NE: Nuclear enrichment; FT: Fibrillation

2.4 腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4.1 形態(tài)學(xué)指標 由表4可見，經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，不同溶菌酶添加水平對吉富羅非魚的腸道各部位形態(tài)學(xué)指標也產(chǎn)生了不同程度的影響。絨毛密度上，溶菌酶添加組較對照組要明顯增多(L18組除外，< 0.05)，但高劑量添加下(L90)存在顯著或數(shù)值上的下降趨勢。絨毛高度和寬度方面，L54和L72組在前腸和中腸部位均顯著高于對照組，后腸絨毛高度在L54和L90組較高，且各溶菌酶添加組的后腸絨毛寬度較對照組均顯著增加(<0.05)；在肌層厚度上，溶菌酶添加組在前腸和后腸部位有下降趨勢，L18、L36和L90顯著低于對照組(<0.05)，而在中腸部位，肌層厚度隨添加水平升高而呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，L36~L72組在數(shù)值上高于對照組，但無顯著性差異(>0.05)。

表4 飼用溶菌酶對吉富羅非魚腸道形態(tài)學(xué)指標的影響(μm)

Tab.4 Effects of dietary lysozyme supplementation on intestinal morphology of GIFT tilapia (μm)

2.4.2 腸道不同部位形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察 圖2~圖4顯示了養(yǎng)殖60 d各組吉富羅非魚腸道不同部位的石蠟切片結(jié)構(gòu)。在顯微鏡下觀察，各組羅非魚腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)都較為完整、層次分明，腸黏膜上皮細胞密集且排列規(guī)則，高倍鏡下輪廓清晰，染色鮮明。但從發(fā)育程度上看，溶菌酶添加組魚的腸道各段較對照組有明顯優(yōu)勢。如圖2所示，對照組的前腸絨毛相對稀疏，質(zhì)地松軟，且絨毛高度較短，而L54~L90組魚的前腸絨毛明顯變得緊實高壯，與表4的測量結(jié)果相吻合。如圖3所示，與對照組相比，L36~L72組魚的中腸絨毛密度、高度和寬度有所增加，且絨毛排列整齊，但高劑量添加水平下(L90)的中腸絨毛發(fā)育出現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)為絨毛變短、稀疏松弛，且肌層厚度變薄。如圖4所示，對照組的后腸絨毛有脫落現(xiàn)象，但肌層厚度仍較大，L36~L72組魚后腸絨毛密度有所增加，L54和L90組后腸絨毛高度也有增加趨勢。此外，添加溶菌酶也明顯提高了后腸絨毛寬度，這些均與表4的測量結(jié)果基本吻合。

2.5 腸粘膜杯狀細胞的變化情況

從表5可以看出，L54和L72組魚前腸腸黏膜上皮杯狀細胞數(shù)量顯著高于其他各組(<0.05)；且與對照組相比，L36~L72組魚的中腸和后腸腸黏膜上皮杯狀細胞數(shù)量也有顯著增加(<0.05)。

3 討論

3.1 飼用溶菌酶對吉富羅非魚肝腸組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響

早在Marshall(1998)提出的“腸-肝軸”理論中就已認為，腸道和肝臟并不是2個完全獨立的器官，它們在功能上存在著廣泛的聯(lián)系。魚體生理性的“腸–肝軸”中，膽汁酸的“腸-肝循環(huán)”是其重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，構(gòu)造了二者之間天然的功能聯(lián)系(Cortes, 2013)。在水生動物上常用腸道絨毛高度、絨毛密度以及杯狀細胞的數(shù)量等組織形態(tài)學(xué)指標來反映魚類腸道的發(fā)育和健康程度，并以此評估魚類腸道的消化吸收能力(聶國興等, 2007; Farhangi, 2001)。同時，肝臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和健康程度對于其本身消化功能和整個“腸–肝軸”系的正常運轉(zhuǎn)也起到不可忽視的作用。本研究結(jié)果顯示，L36、L54和L72組魚在攝食含有溶菌酶飼料60 d后的腸道不同部位腸絨毛密度、高度和寬度長勢較對照組顯著提高，說明適量溶菌酶的添加可以促進吉富羅非魚腸道的生長發(fā)育，這可能與溶菌酶進入魚體后發(fā)揮的調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡有關(guān)。對異育銀鯽()的研究表明，適量添加溶菌酶能夠促進有益菌的增殖，同時，對諸如葡萄球菌科等有害菌群有抑制作用，這種對微生物結(jié)構(gòu)的正面調(diào)節(jié)作用能夠降低腸道維持，從而促進腸絨毛發(fā)育(Chen, 2014)。然而，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加溶菌酶并沒有提高吉富羅非魚前腸、后腸的肌層厚度，甚至有下降趨勢，這可能與機體在確保腸道健康的前提下，減少腸道維持需求、促進動物生長有關(guān)。此外，溶菌酶的過量添加則可能破壞腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)，使得機體腸絨毛發(fā)育減弱，此結(jié)論也在本研究有所體現(xiàn)。

圖2 飼用溶菌酶對吉富羅非魚前腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

HF: 絨毛高度; HW: 絨毛寬度; tML: 肌層厚度; GC: 杯狀細胞

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

HF: Height of fold; HW: Width of fold; tML: Thickness of muscular layer; GC: Goblet cells

圖3 飼用溶菌酶對吉富羅非魚中腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

圖4 飼用溶菌酶對吉富羅非魚后腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

表5 各組魚腸粘膜杯狀細胞的數(shù)量變化(個)

Tab.5 Quantity changes of intestine goblet cells of GIFT tilapia in different groups (ind.)

本研究結(jié)果還顯示，L36、L54和L72組魚腸黏膜上皮層中的杯狀細胞數(shù)量也有顯著提高，這進一步促進了吉富羅非魚腸道健康水平，相似結(jié)論在異育銀鯽(Chen,2014)、斷奶仔豬(Cooper, 2011)中已有報道，同時與溶菌酶具有類似功能的抗菌肽在無菌雞(Wang, 2009)日糧中作用效果一致。其內(nèi)在機制可能在于溶菌酶的添加有利于魚腸上皮杯狀細胞發(fā)生，從而更多產(chǎn)生黏蛋白，于腸上皮形成致密粘液層，更好地保護腸上皮組織抵御外來有害微生物的侵犯，降低腸道疾病發(fā)生。關(guān)于溶菌酶能夠促進腸上皮細胞增殖分化和加快組織修復(fù)的功能已在小鼠(林成招等, 2005; 劉晉峰, 2007)和兔(梁彥, 2012)等畜禽動物上有過報道，而和溶菌酶具有類似功能的抗菌肽也在斷奶仔豬腸道損傷修復(fù)方面起到了相似的作用(Tang, 2013)。

結(jié)合肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，L36和L54組魚的肝臟組織細胞更加飽滿，較對照組和L18組，細胞核偏移和濃縮的現(xiàn)象減少，從而能在總體水平上提高肝臟的健康程度；然而，高劑量添加水平組并沒有顯示出這種優(yōu)勢，這種和腸道相似的變化結(jié)果很可能與“腸–肝軸”系的連帶運轉(zhuǎn)機制有關(guān)，關(guān)于溶菌酶在此方面的研究機制需要進一步論證。

3.2 飼用溶菌酶對吉富羅非魚消化酶活力的影響

一般來說，進入腸道的食物會受到腸道運動帶來的機械性消化作用，同時，也會接觸消化酶而進行化學(xué)性消化。消化酶活性的高低是評價養(yǎng)殖魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化能力的重要指標(劉襄河等, 2013)。邢思華等(2013)研究表明，在一定范圍內(nèi)添加溶菌酶能夠顯著提高草魚()肝胰臟的蛋白酶活性，但對腸道蛋白酶和淀粉酶活性沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，隨飼料溶菌酶添加水平的提高，吉富羅非魚胃、前腸和中腸蛋白酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在L36、L54和L72組呈現(xiàn)最大值，對后腸蛋白酶活性無顯著影響，同時，L54和L72組的肝臟和前腸的脂肪酶活性也有顯著提高，而對于淀粉酶，則在高劑量添加組(L72和L90組)表現(xiàn)出較高的酶活性(前腸和中腸不明顯)，這說明飼用溶菌酶能夠在一定程度上刺激吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶的分泌，但存在添加劑量與所激發(fā)的消化酶種類不同的差異性變化。推測原因可能與溶菌酶作為蛋白酶類物質(zhì)進入魚體后的排異反應(yīng)、魚體不同部位的適應(yīng)機制、消化酶自身特性等均有關(guān)系(Yokooji, 2013)，其內(nèi)在機制有待進一步研究。另一方面，溶菌酶對魚體消化道微生態(tài)的積極調(diào)控，使得機體內(nèi)環(huán)境處于一個最佳生理狀態(tài)，更有利于消化酶活性的發(fā)揮。

涂永鋒等(2004)研究表明，魚類腸黏膜柱狀上皮層中散落的杯狀細胞不僅是一類黏液細胞，又是一種典型的分泌型細胞，是儲存和分泌消化酶的重要場所，因而，杯狀細胞數(shù)目的提高會增加魚體消化酶的分泌量。本研究發(fā)現(xiàn)，L36、L54和L72組魚腸黏膜上皮層中的杯狀細胞數(shù)量明顯高于其他組，這可能是這幾組魚消化酶分泌量提高的又一重要原因。

3.3 飼用溶菌酶對吉富羅非魚營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響

目前，關(guān)于溶菌酶對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率的研究多見于畜禽動物(張世卿等, 2008; 程時軍等, 2009; 丁亦男, 2012)，而在魚類上僅見于異育銀鯽(Chen, 2014)。這些研究表明，在飼糧中添加適量的溶菌酶能在一定程度上提高養(yǎng)殖動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，但作用不顯著。本研究通過跟蹤不同養(yǎng)殖周期內(nèi)吉富羅非魚對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率，發(fā)現(xiàn)在飼養(yǎng)Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組魚對粗蛋白的表觀消化率顯著高于對照組，而高劑量添加水平下會存在顯著降低趨勢。隨著飼養(yǎng)時間的增長，到達飼養(yǎng)Ⅲ期和Ⅳ期，高劑量添加組魚對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢，甚至在L90組出現(xiàn)最大值，推測原因可能在飼養(yǎng)前期階段，魚體對中劑量添加水平下的溶菌酶飼料具有更快的適應(yīng)反應(yīng)，高劑量水平下反而存在較大排異行為，因此，在飼養(yǎng)前期，這2組魚先滿足生長發(fā)育所需的蛋白質(zhì)營養(yǎng)，而到養(yǎng)殖中后期，魚體對高劑量添加水平的溶菌酶飼料逐漸適應(yīng)，且隨水溫降低，對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率均有顯著提升，這與魚體的自我適應(yīng)機制、攝食水平、生長發(fā)育和環(huán)境變化均有很大關(guān)系。

Nilsen等(1999)研究表明，溶菌酶作為一種蛋白多肽類物質(zhì)，其在機體內(nèi)也可以一種潛在“蛋白酶”的形式存在，從而發(fā)揮類似消化酶的作用。在養(yǎng)殖Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組魚的生理機能最優(yōu)，一方面通過刺激機體內(nèi)源性蛋白酶的分泌，另一方面在保證健康前提下，促使溶菌酶發(fā)揮抗菌、消化的雙重功能，使魚體消化機能進一步提升(張娟娟等,2012)。關(guān)于消化酶活力的增強和分泌量的增加對魚類消化吸收過程的促進作用已有大量報道(Das, 2014; Ray, 2012)，并在尼羅羅非魚() (Lara-Flores, 2003)、金頭鯛() (Suzer, 2008)、大西洋鮭()(S?rensen, 2011)等魚類上得到證實。另一方面，在該溶菌酶添加水平下，吉富羅非魚肝腸結(jié)構(gòu)的健康發(fā)育也促進了魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，相似結(jié)論已在肉雞、仔雞、斷奶仔豬等畜禽動物有過報道(程時軍等, 2009; Humphrey, 2002; Nyachoti, 2012)。

4 小結(jié)

本實驗條件下，添加36、54 mg/kg的飼用溶菌酶可以促進吉富羅非魚肝臟和腸道健康發(fā)育；添加水平在36~72 mg/kg范圍能夠激發(fā)吉富羅非魚胃、前腸、中腸蛋白酶及肝臟、前腸脂肪酶的分泌和活性提高；對于營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面，在飼養(yǎng)前期(Ⅰ期和Ⅱ期)，36、54 mg/kg添加水平主要促進了魚體對粗蛋白的消化吸收率；中后期(Ⅲ期和Ⅳ期)，36~90 mg/kg添加水平下，干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均有顯著提高。總體而言，36、54 mg/kg添加水平具有最穩(wěn)定的作用效果，其內(nèi)在機制與調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境微生態(tài)平衡、促進魚體肝腸結(jié)構(gòu)發(fā)育和消化酶的分泌以及內(nèi)、外源性酶之間的互作機制均有關(guān)系。

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Effects of Dietary Lysozyme on the Digestive Tract Structure and Nutrient Digestibility of GIFT Tilapia ()

WANG Tan1,4, ZHAO Jinxin4, LIU Donglai5, KONG Chun1, HUA Xueming1,2,3①, WU Zhao1, WANG Gang1, FENG Yue1,2,3, YANG Jingfeng1,2,3, LIU Tao1,2,3

(1. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition (CREEFN) of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 4.Guangdong Haid Group Co., Ltd, Guangzhou 511400; 5. Zhonghan Town Fishery Station of Agricultural Comprehensive Service Center of Chaohu Anhui Province, Chaohu 238054)

To investigate the effects of lysozyme as a green feed additive on the development of the digestive tract and digestive utilization of nutrients in GIFT tilapia, a 60-day feeding trial was conducted with graded levels of dietary lysozyme (0, 18, 36, 54, 72, and 90 mg/kg, marked as L0, L18, L36, L54, L72, and L90 respectively). The results were as follows: The fish had a different feedback response on the digestive enzyme activity in the liver and the gastrointestinal tract among groups; the protease activity in the stomach, and the anterior and middle intestine of L36~L72 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05); the lipase activity in the liver and the anterior intestine of the L54 and L72 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05); and the amylase activity in the digestive tracts (anterior and middle intestine excluded) of the L72 and L90 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05). The intestinal morphology showed that the values of villus density, villus height, and villus width of different intestinal parts in L36~L72 groups were higher than those of the control group, while the muscular thickness of the anterior and distal intestine was reduced in dietary lysozyme groups. The thickness of the middle intestines of the L18, L36, and L90 groups was significantly lower than that of the control group (<0.05), and there was a firstly increased and then decrease tendency. The thickness of the middle intestines of L36~L72 groups were all higher than the control group with no significant difference (>0.05). The goblet cell numbers were more in the L54 and L72 groups than in the control group (<0.05). The liver morphology showed that the liver cells were more voluptuous and denser in the L36 and L54 groups than in the control group, while worse health condition was found in the L90 group. With regards to apparent nutrient digestibility, the crude protein digestibility was significantly higher in the L36 and L540 groups than in the control group in periods I and Ⅱ (<0.05), and in periods Ⅲ and Ⅳ. The digestibility of dry matter, crude protein, and crude lipid were significantly higher in L36~L90 groups than in the control group (<0.05). The results above indicated that 36 and 54 mg/kg dietary lysozyme had the most stable efficacy, which could improve GIFT tilapia dry matter, crude protein, and crude lipid digestibility by promoting liver and intestine development and digestive enzyme activity.

GIFT tilapia; Lysozyme; Nutrient digestibility; Digestive enzyme; Digestive tract morphology

S963

A

2095-9869(2019)06-0076-12

10.19663/j.issn2095-9869.20180918001

http://www.yykxjz.cn/

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Wang T, Zhao JX, Liu DL, Kong C, Hua XM, Wu Z, Wang G, Feng Y, Yang JF, Liu T. Effects of dietary lysozyme on the digestive tract structure and nutrient digestibility of GIFT tilapia (). Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(6): 76–87

* 廣東省教育廳產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目(2012B091100372)資助[This work was supported by the Department of Education of Guangdong Province University-Industry Cooperation Project (2012B091100372)]. 王 壇，E-mail: wangtan0818@163.com

華雪銘，教授，E-mail: xmhua@shou.edu.cn

2018-09-18,

2018-10-21

HUA Xueming, E-mail: xmhua@shou.edu.cn

(編輯 馮小花)