樂山市金口河區(qū)板廠坪蜜環(huán)菌的分離及系統(tǒng)發(fā)育分析

陳克保 林宜錦 歐夢瑩

摘要 ? ?蜜環(huán)菌作為天麻重要共生菌，能為天麻的生長提供營養(yǎng)。了解區(qū)域性蜜環(huán)菌的多樣性有助于選育優(yōu)良的土著蜜環(huán)菌，進而提高區(qū)域性天麻的產(chǎn)量和質(zhì)量。本文應用純培養(yǎng)技術和基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，對金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)分離的21份蜜環(huán)菌進行了多樣性研究。結(jié)果表明，21株蜜環(huán)菌劃分為6個形態(tài)類群;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示分離菌株與Armillaria同源性最近，相似性都在99% 以上，主要分布在Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea 3個種內(nèi)。

關鍵詞 ? ?蜜環(huán)菌;分離;系統(tǒng)發(fā)育;四川樂山;金口河區(qū)

中圖分類號 ? ?Q949.32 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）20-0049-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?As an important symbiotic bacterium of Gastrodia elata，Armillaria can provide nutrition for the growth of Gastrodia elata. Understanding the diversity of regional honey fungus will help to select excellent Armillaria，and thus increase the yield and quality of Gastrodia elata. In this paper，the pure culture technique and phylogenetic analysis based on ITS gene sequence were used to study the diversity of 21 Armillaria isolated from the Gastrodia elata planting area of Jinkouhe district Banchangping.The results showed that 21 strains of Armillaria were divided into 6 morphological groups. The phylogenetic analysis showed that the isolates had the closest homology with Armillaria，and the similarity was over 99%，mainly distributed in Armillaria gallica，Armillaria sinapina and Armillaria mellea.

Key words ? Armillaria;isolation;phylogeny;Leshan Sichuan;Jinkouhe District

蜜環(huán)菌（Armillaria）隸屬于真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目口蘑科蜜環(huán)菌屬的一種藥食兩用真菌，在世界各地均有分布[1]。目前全世界已經(jīng)鑒定的蜜環(huán)菌生物種有40多種，其中歐洲7個、北美洲10個、非洲5個、澳洲5個，亞洲至少19個，我國分布有15種[2]。該屬真菌有些種可與天麻和豬苓共生為天麻和豬苓的生長提供營養(yǎng)，天麻共生蜜環(huán)菌生物種有Armillaria gallica、Lineage 1、CBS O、CBS L、Armillaria nabsnona、Nag. E 和Armillaria cepistipes，而豬苓共生蜜環(huán)菌的種類尚未明確[3]。蜜環(huán)菌屬有些種還是嚴重的森林病原菌[4]，能侵染針葉樹、闊葉樹等600多種樹木引起根腐病，造成經(jīng)濟損失[5]。此外，有些種則具有重要的食藥用價值。東北名菜“小雞燉蘑菇”中的蘑菇別稱榛蘑就是蜜環(huán)菌中的一種[6]。蜜環(huán)菌還具有催眠、鎮(zhèn)靜、改善心腦、血液循環(huán)、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抑制腫瘤等藥用價值[7]。

在過去的幾十年里，基于形態(tài)特征（子實體大小、形狀、孢子顏色等）和交配試驗對蜜環(huán)菌物種的鑒定取得了很大的進展。然而，由于蜜環(huán)菌生物種類眾多且形態(tài)特征相似，這些方法都非常有限[8]。近年來，分子生物學技術在蜜環(huán)菌生物種的鑒定方面得到了很好的應用[9]。在分子生物學技術中，采用單個的ITS、IGS、EF-1α序列鑒定方法，不能準確鑒定到每一個蜜環(huán)菌種[6]，而多序列結(jié)合RFLP 等技術的應用，使難以區(qū)分的近緣種或未知種的準確鑒定成為可能[1]。

金口河板廠坪天麻種植區(qū)地處四川盆地西南邊緣，該區(qū)分布有大量的杉木、柳杉、核桃等喬木樹種以及珙桐、水杉、銀杏等珍貴樹種。同時板廠坪天麻種植區(qū)海拔1 900 m，年均氣溫17 ℃，年日照時數(shù)1 130 h，年均降水量1 100 mm，平均濕度在80%左右，非常適合蜜環(huán)菌的生長[10]，而此地區(qū)蜜環(huán)菌的研究還未見相關報道。本研究嘗試從金口河板廠坪天麻種植區(qū)采集樣本，分離蜜環(huán)菌，應用可培養(yǎng)技術和基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析該地區(qū)蜜環(huán)菌的多樣性，以期為開發(fā)金口河蜜環(huán)菌資源及探索適合天麻生長的本地蜜環(huán)菌選育提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?菌株。蜜環(huán)菌菌材采自樂山市金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)，將采回后的菌材培養(yǎng)在外尺寸530 mm×370 mm×270 mm、內(nèi)尺寸485 mm×330 mm×220 mm、裝有2/3土壤、濕度70%～80%的周轉(zhuǎn)箱中，同時立刻進行分離蜜環(huán)菌。

1.1.2 ? ?分離純化培養(yǎng)基。①分離培養(yǎng)基：玉米麥麩培養(yǎng)基（玉米粉100 g，麥麩80 g，大豆10 g，白糖18 g，水1 000 mL）;純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（新鮮土豆200 g，切成小塊，加入蒸餾水1 000 mL，水煮沸時開始計時，30 min后，停止加熱，用紗布過濾，補充濾液至1 000 mL，濾液中加入2%葡萄糖，濾液加熱后，加入1.5～2.0%瓊脂，培養(yǎng)基制作完成，并常規(guī)倒平板或斜面，待用）。

1.1.3 ? ?主要試劑和儀器。玉米粉、麥麩、大豆粉、白糖和新鮮土豆，購于超市;Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，購于杭州博日科技有限公司;PCR試劑，購于生工生物工程（上海）股份有限公司;瓊脂糖為BIOWEST AGAROSE;PCR擴增儀為EasyCycler;電泳儀為DYY-8C型，北京六一儀器廠;凝膠成像儀為BioDocAnalyze;本研究使用的真菌通用引物ITS4和ITS5由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?菌索分離、純化。試驗采用黃萬兵等[11]和張玉方[12]相結(jié)合的分離方法對蜜環(huán)菌進行分離，即在超凈工作臺中用無菌水將蜜環(huán)菌菌索洗凈，用75%酒精浸泡30 s，用無菌濾紙擦干菌索，用左右手的拇指和食指分別捏住菌索相距1 cm處，在酒精燈火焰旁緩慢用力向兩邊拉至斷裂，斷裂處會拉出長短不一的白色菌絲，用無菌剪刀剪取3～5 mm白色菌絲，接種于玉米麥麩培養(yǎng)基，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后將分離培養(yǎng)基中的菌索按以上操作接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，并在相同條件下培養(yǎng)，觀察記錄菌索形態(tài)特征。

1.2.2 ? ?DNA提取。蜜環(huán)菌菌索用無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干菌索表面水分，-80 ℃冷凍備用;DNA提取采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，提取步驟按說明書嚴格操作。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?分離菌株的形態(tài)特征

從板廠坪天麻種植基地分離得到21株蜜環(huán)菌，采用黃萬兵[15]對蜜環(huán)菌形態(tài)類群劃分方法，將分離的21株蜜環(huán)菌劃分為6個形態(tài)類群。G1類群菌株菌索開始生長時間相對較早，菌索直徑較細，分支不明顯，生長不彎曲;G4類群菌株菌索開始生長相對較晚，菌索直徑較粗，分支明顯，生長卷曲（表1）。

2.2 ? ?菌株DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育分析

各類群菌株在培養(yǎng)6 d后菌索達到DNA提取用量，試驗選取6個代表菌株進行DNA提取，真菌通用引物ITS4和ITS5擴增的DNA分子大小在850 bp左右，擴增結(jié)果和凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖1），PCR擴增得到了較高質(zhì)量的總DNA，擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可以檢測到清晰明亮的PCR擴增條帶。

根據(jù)測序結(jié)果，經(jīng)SeqMan軟件拼接序列后，6個菌株的ITS序列長度范圍在853～870 bp之間，GC含量在43.84%～44.31%之間。將6個菌株的ITS序列在GenBank公共數(shù)據(jù)庫中用Blast程序進行序列比對，分離菌株與Armillaria同源性最近，相似性比對都在99%以上。M1和Armillaria gallica的相似性為99.17%，M2、M5和Armillaria mellea的相似性均為99.64%，M3、M4和Armillaria sinapina的相似性為99.06%，M6和Armillaria mellea的相似性為99.30%（表2）。

本文對蜜環(huán)菌的ITS序列進行測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析和序列比對結(jié)果一致，M1菌株和Armillaria gallica聚在一支，支持率為100%;M2、M5、M6親緣關系較近，以87%的支持率占據(jù)一支，同時和Armillaria mellea以73%的支持率聚在一大支。

3 ? ?結(jié)論與討論

本文基于ITS序列對金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌進行了分子鑒定，共鑒定出3種蜜環(huán)菌物種：Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea。與貴州天麻主產(chǎn)區(qū)和鄂西地區(qū)的蜜環(huán)菌生物種相比較，金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌物種多樣性相對較低[6，11]，造成這種現(xiàn)象的原因可能是單個的ITS、IGS、EF-1α序列的鑒定方法不能準確對此地區(qū)部分蜜環(huán)菌進行鑒定[6]。門金鑫等[1]研究表明，用于蜜環(huán)菌生物種的鑒定還有限制性片段長度多態(tài)性技術（RFLP，restriction fragment length polymorphism）和隨機擴增多態(tài)性 DNA 技術（RAPD，random amplified polym-orphic DNA）等，但這些技術也只能準確鑒定部分蜜環(huán)菌生物種。多序列結(jié)合RFLP 等技術更能較好地對金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌資源進行鑒定。

在本文鑒定出的蜜環(huán)菌生物種中，3種蜜環(huán)菌在歐洲、北美洲以及亞洲均有分布，卻在澳洲和非洲未見分布[16-17]。通過比較發(fā)現(xiàn)造成這種差異性的原因可能是蜜環(huán)菌對不斷變化的地理環(huán)境的適應，從而進化出不同的物種。此外，根據(jù)Coetzee MPA等[18]對中國蜜環(huán)菌的研究，這3種蜜環(huán)菌在中國均有分布，然而在不同省份[6，11]蜜環(huán)菌的分布情況也不同，說明不同蜜環(huán)菌對環(huán)境因子的適應性存在著差異。另一方面，對于氣候和環(huán)境變化如何影響蜜環(huán)菌以及寄主和它們的共存卻知之甚少，過去幾年對病原體方面的研究并沒有帶來許多新見解。例如，預測氣候變化對蜜環(huán)菌根腐病發(fā)病率的影響是具有挑戰(zhàn)性的，因為生命周期的不同階段，包括傳播、感染和繁殖，可能會直接或間接的受到影響，并且影響可能完全不同。缺乏與蜜環(huán)菌相關樹木死亡率的長期研究及其與人類活動引起的環(huán)境變化的多重復雜相互作用，限制了對不斷變化的環(huán)境中蜜環(huán)菌的進化理解。