二維斑點追蹤顯像(STI)評價硫酸吲哚酚(IS)對腎功能不全(CRF)大鼠的心臟毒性

孫敏敏 曹學(xué)森 潘翠珍 郭 瑤 譚 笑 舒先紅

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心超室,2腎內(nèi)科 上海 200032; 3上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032;4上海市心血管病研究所 上海 200032)

心血管并發(fā)癥是終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)患者的首要死因[1],傳統(tǒng)心血管疾病危險因素不能完全解釋患者心血管死亡風(fēng)險顯著增加。尿毒癥毒素是ESRD患者心血管并發(fā)癥的獨立危險因素[2]。硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)作為一種代表性蛋白結(jié)合腎臟毒素,在患者體內(nèi)升高最早且最明顯,常規(guī)透析方法無法清除,在動脈粥樣硬化和心肌肥厚過程中參與關(guān)鍵步驟[3-4]。IS在體外可引起心肌細(xì)胞肥厚及成纖維細(xì)胞纖維合成增加[5],在高血壓大鼠模型中IS可通過氧化應(yīng)激促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化[6],故無創(chuàng)性超聲心動圖監(jiān)測IS引起的心臟重構(gòu)和功能改變對臨床意義重大。斑點追蹤顯像(speckle tracking imaging,STI)基于高幀頻灰階超聲圖像,實時跟蹤心肌內(nèi)回聲斑點的空間運動,時間及空間分辨率較高,無角度依賴性[7-8]。本研究采用5/6腎切除SD大鼠模型,通過外源性IS誘導(dǎo),明確IS作用下在體心臟的形態(tài)、功能及病理改變,同時采用STI技術(shù)對大鼠的左室功能進(jìn)行評估,以探測其應(yīng)用價值。

資料和方法

實驗試劑麻醉用5%戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司);0.9%氯化鈉注射液(百特制藥有限公司);硫酸吲哚酚(美國Sigma公司)。

儀器和分析軟件Vivid E9心臟超聲診斷儀(美國GE公司)配備12S探頭(11 MHz),數(shù)據(jù)分析采用EchoPac BT12工作站。

研究對象30只6周齡SD大鼠,體質(zhì)量為(220±20)g,由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供和籠養(yǎng),室溫和相對濕度恒定,食物及水源供應(yīng)充足。隨機(jī)分為3組,每組10只,即假手術(shù)(sham operation,SOR)組、腎功能不全手術(shù)對照(chronic renal failure,CRF)組和CRF+IS處理組。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)實驗動物關(guān)懷和利用委員會的許可。

研究方法

動物模型制備及實驗流程 采用5/6腎切除術(shù)[9]建立腎功能不全大鼠模型。一期手術(shù)采用5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,左腎被腹正中暴露切開,暴露左腎,剝離腎包膜,將左腎上下級各1/ 3 切除,明膠海綿壓迫止血并縫合。一期手術(shù)后1周行二期手術(shù),同樣方法麻醉,右側(cè)背部切開暴露右腎,結(jié)扎腎蒂,摘除右腎。SOR組與5/6腎切除術(shù)組動物同期進(jìn)行二次手術(shù),僅切開并剝離腎包膜暴露腎臟后關(guān)腹。術(shù)后6周(13周齡)采集血液標(biāo)本,測血肌酐較基線上升2～3倍,建模成功。IS組隔天腹腔注射IS(100 mg/kg)[10]24周,每次注射前配置IS溶液,另兩組注射等量生理鹽水24周。所有大鼠在IS注射結(jié)束1周時采集血液標(biāo)本,測量肌酐及IS濃度,采集心超圖像后處死,采集心臟標(biāo)本,血液IS濃度測量采用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)法[11]。

超聲心動圖像采集 所有大鼠均于基線狀態(tài)下及IS注射結(jié)束1周時采集常規(guī)二維及斑點追蹤顯像圖像,采用GE E9超聲診斷儀,12S探頭,采集時頻率設(shè)為11 MHz,深度為2.5 cm,幀頻為(220±25)F/s。圖像定量分析采用EchoPAC BT12脫機(jī)軟件。

二維超聲圖像定量分析 在大鼠左室胸骨旁長軸切面,將取樣線盡量垂直穿過室間隔及二尖瓣前葉瓣尖,取M型,測量左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)及收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD),計算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。于左室乳頭肌水平短軸根據(jù)時鐘法分為4個象限,于每個象限內(nèi)分別測量左室壁厚度且取平均值為左室壁厚度(left ventricular wall thickness,LVWT)。

斑點追蹤圖像分析 采用大鼠左室乳頭肌水平短軸圖像,進(jìn)入斑點追蹤分析2D分析系統(tǒng),手動描繪心內(nèi)膜,調(diào)整追蹤環(huán)寬度,軟件自動識別并跟蹤整個心動周期內(nèi)的左室壁聲學(xué)斑點,自動計算出左室應(yīng)變及應(yīng)變率指標(biāo)(圖1):環(huán)向應(yīng)變(circumferential strain,CS)、徑向應(yīng)變(radial strain,RS)、徑向應(yīng)變率(RS rate,SRr)和環(huán)向應(yīng)變率(CS rate,SRc),徑向應(yīng)變率舒張早期E’峰(E’-SRr)和徑向應(yīng)變率舒張晚期A’峰(A’-SRr),環(huán)向應(yīng)變率舒張早期E’峰(E’-SRc)和環(huán)向應(yīng)變率舒張晚期A’峰(A’-SRc),并計算左室舒張功能參數(shù)徑向E’/A’-SRr和環(huán)向E’/A’-SRc[12]。每個圖像分別分析3個心動周期并取平均值。

CS:Circumferential strain;RS:Radial strain;RSr:RS rate;STI:speckle tracking imaging.

圖1 STI測量左室CS (A)、RS (B)及RSr (C)
Fig 1 CS (A),RS (B) and RSr (C) of left ventricle by STI

病理學(xué)檢查圖像采集結(jié)束后處死大鼠,取心臟,稱重,觀察心肌大體形態(tài)。HE染色,光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)(細(xì)胞核、胞質(zhì)、橫紋),細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色,評價心肌細(xì)胞肥厚及壞死程度。在200倍鏡下攝片,測量鏡下細(xì)胞總面積及細(xì)胞數(shù),計算單個細(xì)胞面積平均值。Masson染色,觀察心肌細(xì)胞纖維化程度,心臟組織中膠原纖維呈藍(lán)色。病理切片評分由1名經(jīng)驗豐富且不知情的病理科醫(yī)師完成。

一致性檢驗對10例隨機(jī)選取的大鼠圖像使用斑點追蹤顯像分析的測量結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗。觀察者內(nèi)差異為同一觀察者間隔24 h以上的2次測量結(jié)果比較,觀察者間差異為2位獨立觀察者各自的測量結(jié)果比較,采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intra-class correlation coefficient,ICC)表示。

結(jié) 果

實驗室數(shù)據(jù)IS組中3只大鼠在注射IS后12～20周猝死,未采集實驗后的超聲圖像,故未納入最終統(tǒng)計分析。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn),這3只大鼠中2只存在大量心包和腹腔積液,1只在注射部位出現(xiàn)巨大壞死包塊。3組大鼠基線、建模成功及實驗結(jié)束時的血肌酐數(shù)值及血IS值見表1。

常規(guī)超聲心動圖數(shù)據(jù)比較基線狀態(tài)下3組參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3組LVEDD較基線均明顯增大;SOR組室壁厚度與基線差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而另兩組室壁厚度較基線均明顯增厚(P均<0.05);SOR組LVEF由92%±3%降至88%±5%(P<0.001),而另兩組LVEF術(shù)后與基線無明顯改變(圖2和表2～3)。

表1 3組大鼠基線、建模成功和實驗結(jié)束時的血肌酐值及血IS值Tab 1 Serum creatinine and IS on baseline,successful modeling and post-operation in the 3 groups of rats

(1)vs.Baseline,(2)vs. SOR group,(3)vs. CRF group,P<0.05.Scr:Serum creatinine;IS:Indoxyl sulfate.

A:SOR group;B:CRF group;C:IS group.

圖2 大鼠術(shù)后左室乳頭肌水平短軸圖像
Fig 2 Images of short axis of left ventricle after operations in rats

表2 3組大鼠基線與實驗后心超數(shù)據(jù)比較Tab 2 Comparison of echocardiographic parameters on baseline and post-operation in the 3 groups of rats

HR:Heart rate;LVEDD:Left ventricular end-diastolic diameter;LVWT:Left ventricular wall thickness;LVEF:Left ventricular ejection fraction;RS:Radial strain;CS:Circumferential strain;SRr:RS rate;SRc:CS rate.

應(yīng)變參數(shù)比較基線狀態(tài)下3組CS及RS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗前后比較,RS在CRF組中顯著增加(P=0.017),RS及CS在IS組及SOR組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 3組大鼠實驗后心超數(shù)據(jù)的組間比較Tab 3 Pairwise comparison of echocardiographic parameters on post-operation in the 3 groups of rats (P value)

Abbreviations refer to Tab 2.

應(yīng)變率參數(shù)比較基線狀態(tài)下比較3組SRr、SRc、E’/A’-SRr及E’/A’-SRc,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。CRF組和IS組實驗后SRc及SRr較基線均明顯增加(P<0.001);而SOR組實驗前后SRc無顯著變化,實驗后SRr較基線明顯增加(P=0.001)。實驗后3組SRc及SRr比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IS組和CRF組實驗后E’/A’-SRc和E’/A’-SRr較基線均顯著降低(P均<0.001),SOR組則無顯著變化。實驗后IS組E’/A’-SRc和E’/A’-SRr均顯著低于CRF組(P=0.01和0.001,表3)。

一致性檢驗STI指標(biāo)RS、CS、SRr、SRc、E’/A’-SRr和E’/A’-SRc的觀察者內(nèi)差異的ICC值分別為0.93(95%CI:0.79～0.98,P<0.001)、0.91(95%CI:0.76～0.95,P<0.001)、0.92(95%CI:0.80～0.96,P<0.001)、0.91(95%CI:0.73～0.97,P<0.001)、0.88(95%CI:0.70～0.93,P=0.001)和0.89(95%CI:0.71～0.94,P=0.001),觀察者間差異的ICC值分別為0.90(95%CI:0.75～0.95,P<0.001)、0.89(95%CI:0.73～0.94,P<0.001)、0.89(95%CI:0.73～0.93,P<0.001)、0.88(95%CI:0.72～0.93,P<0.001)、0.83(95%CI:0.70～0.92,P=0.001)和0.85(95%CI:0.73～0.94,P=0.001)。提示STI測量獲得的應(yīng)變及應(yīng)變率參數(shù)一致性較好。

病理學(xué)檢查CRF組及IS組的心臟重量均大于SOR組(P<0.05)。HE染色示:SOR組、CRF組及IS組心肌細(xì)胞面積依次增大(P<0.05);Masson染色示:3組心肌纖維化程度依次增加(圖3,表4)。

A:SOR group;B:CRF group;C:IS group.A1,B1 and C1:HE staining;A2,B2 and C2:Masson staining (blue area indicated fibrosis).

圖3 大鼠心臟的病理學(xué)檢查(*200)
Fig 3 Pathologial examination of rats’ cardiac tissues (*200)

表4 3組大鼠心臟重量及心肌細(xì)胞面積的比較Tab 4 Histological analysis of heart weight and myocardial cell area in the 3 groups of rats

(1)CRFvs.SOR;(2)ISvs.SOR;(3)ISvs.CRF.

討 論

IS分子式為C8H7NO4S,相對分子質(zhì)量為213 210,為陰離子蛋白結(jié)合尿毒癥毒素,是腸道細(xì)菌酵解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。腸道細(xì)菌分解色氨酸產(chǎn)生吲哚,經(jīng)門靜脈入肝,經(jīng)羥化生成3-羥基吲哚,再經(jīng)硫酸化生成IS。循環(huán)中90%以上的IS和白蛋白非共價結(jié)合,正常情況下IS通過近端腎小管分泌由尿液排出體外,腎功能受損時在體內(nèi)蓄積[13]。近年來IS 在ESRD 患者心血管并發(fā)癥中的作用越來越受到重視,研究發(fā)現(xiàn):IS是預(yù)測ESRD患者并發(fā)心血管疾病的重要標(biāo)志物[14];血漿IS高濃度是全因死亡和心血管疾病死亡的強(qiáng)力預(yù)測因子[15];258例維持性血液透析患者中,血漿IS高濃度組較低濃度組的心衰發(fā)生風(fēng)險增加5.31倍[16]。基礎(chǔ)研究證實,IS可通過多種途徑參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[17-18],同時通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[6]、激活p38 MAPK、p42/44 MAPK 和NF-κB[19]、抑制腎臟Klotho基因表達(dá)[20]等多條通路促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚和膠原纖維增生;動物實驗證實,口服碳吸附劑AST-120可通過抑制IS前體的吸收,顯著降低腎功能不全大鼠的心肌纖維化和改善預(yù)后[21]。

目前缺乏IS在體研究資料,更鮮有運用超聲心動圖評估的報道。本研究采用常規(guī)超聲測量,發(fā)現(xiàn)CRF組和IS組左室心肌明顯肥厚,且IS組心肌肥厚更顯著,與心臟大體重量和病理結(jié)果一致,證實超聲心動圖在評估左心室壁肥厚方面的可行性和準(zhǔn)確性。反之,LVEF在CRF組和IS組均未顯著受損,甚至出現(xiàn)代償性增強(qiáng),可能與本實驗采用Teichholtz校正公式計算LVEF有關(guān),Teichholtz公式側(cè)重于徑向收縮的成分,而心肌肥厚的功能變化早期常表現(xiàn)為縱向收縮降低而徑向收縮代償性增強(qiáng)[22]。該結(jié)果從側(cè)面證實了采用常規(guī)超聲參數(shù)LVEF評估心臟受損的局限性和滯后性。

STI技術(shù)基于高幀頻灰階超聲圖像,實時跟蹤心肌內(nèi)回聲斑點的空間運動,具有較高的時間及空間分辨率,無角度依賴性,能分辨心肌的主動運動和被動牽拉,多項研究證實其能敏感準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)心肌的結(jié)構(gòu)功能改變,且與磁共振結(jié)果高度相關(guān)[23]。本研究采用STI顯示RS在CRF組中顯著增加,CS也有增加的趨勢,而IS組前后并無顯著變化,提示IS組的心肌代償能力下降。Kouzu等[24]在高血壓人群中發(fā)現(xiàn)其縱向應(yīng)變較正常人降低,但其早期RS較正常人增強(qiáng),尿毒癥性心肌改變發(fā)生縱向應(yīng)變的降低是多個研究獲得的共識,而對于RS及CS是否發(fā)生改變?nèi)杂袪幾h,由于大鼠心臟的超聲切面非常有限,無法獲得滿意的心尖部四腔心等切面,故未能成功分析長軸應(yīng)變數(shù)據(jù),這也是本實驗的局限性之一。

嚙齒類動物作為研究對象,由于心率快,超聲切面有限,左心室舒張功能評估一直是個難點,而STI的應(yīng)變率顯像則為評價左心室的舒張功能開辟了一條全新的道路。文獻(xiàn)報道采用應(yīng)變率顯像評價左室舒張功能更為敏感可靠[12]。舒張功能反映心肌細(xì)胞的順應(yīng)能力,心肌細(xì)胞肥厚、壞死及纖維化均可導(dǎo)致心肌的順應(yīng)性下降而產(chǎn)生舒張功能障礙,而舒張功能障礙可通過心室的充盈不良進(jìn)一步影響左心室的收縮功能[25]。腎功能不全患者中舒張功能障礙發(fā)生率達(dá)50%～65%,且其發(fā)生早于收縮功能障礙[26],與不良預(yù)后密切相關(guān)[27]。Sato等[28]報道高血漿IS 與左室舒張功能障礙密切相關(guān),這可能與IS刺激心肌細(xì)胞肥大、加重纖維化有關(guān)。本研究采用STI技術(shù)獲得左心室舒張功能參數(shù),通過比較顯示CRF組和IS組的左心室舒張功能出現(xiàn)顯著減退,且IS組減退程度更為顯著,證實了STI在動物實驗中評價左心室舒張功能的可行性與準(zhǔn)確性。

嚙齒類動物的心率較快,對圖像的幀頻要求較高,常規(guī)二維超聲無法兼顧幀頻和清晰度,導(dǎo)致資料無法分析。STI幀頻較高,在本研究中可達(dá)到220～250幀/s,具備較高的時間分辨率[29],是嚙齒類動物實驗中心臟超聲評估的首選。

本研究的不足之處:(1)未設(shè)立單純注射IS組,在腎功能正常人群中IS的清除率為(3 023±533) mL·min-1·1.73 m-2,是肌酐的(22±4)倍[30],故未設(shè)立單純注射IS大鼠組作為對照;(2)未能成功分析獲得縱向應(yīng)變資料;(3) IS組中有3例大鼠在IS注射期間猝死,并出現(xiàn)心包、胸腔積液和局部膿腫包塊,可能與IS注射部位消毒操作不規(guī)范及IS對局部組織的刺激作用有關(guān),應(yīng)規(guī)范操作以避免類似情況的發(fā)生;(4)動物樣本量較小,未通過IS注射量進(jìn)行分組研究,未能進(jìn)一步分析IS導(dǎo)致的心肌細(xì)胞病變是否具有劑量相關(guān)性,這將成為下一步的研究方向。

IS可以加重腎功能不全大鼠的心肌損害,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的肥厚、壞死和纖維化,且左室舒張功能的下降早于收縮功能受損,應(yīng)變率顯像的舒張功能指標(biāo)可敏感檢測IS導(dǎo)致的左室舒張功能改變。