酶標(biāo)儀法測(cè)定發(fā)酵液中谷胱甘肽的含量

張恩芬，查 飛，周建寶，費(fèi)芙蓉，王 洲，薛正蓮

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的一種含γ -谷氨酰基和巰基的三肽類化合物，具有清除自由基、延緩衰老、解毒等多種生理功能[1-3]，在臨床上可以用來(lái)肝臟保護(hù)[4]、治療腫瘤和治療內(nèi)分泌紊亂等疾病[5-6]，同時(shí)還廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。因此，全世界科學(xué)家研究的熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)向GSH[7]。目前對(duì)谷胱甘肽測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、酶循環(huán)法等[8]，但成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大批量樣品的定量檢測(cè)已成為上述方法的缺點(diǎn)。

可見(jiàn)分光光度計(jì)是常用于化合物的檢測(cè)，酶標(biāo)儀是常用于酶聯(lián)免疫的測(cè)定[9]，測(cè)定物質(zhì)含量二者均服從朗伯-比爾定律：物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度和濃度之間存在線性關(guān)系，目的是實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物定量的檢測(cè)。可見(jiàn)分光光度計(jì)法影響因素少，操作繁瑣，試劑用量大，耗時(shí)長(zhǎng)；酶標(biāo)儀影響因素多，但速度快，效率高，試劑用量少，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)[10]。

考慮到菌種選育過(guò)程中，產(chǎn)GSH畢赤酵母突變株的數(shù)量較多，通過(guò)孔板發(fā)酵的樣品多，尋找一種快速、高效、精確的測(cè)定方法非常重要。本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀法測(cè)定GSH含量，并與分光光度計(jì)法進(jìn)行了比較，用Origin軟件對(duì)2種方法進(jìn)行擬合分析，顯示2 種測(cè)定方法具有很好的一致性。到目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)酶標(biāo)儀測(cè)定GSH含量方面的相關(guān)研究，酶標(biāo)儀法能夠簡(jiǎn)單、高效、精確地測(cè)定發(fā)酵液中GSH含量，為高通量選育GSH酵母菌提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

還原型谷胱甘肽(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醛(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司; 鹽酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；Tris(生化試劑) ，生工生物工程股份有限公司;2-硝基苯甲酸(DTNB)標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑) ，生工生物工程股份有限公司; FC型酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific; 常溫室壓等離子體(ARTP) ，北京思清源生物科技有限公司; 單道手動(dòng)可調(diào)移液器，Sartorius; 723N 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司; Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。

1.2 菌種

畢赤酵母：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

1.3.1 培養(yǎng)基

種子/斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10，pH6.0。115°C，滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母粉12.5，(NH4)2SO45，KH2PO49，MgSO4·7H2O 1.0， 用NaOH調(diào)pH至5.0-5.5。115°C，滅菌25min。

1.3.2 試劑

Tris-HCl緩沖液(ph8.0)；3%甲醛；0.1 mmoL/L DTNB： 稱取 0.3964g DTNB 溶于 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，定容至 100m L，儲(chǔ)存于棕色瓶，低溫保存；DTNB分析液：0.01mol/L DTNB 和 0.25mol/L Tris.-HCl 體積比為 1:100 混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 GSH測(cè)定的原理及方法

比色法測(cè)定GSH的原理：DTNB法，還原型谷胱甘肽和5,5-二硫代雙(硝基苯甲酸)反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，在pH8.0，412nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。同時(shí)利用甲醛掩蔽半胱氨酸等含有巰基的化合物來(lái)提高測(cè)定方法的準(zhǔn)確性[11-12]。

測(cè)定方法：吸取樣液0.5mL，分別添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液1.5 mL、3%甲醛0.5 mL、0.1 mmoL/L DTNB分析液2.5 mL，搖勻，25℃水浴5 min[13]，酶標(biāo)儀在412nm處測(cè)定OD值。

1.4.2 谷胱甘肽含量測(cè)定中主要影響因素的優(yōu)化

取0.2 g/L、0.3 g/L和0.4 g/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，按1.4.1的測(cè)定方法對(duì)主要影響因素中的Tris-HCl緩沖液、甲醛、DTNB分析液的添加量進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)Tris-HCl緩沖液添加量進(jìn)行優(yōu)化時(shí)0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液取值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；對(duì)甲醛的取值分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL；對(duì)DTNB分析液的取值分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用蒸餾水和GSH標(biāo)準(zhǔn)液混合配制標(biāo)樣，見(jiàn)表1。精確配制0.2 g/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液。按照優(yōu)化后的方法在412nm下酶標(biāo)儀和可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定并對(duì)其測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 精密度試驗(yàn)

按建立的方法對(duì)75 mg/L和135 mg/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算GSH的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液GSH和蒸餾水組成表

1.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別配制2.4475、4.8950、24.475、75、135 mg/L的GSH按優(yōu)化后的方法測(cè)定，并且按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算GSH的含量，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.6 兩種方法的擬合曲線

將實(shí)驗(yàn)中通過(guò)ARTP誘變所獲得的45 株畢赤酵母突變株經(jīng)48孔板發(fā)酵制得的發(fā)酵液離心，取上清液1mL，按照優(yōu)化后的方法，采用origin 8. 0軟件擬合酶標(biāo)儀與可見(jiàn)光分光光度計(jì)412nm下的測(cè)定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tris-HCl 緩沖液添加量的影響

按照方法1.4.2見(jiàn)圖1。

圖1 Tris-HCl緩沖液添加量對(duì)OD412的影響

如圖1所示，隨著Tris-HCl緩沖液的添加量的增多，OD值先是上升，出現(xiàn)峰值后下降，且0.2 g/L的GSH、0.3 g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.6 mL的0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液時(shí)OD值最大，這是由于添加0.6 mL0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液所達(dá)到的pH值是DTNB反應(yīng)的最適pH值，添加量過(guò)多過(guò)少都不利于反應(yīng)進(jìn)行，因此，本實(shí)驗(yàn)確定添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液0.6mL。

2.2 3%甲醛添加量的影響

按方法1.4.2所測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 3%甲醛添加量對(duì)OD412的影響

如圖2所示，隨著3%甲醛的添加量的增加，OD值逐漸下降，且不增加，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.1 mL3%甲醛時(shí)達(dá)到最高OD值，究其原因?yàn)榧兹┢鸬窖诒蝿┑淖饔?，掩蔽含巰基的化合物，添加量過(guò)多會(huì)影響DTNB反應(yīng)，因此，本實(shí)驗(yàn)確定3%甲醛的添加量為0.1 mL。

2.3 DTNB分析液添加量的影響

按方法1.4.2所測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DTNB分析液的添加量對(duì)OD412的影響

如圖3所示，隨著DTNB分析液的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢(shì)，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加1.5mLDTNB分析液達(dá)到最大OD值，其原因?yàn)樵贒TNB反應(yīng)中1.5mL DTNB分析液在一定pH條件下與GSH反應(yīng)，反應(yīng)效率最高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按方法1.4.3分別繪制可見(jiàn)分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀測(cè)定的GSH濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 可見(jiàn)分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 酶標(biāo)儀的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5可知，GSH的濃度在0-200mg/L范圍內(nèi)R2=0.9978線性關(guān)系良好，可以用于GSH濃度的測(cè)定，酶標(biāo)儀檢測(cè)GSH最低檢出限為2.4475mg/L，即空白對(duì)照組的OD值帶入標(biāo)曲所得。

2.5 精密度試驗(yàn)

按方法1.4.精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，該方法的檢測(cè)精密度在低濃度和高濃度都較好，且各組的變異系數(shù)和相對(duì)誤差都在5%以下；表明酶標(biāo)儀法測(cè)GSH結(jié)果重現(xiàn)性好，精密度高，該方法可行性高。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

按方法1. 4. 5所測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，以檢測(cè)限的10倍加標(biāo)時(shí)回收率在88.36%-91.76%之間，以檢測(cè)限的2倍加標(biāo)時(shí)回收率在101.29%-118.32%之間，而以最低檢測(cè)限加標(biāo)時(shí)回收率為117.47%?？紤]到加入過(guò)多或者過(guò)少的標(biāo)準(zhǔn)品，均不能保證加標(biāo)樣品有較好的回收率，當(dāng)濃度范圍為中、高濃度水平時(shí)，適用于一般的分析方法，所以，對(duì)75mg/L GSH、135mg/L GSH的加標(biāo)回收率進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率在98.12%-107.72%之間，表明酶標(biāo)儀法可以用于GSH濃度的測(cè)定。

表3 加標(biāo)回收率

2.7 兩種方法的擬合曲線

按方法1. 4. 6，結(jié)果見(jiàn)圖6。對(duì)45株畢赤酵母菌突變株的發(fā)酵液中GSH的含量分別用可見(jiàn)光分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)二者進(jìn)行擬合，驗(yàn)證兩方法之間的相關(guān)性，擬合曲線見(jiàn)圖6。

圖6 分光光度計(jì)法和酶標(biāo)儀法的擬合曲線

兩種方法相關(guān)的方向取決于相關(guān)系數(shù)的正負(fù)，而相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值的大小決定了相關(guān)的強(qiáng)弱。統(tǒng)計(jì)學(xué)家根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給出了R=0.70作為一個(gè)中等到較高的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[14]。本實(shí)驗(yàn)的樣本量為45，相關(guān)系數(shù)R=0.9503，說(shuō)明酶標(biāo)儀法和可見(jiàn)分光光度計(jì)之間具有較高的正相關(guān)性，酶標(biāo)儀法可以作為快速、精確的測(cè)定發(fā)酵液中GSH含量的有效方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用DTNB反應(yīng)測(cè)定GSH含量，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)，對(duì)影響該反應(yīng)的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。并對(duì)該方法進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，表明酶標(biāo)儀測(cè)定GSH含量的可行性高。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)ARTP誘變獲得的45株突變菌株分別使用可見(jiàn)分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定并對(duì)測(cè)定值擬合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2種測(cè)定方法具有很好的一致性。酶標(biāo)儀能簡(jiǎn)單、高效、精確的測(cè)定發(fā)酵液中的GSH含量，為高通量選育GSH酵母菌提供了很好的理論基礎(chǔ)。