基于16S rDNA測序技術探索白頭翁湯灌腸對濕熱型潰瘍性結腸炎大鼠腸道菌群的影響

鮑炳州，朱 超，吳生兵，2,3，盧燦省，石 健，武 岳，李曉博，葉九林

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院針灸經(jīng)絡研究所，安徽 合肥 230038;3.安徽中醫(yī)藥大學 新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不明確的慢性腸道炎癥性疾病，其臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的血便、腹瀉、腹痛并伴體質(zhì)量下降。UC屬于中醫(yī)學“腸風”“大瘕泄”“腸癖”“滯下”等范疇，其基本病機為本虛標實，虛乃脾腎虧虛，實乃濕、熱、瘀、毒壅滯大腸。白頭翁湯始載于《傷寒論》，具有清熱燥濕、涼血解毒之功，常作為主治熱痢之方。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯具有抗炎、抗過敏、抗菌作用。黃連、黃柏都含有小檗堿，二者提取物具有抗腹瀉、抗炎以及抗?jié)冏饔?，可調(diào)節(jié)機體免疫。秦皮具有抗炎作用[1]，其治療UC臨床療效明顯[2]。為了探究UC的發(fā)病是否與腸道的菌群失調(diào)有關，白頭翁湯治療UC是否通過改變腸道菌群來進行調(diào)節(jié)，筆者開展了相關實驗，現(xiàn)將實驗研究結果匯報如下。

1 材料

1.1 動物 健康SPF級2個月齡SD雄性大鼠62只，體質(zhì)量(200±20)g，購自安徽醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2017-001]，分籠飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心，飼養(yǎng)溫度為(24±2)℃，相對濕度為50%～70%。

1.2 試藥 白頭翁湯按李冀主編的《方劑學》[3]中確定的藥物組成和劑量(白頭翁15 g，黃柏、黃連、秦皮各9 g)，藥物總量為42 g。所有的藥材購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)水煮2次，混合過濾后，濃縮制備成4.31、8.62、17.24 g/mL的藥液，經(jīng)滅菌后置于4 ℃冰箱備用。美沙拉嗪緩釋顆粒(國藥準字 H20100062，批號 190404)：上海愛的發(fā)制藥有限公司。2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid solution, TNBS)(批號 SLBX3263)：美國Sigma公司；QIAamp糞便DNA提取盒(批號 51604)：上海浩然生物技術有限公司；無水乙醇。

1.3 儀器 脫水機：武漢俊杰電子有限公司；包埋機：廣州兆康生物科技有限公司；病理切片機：深圳匯沃科技有限公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；電子天平BS230S：sartorius公司；凝膠成像系統(tǒng)：Tanon公司。

2 方法

2.1 模型制備和分組 按照文獻[4]的方法，先建立濕熱型大鼠模型：在普通飼料喂養(yǎng)的基礎上，自由飲用濃度為200 g/L的蜂蜜水，每日上午灌服豬油10 g/kg，30 min后灌服56度白酒10 mL/kg，共持續(xù)10 d，以造成內(nèi)因濕熱型模型。濕熱型模型建立完畢后，按照隨機數(shù)字表法將62只SPF級雄性大鼠分為正常組，模型組，白頭翁湯高、中、低劑量組和美沙拉嗪組，其中正常組12只，其余各組10只。除正常組以外，其余各組均采用TNBS/乙醇法[5]復制UC模型。禁食、不禁水24 h，模型復制前用棉簽擦拭肛門，促使大便排出，再用異氟烷氣體麻醉后，采取頭低腳高位約45°角，將直徑約2 mm的聚乙烯管用石蠟油潤滑后，自肛門緩慢插入直腸約8 cm，灌入TNBS原液100 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，將大鼠倒置60 s，放回籠中，清醒后自由飲食，及時觀察大鼠情況。UC模型復制后第3天，正常組、模型組各隨機抽取2只大鼠剪取結腸組織病理切片后進行模型評價，確定模型復制是否成功。

2.2 藥物治療 按照標準動物的體表面積等效劑量折算系數(shù)法[6]確定大鼠給藥劑量，成人和大鼠的換算系數(shù)為6.17，白頭翁湯成人每日劑量是42 g/kg，換算成大鼠劑量為每日4.31 g/kg，設置大鼠白頭翁湯低、中、高劑量組分別為每日2.15、4.31、8.62 g/kg，美沙拉嗪組為每日0.35 g/kg，按白頭翁湯中劑量組等效劑量給藥。

在UC模型復制成功后第2天對各組大鼠進行灌腸治療，白頭翁湯低、中、高劑量組每日分別給予2.15、4.31、8.62 g/kg白頭翁湯藥液灌腸，美沙拉嗪組每日給予0.35 g/kg美沙拉嗪灌腸液灌腸，正常組、模型組大鼠均使用生理鹽水灌腸，每日1次，每次灌腸容積均為0.5 mL，連續(xù)灌腸治療14 d。

2.3 標本收集及指標觀察

2.3.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察及疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分 治療14 d后，觀察并記錄大鼠體質(zhì)量、大便性狀及大便隱血情況并計算DAI評分[7]，包括體質(zhì)量下降、大便性狀和血便3項。①體質(zhì)量無下降，計0分；下降1%～5%，計1分；下降5%～10%，計2分；下降10%～15%，計3分；下降15%以上，計4分。②大便性狀：正常，計0分；大便松散，計2分；稀便，計4分。③血便：無血便，計0分；大便隱血陽性，計2分；肉眼血便，計4分。

2.3.2 各組大鼠病理狀態(tài)觀察 異氟烷氣體麻醉后，無菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，于肛門上端8 cm處，剪取病變結腸組織約2 cm，4 ℃生理鹽水清洗，浸入4%多聚甲醛中固定24 h，自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片，選取相鄰的切片分別用于常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-essence，HE)染色，中性樹膠封片，光鏡觀察。

2.3.3 大鼠腸道菌群分析

(1)糞便的收集 治療結束后收集各組大鼠相應結腸位置的新鮮糞便，置于無菌凍存管中，-80 ℃冰箱中保存。

(2)結腸內(nèi)容物細菌基因組DNA的提取 使用QIAamp糞便DNA提取盒提取DNA，用紫外分光光度計在260 nm波長下測定吸光度值(absorbance，A)，計算其濃度，通過A260/A280值鑒定純度，進行0.8%的瓊脂糖電泳驗證其完整性。

(3)測序及分析 PCR擴增基因組DNA，引物為細菌16S rDNA V4區(qū)特異性引物，擴增片段長度約為225個堿基，構建測序文庫，采用Miseq平臺測序，隨后對高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。

3 結果

3.1 各組大鼠濕熱型UC模型復制結果及一般狀態(tài)觀察 模型復制成功后第2天開始，正常組大鼠精神活潑，反應敏捷，毛發(fā)光亮，飲食正常，大小便正常，模型組、美沙拉嗪組、白頭翁湯各治療組大鼠均出現(xiàn)黏液血便，精神不振，食量下降，毛發(fā)散亂，體質(zhì)量下降。治療3 d后模型組、正常組隨機選取2只進行模型評價。治療過程中因灌腸方法不當，正常組死亡1只，美沙拉嗪組死亡1只，白頭翁湯中劑量組死亡3只，白頭翁湯高劑量組死亡3只。給藥后白頭翁湯各劑量組、美沙拉嗪組大鼠體質(zhì)量逐漸回升，肉眼血便逐漸減少，逐漸成形，毛發(fā)及精神狀態(tài)逐漸好轉。

3.2 各組大鼠DAI評分比較 與正常組比較，模型組DAI評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組DAI評分顯著降低(P<0.05)；白頭翁湯各劑量組與美沙拉嗪組DAI評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示白頭翁湯各治療組和美沙拉嗪組在緩解癥狀方面作用相當。見圖1。

注：A.正常組(n=9)；B.模型組(n=8)；C.白頭翁湯低劑量組(n=10)；D.白頭翁湯中劑量組(n=7)；E.白頭翁湯高劑量組(n=7)；F.美沙拉嗪組(n=9)；與模型組比較，*P<0.05

3.3 光鏡下各組大鼠結腸組織形態(tài)學變化 正常組大鼠結腸上皮組織均完整，組織結構正常，無炎癥細胞浸潤；模型組黏膜層欠完整，可見一潰瘍面深達肌層，腺體排列不規(guī)則，大量炎癥細胞浸潤及明顯毛細血管擴張充血；白頭翁湯各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸組織上皮尚完整，黏膜層稍有缺損，無深達肌層的潰瘍面，有較多炎癥細胞浸潤，腺體排列尚規(guī)則，有毛細血管充血。見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.白頭翁湯低劑量組；E.白頭翁湯中劑量組；F.白頭翁湯高劑量組

圖2光鏡下大鼠結腸組織形態(tài)學變化比較(HE染色，10×40倍)

3.4 各組大鼠腸道菌群對比分析

3.4.1 測序質(zhì)量及腸道菌群多樣性評估 實驗的50個樣本一共得到1 117個操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。由圖3A可以看出，當樣本量接近50時，增加樣品量很少產(chǎn)生新的OTUs，表明樣品量足夠；根據(jù)樣品的共有OTUs以及OTUs所代表的物種，可以找到核心微生物組。如圖3B所示，各組共有36個相同的核心微生物組，其中正常組有6個特征核心微生物組，模型組有2個特征核心微生物組，白頭翁湯低劑量組有3個特征核心微生物組，白頭翁湯中劑量組有5個特征核心微生物組，白頭翁湯高劑量組有3個特征核心微生物組，美沙拉嗪組有3個特征核心微生物組。

注：A. Specaccum物種累積曲線；B. OTUs花瓣圖

3.4.2 各組大鼠腸道菌群在門水平上結構組成分析 根據(jù)物種注釋結果，物種豐度在門水平篩選出排名前20優(yōu)勢物種，制作物種譜柱狀圖(見圖4)。在門水平上各組優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)與擬桿菌門(Bacteroidetes)。厚壁菌門/擬桿菌門(Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B)值在正常組大鼠為0.78，模型組大鼠上調(diào)為1.51，白頭翁湯低劑量組下調(diào)為1.33，白頭翁湯中劑量組下調(diào)為0.90，白頭翁湯低劑量組下調(diào)為1.39，美沙拉嗪組下調(diào)為1.00。見表1。

圖4 門水平中不同組的物種譜柱狀圖

組 別厚壁菌門擬桿菌門F/B正 常41.5353.320.78模 型52.3334.791.51白頭翁湯低劑量50.6437.861.33白頭翁湯中劑量44.2448.910.90白頭翁湯高劑量51.3736.791.39美沙拉嗪44.40 44.171.00

3.4.3 各組大鼠在屬的水平上腸道菌群物種分類樹及優(yōu)勢菌屬分析 根據(jù)物種分類結果，篩選出優(yōu)勢物種，對物種豐度前20進行分類樹統(tǒng)計，從整個分類系統(tǒng)上了解各組的優(yōu)勢物種的豐度差異和進化關系圖。其中在屬水平上優(yōu)勢菌屬前3位分別為普氏菌屬(占38.75%)、擬桿菌屬(占9.05%)、乳桿菌屬(占7.11%)，見圖5。模型組和正常組比較，普氏菌屬在模型組中豐度降低，治療組中白頭翁湯低、高劑量組,美沙拉嗪組與模型組相比豐度回調(diào)，中劑量組與模型組基本持平；擬桿菌屬豐度各組基本持平；模型組和正常組比較，乳桿菌屬在模型組中豐度降低，治療后白頭翁湯低、中、高劑量組,美沙拉嗪組與模型組相比豐度回調(diào)。見圖6。

4 討論

UC常見的病理特點為黏膜的急慢性炎癥、潰瘍及腺瘤性息肉形成[8]。腸道正常微生物群可以對腸道黏膜免疫功能、腸上皮細胞的更新、黏液分泌、黏膜血流及腸蠕動產(chǎn)生影響[9-11]，因此腸道微生物群失調(diào)可能是促進UC發(fā)生的重要誘因。多項研究表明，UC患者存在糞便異常及腸道菌群失調(diào)，其發(fā)病機制包括局部微脈管系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生趨化因子，引起白細胞游出，導致組織被金屬蛋白酶和其他活性物質(zhì)損傷，從而擴大炎癥反應，導致上皮屏障破壞，進而使更多的腸道有害菌產(chǎn)物進入血液系統(tǒng)導致發(fā)病[12]。

注：不同顏色表示不同的分類水平，圓圈的大小代表該分類的相對豐度大小；分類名下方的數(shù)字表示相對豐度百分率

圖6 屬水平中不同組的物種譜柱狀圖

腸道菌群的物種多樣性和豐富度是反映腸道菌群組成的重要指標[13]。本研究中模型組與正常組相比，核心微生物組數(shù)量下調(diào)，經(jīng)過治療后，白頭翁湯低、中、高劑量組，美沙拉嗪組核心微生物組數(shù)量均回調(diào)。人體腸道菌群90%由四大門組成，其中以厚壁菌門(49%～76%)與擬桿菌門(16%～23%)占據(jù)主要優(yōu)勢，其次是變形菌門及放線菌門[14-15]，大鼠優(yōu)勢菌門與人體相似，均以厚壁菌門、擬桿菌門為主，F(xiàn)/B可有效反映腸道菌群的紊亂情況。有研究表明，在急性UC的發(fā)病過程中F/B是顯著升高的[16]。此次研究中，模型組大鼠F/B較正常組升高，而經(jīng)過白頭翁湯以及美沙拉嗪干預后出現(xiàn)回調(diào)，其中以白頭翁湯中劑量組和美沙拉嗪組回調(diào)幅度最大，表明白頭翁湯和美沙拉嗪在一定程度上可以改善腸道紊亂的情況。

普氏菌屬和乳桿菌屬作為人體腸道中重要的益生菌屬，普氏菌屬主要參與了碳水化合物以及植物蛋白的分解及代謝過程[17]；乳桿菌屬可使腸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生有益的變化[18]，其可以抑制腸道炎癥因子的產(chǎn)生。有研究表明，腸道內(nèi)丙二醛水平與乳桿菌屬水平呈負相關，白細胞介素10指標與乳桿菌屬則呈正相關[19]。在本次研究對屬水平的觀察中，筆者發(fā)現(xiàn)模型組大鼠普氏菌屬與乳桿菌屬豐度明顯下降，但經(jīng)過白頭翁湯及美沙拉嗪干預后均出現(xiàn)回調(diào)，普氏菌屬以美沙拉嗪組回調(diào)幅度最大，乳桿菌屬以白頭翁湯中劑量組回調(diào)幅度最大。故白頭翁湯和美沙拉嗪可能通過增加普氏菌屬和乳桿菌屬等益生菌的豐度，恢復腸道吸收功能，減少丙二醛炎癥因子的合成，增加白細胞介素10抑炎因子的釋放，進而間接或者直接地治療UC。

綜上所述，腸道濕熱貫穿了UC的發(fā)病始末，治療上應以清熱利濕為原則，藥用苦寒燥濕之品，方可用白頭翁湯治療[20]。本研究通過白頭翁湯對比美沙拉嗪干預治療UC大鼠，發(fā)現(xiàn)不同濃度的白頭翁湯對該病的治療效果具有差異性，白頭翁湯中劑量組療效更接近于美沙拉嗪組。白頭翁湯和美沙拉嗪均可能通過回調(diào)發(fā)病大鼠腸道菌群物種豐富度和多樣性，增加普氏菌屬和乳桿菌屬等益生菌的豐度，從而減輕炎癥反應，恢復腸道吸收功能，達到對UC的治療。但中藥復方成分多樣，其作用機制復雜，課題組還需進一步設計實驗，通過中藥網(wǎng)絡分析法在分子水平上去探究白頭翁湯治療UC的作用靶點，并利用糞菌移植驗證和篩選出可能與UC發(fā)病相關的靶菌，為白頭翁湯治療UC提供更為可靠的理論依據(jù)。