妊娠期肝內膽汁淤積癥JNK信號通路的動物實驗研究

郁平 姬小凡 王敏 徐曉艷

妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)是妊娠期常見病，也是誘發(fā)胎兒窘迫、早產的重要原因，部分孕婦可能造成死胎等嚴重后果。ICP發(fā)生后肝臟正常代謝功能紊亂，近年來報道顯示，信號通路作用失調是ICP后引起肝功能異常的重要環(huán)節(jié)[1]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原蛋白激酶家族的重要成員，可介導肝內多種細胞的生長代謝。覃春美等[2]認為JNK異常激活可誘導肝細胞損傷，并影響肝內膽汁代謝。本研究建立ICP動物模型，分析JNK與ICP的關系，旨在進一步探討ICP發(fā)病機制，為臨床干預提供借鑒。

資料與方法

一、一般資料

實驗大鼠均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，納入40只清潔級SD雌性大鼠和10只雄性大鼠作為實驗動物，體質量(220.78±14.92)g，鼠齡(165.15±20.39)d；以充足飼料和清水常規(guī)喂養(yǎng)，在發(fā)情期將雌性和雄性大鼠按4∶1比例同籠喂養(yǎng)。觀察陰栓脫落情況，以陰栓脫落為妊娠成功。至妊娠第15 d，隨機將40只雌性大鼠分為觀察組和對照組，每組20只。觀察組體質量(225.76±18.23)g；鼠齡(174.47±16.79)d。對照組體質量(227.05±17.70)g；鼠齡(176.98±15.56)d。兩組大鼠體質量、鼠齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。

二、ICP建模

觀察組大鼠在常規(guī)喂養(yǎng)基礎上，自妊娠第15 d開始，自大鼠后肢皮下注射孕酮(國藥準字H31021265，上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格1 mL∶0.25 g已酸羥孕酮，5 mg戊酸雌二醇)，75 mg/(kg·d)，同時注射α乙炔雌二醇(美國Sijma公司提供，貨號：1260001，以1 mL精油配伍0.2 mg α乙炔雌二醇比例備制待用)，1.25 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥干預5 d。對照組大鼠繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)。兩組大鼠均在妊娠后第3周取眶靜脈取血1 mL，處死大鼠，取肝組織標本。

三、實驗室檢測

(一)血清總膽紅素(TBil)檢測 將眶靜脈血1 mL，3 000 r/min離心10min，取上清液，采用全自動血液生化分析儀檢測血清TBil水平。HD-F2600型生化分析儀由濟南漢方醫(yī)療器械有限公司提供。

(二)免疫印跡法 檢測磷酸化JNK：取50 mg大鼠肝組織，研磨后置入EP管中進行裂解，離心15 min后取上清液備用，取10 μL冷凍，室溫下解凍，PBS液溶解稀釋20倍，余上清液與5倍樣品緩沖液混合，按40 mL/管分裝，加熱變性5 min后冷卻備用。每孔加入200 μL工作液，混勻后37 ℃下孵育30 min，取微孔板，在550 nm下測量吸光度，計算蛋白濃度。

(三)免疫組化法 檢測大鼠肝組織JNK陽性細胞數：取大鼠肝臟石蠟標本，一次進行脫蠟、梯度水化及抗原修復處理，完成后漂洗，用5%BSA封閉液室溫封存標本1 h，去封閉液，以1∶50稀釋一抗抗體，滴入標本組織，4 ℃孵育過夜。去一抗液，漂洗，取切片，甩盡TBST液，滴加顯色液DAB工作液50 μL，室溫孵育15 min，觀察標本顏色，結果以陽性細胞數所占百分比和染色結果計分乘積評估結果，以得分≥4分為結果陽性[3]。具體評分標準為：陽性細胞數，無(0分)、<50%(1分)、50%～75%(2分)及>75%(3分)；染色結果，無(0分)、淺黃色(1分)、黃色(2分)及棕黃色(3分)。

四、觀察指標

記錄兩組大鼠TBil、JNK信號通路蛋白表達量及JNK陽性細胞數，比較兩組大鼠TBil水平、JNK信號通路及JNK陽性細胞數。

五、 統(tǒng)計學方法

結 果

一、兩組TBil和JNK

觀察組大鼠血清TBil和肝組織中JNK蛋白表達量分別為(8.94±2.58)μmol/L和1.57±0.48，對照組分別為(6.19±2.14)μmol/L和1.16±0.63，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為3.669和2.315；P值分別為0.001和0.026)。40只雌性大鼠TBil與JNK蛋白表達量呈顯著正相關(r=0.455，P=0.000)。見圖1。

圖1 TBil與JNK蛋白表達量線性關系分析

二、兩組免疫組化結果比較

觀察組大鼠JNK陽性者15只，占75%，對照組JNK陽性者7只，占35%。兩組小鼠JNK細胞陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.465，P=0.011)。

A：JNK陰性；B：JNK陽性

圖2大鼠肝組織JNK免疫組化染色結果(DAB200)

討 論

JNK屬促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，既往報道顯示，JNK存在3個不同編碼基因，其中JNK1和JNK2在各種組織中廣泛存在，并通過c-Jun、ATF2及p53等下游底物發(fā)揮生物學效應。JNK信號通路的調節(jié)主要依賴于MAPK激酶的識別和支架蛋白組合信號復合物[4]，從而介導細胞生長因子的代謝凋亡。傅應亞等[5]研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路可直接調控胞質內Bim和Bcl-2等靶蛋白的活性，是肝臟損傷重要的調控因子。ICP患者以肝細胞和膽小管的色素沉著為主要病理表現(xiàn)，隨著膽汁淤積的加重，逐漸發(fā)生肝組織損傷。膽汁淤積是JNK信號通路磷酸化重要的刺激因素，目前認為信號通路激活與功能蛋白表達相關[6]，本研究分析ICP大鼠模型TBil與JNK蛋白表達量的關系，發(fā)現(xiàn)二者具有正相關性，提示JNK的異常激活可能增加TBil水平，進而影響膽汁淤積癥患者肝功能狀態(tài)。另外，本研究還對比了兩組大鼠模型肝組織中JNK表達量，結果發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義，而陳秋玲等[7]的實驗結果也顯示，JNK抑制劑有助于調節(jié)膽汁酸轉運蛋白水平，進而改善膽汁淤積程度，說明JNK參與ICP過程，糾正JNK信號通路異常可能有助于改善臨床癥狀。

目前，臨床對JNK信號通路與ICP的關系尚未完全闡明，Vucur 等[8]一項報道認為，JKN異?？赡苁歉谓M織代償性增殖作用障礙的原因之一，影響肝臟自我修復功能，使肝功能持續(xù)降低，進而導致TBil異常升高，膽汁淤積。同時膽汁酸可激活TGR5膽汁酸受體，抑制JNK和Caspase復合物的形成，并上調死亡受體5表達水平，誘導肝細胞損傷和肝纖維化進程，因而推測JNK信號通路異常與膽汁酸可能存在相互作用關系，使ICP持續(xù)進展。ICP孕婦胎盤微絨毛數量減少，部分內質網相互融合而成束狀，滋養(yǎng)細胞發(fā)生固縮，這些變化使胎盤物質交換效能降低，成為膽汁淤積的誘因。而JNK不僅參與肝細胞增殖分化，而且對細胞形態(tài)和骨架的維持具有調控作用，Dada等[9]認為JNK同源重組基因敲除會使其上游調節(jié)分子缺失，并加快病程進展，這也說明JNK信號通路在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因而，對于ICP患者，JNK信號通路的正常調控有助于改善膽汁酸代謝，緩解膽汁淤積狀態(tài)。另外，JNK還可能與Smad、ERK等其他信號通路相互作用，形成復雜的調控網絡，起到加強調控的作用，這有待于今后進一步深入研究。