聚乙二醇/聚乙烯亞胺共修飾超順磁性納米粒靶向遞送多柔比星對腦膠質(zhì)瘤大鼠的影響

胡禮聰，吳奮飛，包華健

(浙江省麗水市中心醫(yī)院藥劑科，麗水 323000)

近年來，超順磁性納米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)作為一種新型藥物載體而被廣泛用于疾病的治療，尤其是在腫瘤靶向治療領(lǐng)域[1-2]。其特有的超順磁性可被用于磁靶向治療，通過外加磁場直接將藥物靶向到腫瘤部位，從而實現(xiàn)靶向治療。國內(nèi)外研究報道證實：在一定外磁場的作用下，SPIONs可以穿過血-腦屏障(blood brain barrier，BBB)，這為其成為腦部疾病的藥物遞送載體提供強有力的基礎(chǔ)[3]。此外，裸露的SPIONs表面通過適當(dāng)?shù)男揎椏烧{(diào)節(jié)和改變磁性納米粒的穩(wěn)定性和分散性，提高其抗氧化性，還可以為納米粒提供表面功能性，如生物相容性、接枝反應(yīng)活性及特異性識別等功能[4]，這些優(yōu)點都使SPIONs成為腦膠質(zhì)瘤藥物治療的最佳載體。本次實驗在前期研究基礎(chǔ)上以SPIONs作為多功能納米顆粒的核心，用于磁靶向，將新型材料聚乙二醇/聚乙烯亞胺(PEG/PEI)涂覆在SPIONs的表面，構(gòu)建新型的PEG-PEI修飾SPIONs，以減少巨噬細胞對SPIONs的吞噬，延長SPIONs在血液中的循環(huán)時間，同時又為化學(xué)治療(化療)藥物提供載藥位點。然后以傳統(tǒng)化療藥物多柔比星(doxorubicin，DOX)為模型藥物通過靜電吸附的方法載入上述修飾后的SPIONs中，輔助以外磁場的引導(dǎo)，克服BBB屏障，將藥物靶向遞送到腦部腫瘤組織，實現(xiàn)膠質(zhì)瘤的靶向藥物治療。通過在核磁共振影像學(xué)(MRI)、離體組織病理學(xué)等方法綜合評價新型載藥SPION結(jié)合外加磁場對腦膠質(zhì)瘤靶向藥物治療的效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠48只，購于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2015-0001，合格證號：wydw2013-0050，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為 21～23℃，相對濕度為 57%～65%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h，潔凈度一萬級，噪音≤60 dB，照度150～300 Lx，自由攝食飲水。

1.2試藥 鹽酸多柔比星(阿拉丁試劑有限公司，批號：M0302A，含量：98%)，聚乙二醇(PEG，相對分子質(zhì)量1000，汕頭市西隴化工有限公司，批號：20120413)，聚乙烯亞胺(PEI，相對分子質(zhì)量1800，阿拉丁試劑有限公司，批號：20120413，含量：99%)，乙酰丙酮鐵[TCI(東京)化成工業(yè)株式會社，批號：F1518083，含量：>98%]，大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞(資源編號：3131C0001001000001，中國科學(xué)院上海細胞庫)。

1.3實驗儀器 磁鐵(圓盤狀，直徑2 cm，磁場強度0.3T，廣州捷瑪磁鐵材料廠)，JEM-1230透射電子顯微鏡(日本電子公司)，納米粒度Zeta電位分析儀(ZEN 3690，英國Malvern儀器公司)，WDT-V型腦立體定向儀，小型顱鉆，ST-III型三維手動推進儀 (西安西北光電醫(yī)療器械廠)；Signa3.0T磁共振成像儀(GE公司)；大鼠掃描專用線圈(上海晨光公司)。

1.4PEG/PEI修飾的DOX-SPIONs合成及其表征 鐵源為乙酰丙酮鐵[Fe(acac)3]，通過高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽銼PIONs。為了減少裸露SPIONs的毒性，課題組以PEG為溶劑，PEI為添加劑制備PEG/PEI共同修飾的SPIONs(PEG/PEI-SPIONs)，見圖1。再將處方量多柔比星(doxorubincin，DOX)通過物理吸附和靜電吸附的方法載入SPIONs里面，最后用磁性分選柱分選出載藥納米粒，同時收集未載入的DOX溶液，使用紫外分光光度法測定載藥量和包封率。包封率(%)=載藥納米粒中DOX含量/總DOX含量×100%；載藥量(%)=載藥納米粒中DOX含量/載藥納米粒的總量×100%。

圖1 新型PEI-PEG修飾的SPION示意圖

Fig.1SyntheticschematicofthenewPEG/PEIco-modifiedSPIONs

透射電子顯微鏡(TEM)對樣品的物相結(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)進行表征，馬爾文激光粒度儀測量樣品的Zeta電位值和水合動力學(xué)粒徑。

體外藥物累計釋放度是評價納米藥物載體的重要指標(biāo)之一，本次實驗還檢測DOX-SPIONs在不同pH值的PBS緩沖液中(pH值5.0，6.0，7.4)的體外累計釋放度。具體方法簡述如下：精密稱取2 mg的DOX-SPIONs溶解到釋放介質(zhì)4 mL中，然后轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留相對分子質(zhì)量8000)。將透析袋轉(zhuǎn)移到50 mL釋放介質(zhì)中，在37 ℃磁力攪拌條件下進行透析，于不同時間點取袋外透析介質(zhì)2 mL，同時補充等體積PBS溶液，透析液過孔徑0.45 μm微孔濾膜，測定DOX含量，計算累計釋放度。

1.5大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立及評價 參考文獻[5]中大鼠腦膠質(zhì)瘤建模方法：調(diào)整C6細胞數(shù)為106·(10 μL)-1，用錐蟲藍排斥實驗檢測細胞活力>95%。大鼠腹腔注射10%戊巴比妥鈉0.5 mL·(100 g)-1麻醉，剪去頭頂部毛發(fā)，內(nèi)毗連線與頭部矢狀中線交匯處縱向1 cm長頭皮切口，分離暴露顱骨。于冠狀縫與矢狀縫交點向前1 mm，右旁開3 mm鉆孔，牙科鉆外帶塑料套管，僅允許鉆頭鉆透顱骨深1.0～1.5 mm，以防止穿透硬腦膜。微量注射器吸入上述細胞懸液10 μL，固定于立體定位儀上，沿鉆孔垂直進針深6 mm(距硬腦膜，即大腦右側(cè)紋狀體區(qū))，退出1 mm，緩慢注射C6細胞懸液，持針10 min后緩慢拔針，骨孔用無菌骨蠟封閉。術(shù)后采用0.9%氯化鈉溶液沖洗，切口用線縫合，兩針打結(jié)，切口消毒。手術(shù)均在手術(shù)間無菌下操作。手術(shù)結(jié)束后，由實驗動物中心按SPF級分組單籠飼養(yǎng)。

接種后，每日觀察荷瘤鼠意識、飲食、睡眠及自主活動等情況。各組大鼠于接種后第8天行在體MRI檢測，評價大鼠腦膠質(zhì)瘤建模效果，同時記錄大鼠生存時間，觀察偏癱、衰老和癲等晚期癥狀。

1.6實驗分組及藥物干預(yù)形式 為了證實在外加磁場的輔助作用下超順磁性納米粒作為藥物載體遞送藥物至腦膠質(zhì)瘤的治療效果，本實驗將上述48只腦膠質(zhì)瘤SD大鼠隨機分為4組，每組12只。對照組：大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液；DOX組：大鼠經(jīng)尾靜脈注射DOX溶液6 mg·kg-1；DOX-SPIONs組：大鼠經(jīng)尾靜脈注射包載DOX的超順磁性納米粒溶液6 mg·kg-1；DOX-SPIONs+MF組：大鼠經(jīng)尾靜脈注射包載DOX的超順磁性納米粒溶液6 mg·kg-1后外加磁鐵，磁鐵作用1 h。

給藥從造模成功的第9天開始，每周2次(星期一和星期四)，連續(xù)給藥4周，總共給藥8次。具體治療方法簡述如下：腦膠質(zhì)瘤SD大鼠經(jīng)腹腔注射10%戊巴比妥鈉0.5 mL·(100 g)-1，5 min麻醉后進行實驗。將大鼠顱蓋骨上的毛發(fā)剔去，放置俯臥位。按照上述分組，經(jīng)尾靜脈注射給予相關(guān)藥物。DOX-SPIONs+MF組大鼠外加磁場干預(yù)，將直徑2 cm的圓形磁鐵固定于腦膠質(zhì)瘤部位，進行磁靶向引導(dǎo)作用，磁場強度0.3 T，作用時間1 h。

1.6MRI檢測各組大鼠腦膠質(zhì)瘤生長情況 將實驗組及對照組大鼠于接種后第8，15，22，29天行MRI檢查，確認腫瘤生長情況，確定C6膠質(zhì)分化程度(WHO分級)和腫瘤界限。MRI常規(guī)及增強掃描：經(jīng)10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后仰臥位固定。采用成像儀，大鼠掃描專用線圈，尾先進。MRI成像包括橫斷面及冠狀面T1WI、T2WI及增強T1WI檢查。為了獲得更清晰更直觀的增強圖像，增強檢查經(jīng)鼠尾靜脈注射釓噴替酸葡胺(Gd-DTPA)0.4 mmol·kg-1，10 min后進行。掃描條件：T1WI TR 560 ms，TE 27 ms，激勵次數(shù)(NEX)2，矩陣256×256；T2WI TR 2300 ms，TE 110 ms，NEX 2，矩陣256×256；掃描層厚2.4 mm，層間距2.9 mm，視野(FOV)56 mm×70 mm，腫瘤體積=(4/3×π×W×H×L)×1/8，單位為mm3。

1.7蘇木精-伊紅(HE)染色 藥物干預(yù)結(jié)束后，處死大鼠，取腦組織冠狀切片，用常規(guī)石蠟包埋，行HE染色。將大鼠腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋、切片后，將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟15 min，新鮮二甲苯中繼續(xù)脫蠟15 min，100%乙醇5 min，新鮮100%乙醇5 min，80%乙醇5 min，純化水5 min，蘇木精染色5 min，流水洗去蘇木精液3 s，1%鹽酸乙醇3 s，水洗30 s，純化水過洗2 s，0.5%伊紅液染色2 min，純化水洗2 s，80%乙醇稍洗2 s，95%乙醇3 s，新鮮95%乙醇5 s，無水乙醇7 min，石炭酸二甲苯7 min，二甲苯2 min，新鮮二甲苯2 min，再次換新鮮二甲苯2 min，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察有無組織出血壞死表現(xiàn)。

1.8錐蟲藍染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，純化水洗1 min，切片入錐蟲藍染液浸染30 min，純化水充分沖洗5 min，入伊紅染色液，淡染細胞核30 s，自來水沖洗5 s，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，顯微鏡下考察腫瘤部位的鐵含量。

1.9TUNEL凋亡染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟，在37 ℃下滴加20 μg·mL-1不含DNA的蛋白酶K處理30 min，PBS洗滌3次。避光，加Tunel反應(yīng)液(酶溶液：標(biāo)記液=1：9)，37 ℃孵育60 min。用PBS洗滌3次，滴加DAPI染色液，室溫孵育10 min。用PBS洗滌3次。抗熒光猝滅劑封片后顯微鏡下觀察各組大鼠腫瘤細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1DOX-SPIONs的性狀表征結(jié)果 DOX-SPIONs的透射電鏡檢測結(jié)果見圖2。DOX-SPIONs納米粒分散均勻、形態(tài)圓整近似球形，平均粒徑約為15.4 nm。該結(jié)果證明制備得到的磁性納米粒粒徑小，對稱分布，適合作為藥物載體。圖3為空白及載藥磁性納米粒的磁滯曲線測定結(jié)果，磁滯曲線表明，SPIONs和DOX-SPIONs的飽和磁化值分別為45.8 emu·g-1和23.6 emu·g-1，說明本次實驗制備的空白及載藥磁性納米粒都具有較好的超順磁性。同時，馬爾文激光粒度儀測定DOX-SPIONs在不同介質(zhì)中的水合動力學(xué)粒徑測定結(jié)果見圖4，載藥磁性納米粒不僅能夠長時間穩(wěn)定分散在PBS溶液中，也可以在生理條件下穩(wěn)定分散，水合粒徑變化較小，進一步說明DOX-SPIONs在近生理條件下是穩(wěn)定的。

圖2 SPIONs納米粒透射電鏡及粒徑分布

Fig.2TEMimagesandsizedistributionsoftheSPIONs

圖3 空白及載藥納米粒在室溫條件下的磁滯曲線

Fig.3MagnetichysteresiscurveofblankandDOX-loadedSPIONsatroomtemperature

圖4 DOX-SPIONs在不同介質(zhì)中的水合粒徑

Fig.4Hydrationdiameter(Dh)ofDOXSPIONsafterincubationwithdifferentmedium

紫外分光光度法測定DOX-SPIONs包封率(81.3±1.3)%，載藥量(36.3±0.8)%。DOX-SPIONs體外累計釋放度測定結(jié)果見圖5。pH值為5.0，48 h時，DOX從DOX-SPIONs中累計釋放量達到90%以上，而pH值為7.4時，累計釋放量只有接近25%，說明載藥納米粒具有pH值響應(yīng)性，能在酸性條件下靶向釋藥。

2.2大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的MRI評價結(jié)果 本研究采用腦立體定位法將C6細胞定量接種在SD大鼠右側(cè)尾狀核，建模后8 d行MRI檢測。結(jié)果見圖6。各組大鼠腫瘤細胞接種8 d后可明顯觀察到大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤，通過臨床診斷手段證明建模方法切實可行，可用于后期的藥效評價。

圖5 DOX-SPIONs在pH值5.0，6.0，7.4條件體外累計釋放度測定結(jié)果

Fig.5InvitroreleaseprofilesofDOXfromDOX-SPIONsinmediaofpH5.0.pH6.0andpH7.4

2.3MRI在體測定腫瘤體積及動物生存期監(jiān)測結(jié)果 本次實驗通過MRI實時測定各組大鼠腫瘤體積，評價DOX-SPIONs結(jié)合外加磁場是對于腫瘤生長的抑制效果，結(jié)果見圖7，8。結(jié)果表明：對照組中，大鼠腫瘤平均體積由第8天(10.12± 6.08) mm3快速增長至第29天(705.75± 86.33) mm3，相對腫瘤體積從第8天的1增長到第29天的(69.78±6.28)(P<0.01)。同時，與第8天比較，第29天時，DOX溶液組，DOX-SPIONs組相對腫瘤體積分別為(60.39±4.43)和(50.46±3.96)(均P<0.01)。DOX-SPIONs+MF組腫瘤體積從第8天(10.35±4.88) mm3增長到第29天(10.18±3.67) mm3，增長倍數(shù)為(0.9±1.19)。第29天時，與其他組比較，DOX-SPIONs+MF組大鼠腫瘤體積顯著減小(P<0.05)，上述實驗結(jié)果可以證明，磁場結(jié)合DOX-SPIONs可有效抑制腦腫瘤的生長。

中位生存期結(jié)果顯示，DOX-SPIONs+MF組平均中位生存期為(76.2±1.8) d，對照組為(22.8±2.4) d，DOX溶液組為(38.4±2.1)d，DOX-SPIONs組為(44.8±1.7) d(均P<0.05)。

圖6 MRI在體評價大鼠腦膠質(zhì)瘤建模效果

圖7 4組大鼠腫瘤組織MRI成像結(jié)果

2.4HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果表明荷瘤鼠經(jīng)不同治療后療效差異，結(jié)果顯示對照組，DOX溶液組和DOX-SPIONs組中腫瘤組織存在著過多的細胞，且具有明顯的多樣性細胞核(圖9)。然而，DOX-SPIONs+MF組腫瘤組織中腫瘤細胞明顯減少，且表現(xiàn)出明顯的細胞凋亡與壞死，此結(jié)果表明，DOX-SPIONs結(jié)合外磁場可導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，抗腫瘤療效最顯著。

2.5錐蟲藍染色結(jié)果 錐蟲藍染色可特異性鑒別組織中的鐵，從染色結(jié)果顯示對照組和DOX組腫瘤部位無藍色陽性點，DOX-SPIONs組腫瘤部位出現(xiàn)少量藍色陽性點，而DOX-SPIONs+MF組腫瘤部位出現(xiàn)明顯且較多的藍色陽性點，見圖10。該結(jié)果證明外磁場可以促進超順磁性納米粒在腫瘤部位的聚集，進一步說明超順磁性納米粒在外磁場的作用下可以實現(xiàn)靶向遞送藥物的作用。

2.6TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色考察藥物干預(yù)結(jié)束后各組大鼠腫瘤組織中細胞的凋亡情況。結(jié)果見圖11。圖11所示，凋亡細胞核呈綠色，未凋亡腫瘤細胞核呈藍色。結(jié)果表明：相比于DOX-SPIONs組及其他各個藥物干預(yù)組，DOX-SPIONs+MF組腫瘤細胞凋亡顯著增加，說明載藥PEG/PEI共修飾新型磁性納米粒結(jié)合外磁場能夠顯著促進腫瘤細胞凋亡。

圖8 4組腫瘤組織體積統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

Fig.8Resultsofvolumedetectionoftumorsfromfourgroupsofrats

3 討論

磁性納米粒因為具有較強的磁響應(yīng)性，為腫瘤的靶向治療提供新選擇。

與傳統(tǒng)靶向制劑相比，磁靶向制劑具有以下優(yōu)點：①具有被動靶向和物理靶向雙重靶向效果，能夠更好地實現(xiàn)靶向給藥的目的[6]。②穿越傳統(tǒng)藥物難以通過的血-腦屏障，提高腦內(nèi)藥物濃度，發(fā)揮腦靶向作用，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其他腦內(nèi)用藥開辟新途徑[7-8]。③載藥量高，增加藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，延長藥物作用時間，減少藥物用量。④可與腫瘤熱療聯(lián)合，達到聯(lián)合治療的效果[9]。

本課題創(chuàng)新性地使用PEG/PEI對超順磁性納米粒進行修飾以制備具有生物相容性及高載藥性的SPIONs，并將其裝載經(jīng)典抗癌藥物DOX，對載藥的納米粒進行表征分析，結(jié)果證明DOX-SPIONs形態(tài)完整、分布均勻，載藥量高。同時，藥物釋放度實驗結(jié)果證實：新型PEG/PEI在酸性條件下能夠加快釋藥，這可能是因為酸性條件下DOX與有機物分子之間的氫鍵被破壞，從而使DOX大量釋放出來。由于在大多數(shù)實體瘤中，腫瘤細胞的胞外pH值均較低，呈酸性環(huán)境，因此DOX-SPIONs的這種釋藥特性特別有利于腫瘤靶向藥物遞送，促進藥物在腫瘤部位靶向釋放，減少其毒副作用。同時為了進一步增加DOX-SPIONs的腫瘤靶向特性及血腦屏障穿透能力，課題組還結(jié)合外加磁場。通過后期的錐蟲藍染色結(jié)果證實應(yīng)用DOX-SPIONs+MF組干預(yù)治療后大鼠腦內(nèi)鐵含量相比于其他各種干預(yù)形式明顯增加，說明應(yīng)用DOX-SPIONs結(jié)合外磁場能夠更好的實現(xiàn)DOX的靶向藥物遞送。

另外，通過后期動物實驗，課題組還從臨床MRI影像學(xué)方面和分子病理水平方面對DOX-SPIONs+MF在腦膠質(zhì)瘤的治療進行評價。MRI檢測及中衛(wèi)生存期實驗結(jié)果證實，相比于其他各種形式藥物干預(yù)治療，應(yīng)用外磁場結(jié)合新型PEG/PEI修飾超順磁性納米?？梢杂行y帶藥物進入腫瘤部位，顯著延長荷瘤鼠生存期，抑制腫瘤的生長。同時，與在體影像學(xué)評價結(jié)果相一致，腫瘤組織HE染色及TUNEL凋亡結(jié)果顯示：與其他各個治療組比較，DOX-SPIONs+MF組大鼠29 d后腫瘤區(qū)域腫瘤細胞出現(xiàn)大量凋亡、腫瘤細胞顯著減少，說明DOX-SPIONs+MF的治療模式能夠顯著增加腫瘤靶組織中DOX濃度，發(fā)揮其抗腦膠質(zhì)瘤的效果。這可能是由于pH值響應(yīng)與磁靶向的雙重作用，使得載藥納米粒穿透BBB，在腫瘤區(qū)域靶向釋藥，顯著增加腫瘤中DOX濃度，從而實現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的靶向治療。

圖9 4組大鼠腫瘤組織HE染色(×400，n=6)

圖10 4組大鼠腫瘤組織錐蟲藍染色圖(×400，n=6)

藍色：未凋亡細胞核；綠色：凋亡細胞核。

圖11 4組大鼠腫瘤組織TUNEL凋亡染色分析(×400，n=6)

Blue: normal cell nuclei, DAPI.Green: apoptosis cell nuclei.

圖11TUNELanalysisontumorsfromfourgroupsofrats(×400，n=6)

本次實驗開發(fā)了一種新型多功能的PEG/PEI共修飾的SPIONs結(jié)合外磁場遞送傳統(tǒng)化療藥物DOX實現(xiàn)膠質(zhì)瘤的靶向治療。本研究中制備的SPIONs不僅具有pH值響應(yīng)性，還能對外部施加的磁場快速響應(yīng)，從而提高載體攜帶藥物跨血腦屏障至腦膠質(zhì)瘤部位的效率。該系統(tǒng)顯著增強腦膠質(zhì)瘤中的藥物分布，顯示出高效的抗腫瘤效果，同時并由于該載體的低毒性，顯著延長荷瘤鼠的生存時間，證明功能性的SPIONs可以用作抗腫瘤藥物的潛在載體[10]。該方案實現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的靶向治療目的，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了一條新的思路，并為后期的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。