復(fù)方芪芎顆粒對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用*

陳利鋒，楊晨曦，王華松，盧綺萍，夏瑩，董望梅

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)研究生處，武漢 430061；3.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，武漢 430070；4.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科，武漢 430070； 5.湖北省中醫(yī)院心電圖室，武漢 430061；6.武漢市蔡甸區(qū)大集街衛(wèi)生院，武漢 430113)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，嚴(yán)重時(shí)可引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[1]。RA的病程越長，病患?xì)埣猜试礁摺８鶕?jù)曾小峰等[2]調(diào)查，我國RA患者在患病前5年致殘率為18.6%，病程每增加5年，致殘率分別上升為43.5%，48.1%，61.3%。此外，RA并發(fā)的其他基礎(chǔ)疾病，使得RA患者與一般人群相比有著更高的病死率[3]。RA的高致殘率及并發(fā)癥給患者帶來極大的心理壓力，也給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上治療RA主要依靠非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥物及糖皮質(zhì)激素等[4]，但常因藥物的不良反應(yīng)、價(jià)格等因素，難以堅(jiān)持長期服藥。近年來，中醫(yī)藥的治療作用在臨床上越來越受重視，白芍總苷、青藤堿等中草藥提取物治療RA的出現(xiàn)，給中醫(yī)藥治療RA帶來新思路[5]。

古代醫(yī)書中的“尪痹”“痹證”即為RA，古人認(rèn)為痹癥多因自身正氣不足，再加外感風(fēng)寒濕邪而致病，故治宜“祛邪活絡(luò)，緩急止痛”。復(fù)方芪芎顆粒是由“補(bǔ)陽還五湯”化裁而成，具有“活血通絡(luò)，行氣止痛”之功效。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其可顯著改善佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，其機(jī)制可能是與下調(diào)白細(xì)胞介素15(interleukin 15，IL-15)、白細(xì)胞介素33(interleukin 33，IL-33)等表達(dá)有關(guān)[6]。筆者在本研究新增檢測Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白與TLR2 mRNA，進(jìn)一步闡明復(fù)方芪芎顆粒對于RA大鼠滑膜炎的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠60只，月齡2～3個(gè)月，體質(zhì)量200～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCKK(鄂)2008-0005。分組前先行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 制備復(fù)方芪芎顆粒：黃芪、川芎各40 g，牛膝、紅花、桃仁、當(dāng)歸、益母草各15 g，獨(dú)活、秦艽、羌活、荊芥、小羅傘、六棱菊、香附各10 g，藥物由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中藥房提供，劉輝副教授進(jìn)行中藥鑒定。將藥材以適量純化水煎煮兩次，將兩次收集到的藥液均勻混合，高溫濃縮后烘干，搗碎成中藥粉末(每克粉末相當(dāng)于生藥4.64 g)。雷公藤多苷片(黃石飛云制藥有限公司，批號：20150901)。

1.1.3試藥 異硫氰酸胍(Aidlab公司，批號：252250AX)；完全弗氏佐劑(CFA，Sigma-Aldrich公司，批號：F-5881)；逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase，GeneCopoeia公司，批號：CO2010A)、緩沖液(RT Reaction Buffer，GeneCopoeia公司，批號：CO2010A)；dNTP 混 合 物 (dNTP Mixture，Tingen公司，批號：LOTb M1123)；核糖核酸酶抑制因子(RNase Inhibitor，TransGen公司，批號：LOTbI2122)；All-in-one tm qPCR Mix(Vazyme公司，批號：Cat#D01010A)；耐熱型DNA聚合酶(Takara公司，批號：D502A)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0010)；苯甲基磺酰氟化物(PMSF，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：ST506)、蛋白marker(北京全氏金生物技術(shù)有限公司，批號：IPVH00010)；RIPA 裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B)；BSA標(biāo)準(zhǔn)品(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0010)；兔抗TLR2(Abcam公司，批號：ab13867)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054)；兔抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R 001)；電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物液(Thermo公司，批號：NCI5079)。

1.1.4儀器 X線膠片(柯達(dá)公司，批號：XBT-1)；顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)公司)；游標(biāo)卡尺(山東儀器廠)；7900/Viia7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Illumina公司)；752型分光光度計(jì)(上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司)；JY02S型紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；muLISKANMK3型酶標(biāo)儀(Thermo公司)；HI650型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組與造模 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分別稱定質(zhì)量、做標(biāo)記，以體質(zhì)量為分層因素隨機(jī)均分為空白對照組，模型對照組，復(fù)方芪芎顆粒小劑量組，復(fù)方芪芎顆粒中劑量組，復(fù)方芪芎顆粒大劑量組，雷公藤多苷組。按常規(guī)制備方法制備佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[7]。造模大鼠在其右后足墊皮下注射CFA 20 μL，空白對照組于相同位置注射0.9%氯化鈉溶液20 μL，在第3天，第7天再次注射。

1.2.2給藥 造模2周后，開始持續(xù)灌胃給藥3周，用藥劑量參照成人臨床用藥劑量，以體表面積法換算為大鼠等效劑量[8]。空白對照組和模型對照組每日予以純化水10 mL·kg-1，灌胃1次；復(fù)方芪芎顆粒小、中、大劑量組：將藥物粉末充分溶于純化水后，分別予0.01，0.02，0.03 g·mL-1復(fù)方芪芎顆粒液10 mL·kg-1，每日一次；雷公藤多苷組：予以0.94 mg·kg-1雷公藤多苷片溶液10 mL·kg-1。

1.2.3主要觀察指標(biāo) 定期觀察大鼠右后足跖腫脹度，并于造模后2周、給藥后1周及給藥后3周，測量記錄各組大鼠右后肢足跖厚度。測量方法：限制大鼠活動后，將大鼠右后肢拉直，用記號筆在大鼠足跖中后1/3處測量處作標(biāo)記，以0～150 mm游標(biāo)卡尺測量。

1.2.4大鼠滑膜組織TLR2及MyD88蛋白的測定 在麻醉狀態(tài)下處死大鼠后，以膝關(guān)節(jié)為中心逐層切開分離，剝離可得髕骨下方一層呈淡黃色的組織，即為滑膜組織。蛋白印跡法(Western blotting)檢測TLR2和MyD88蛋白表達(dá)水平：將裂解液(含PMSF)400 μL加入到滑膜組織中，將裂解液4 ℃下 12000 r·min-1離心5 min，取上清液，分裝，置于-20 ℃條件下保存。將蛋白樣品、BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加入96孔板內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品各設(shè)2個(gè)平行孔，待測樣品設(shè)3個(gè)平行孔，每孔加入體積為20 μL。將BCA試劑盒中A液和B液進(jìn)行混合，加入96孔板內(nèi)，每孔加入200 μL。用酶標(biāo)儀測定波長568 nm吸光度值(A值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和A值計(jì)算出直線回歸方程，代入蛋白樣品A值，利用回歸方程計(jì)算樣品蛋白濃度。

將保存的上清液與緩沖液放入沸水中制備電泳膠，再將電泳膠固定到電泳槽上進(jìn)行恒壓電泳。取出凝膠切下目的條帶，沖洗后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液混勻，滴于聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘后，吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片，依次顯影、定影。沖洗晾干膠片后，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.2.5大鼠滑膜組織TLR2 mRNA表達(dá)水平的測定 先取大鼠滑膜組織，用Trizol法提取總RNA，再按步驟行TLR2 mRNA表達(dá)水平檢測。第一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 3.96 μg、Oligo (dT) 15 (10 μmol·L-1) 2 μL、dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL、ddH2O (Rnase free)加至14.5 μL，反應(yīng)條件：70 ℃ 5 min，短暫離心后置于冰上。再加入反應(yīng)物：第一次反應(yīng)體系中的PCR管全部14.5 μL、5×RT buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV reverse transcriptase 1 μL、ddH2O (RNase free)加至20 μL，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。第二步行半定量RT-PCR檢測，反應(yīng)體系：rat-actin F (10 μmol·L-1) 0.5 μL、dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL、Ex Taq 0.25 μL、10×Ex Taq E buffer 2.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O加至25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。最后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后行溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。TLR2及GAPDH PCR引物序列見表1。

表1 TLR2及GAPDH PCR引物序列及產(chǎn)物大小

Tab.1PCRprimersequencesandproductsizesofTLR2andGAPDH

基因名稱PCR引物序列上游引物下游引物產(chǎn)物大小/bpGAPDHACAGCAACAGGGTGGGTGGACTTTGAFFFTGCAGCGAACTT252TLR2TTATCCAGAGCCGTTGGTGCCCACTCGAGGTAGGTGTT171

2 結(jié)果

2.1關(guān)節(jié)炎大鼠造模成功且模型穩(wěn)定 造模2周后，各造模組大鼠足跖厚度數(shù)值均大于空白對照組(均P<0.05)。模型對照組大鼠在造模2周后、給藥1周、給藥2周，足跖厚度數(shù)值稍有變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2大鼠足跖厚度的比較 結(jié)果見表2。給藥3周后，模型對照組大鼠足跖厚度較空白對照組明顯上升(P<0.05)，而給予復(fù)方芪芎顆粒灌胃治療的大鼠，足跖厚度小于模型對照組(P<0.05)。復(fù)方芪芎顆粒大、中劑量組大鼠足跖厚度均小于小劑量組及雷公藤多苷組(P<0.05)。

表2 6組大鼠足跖厚度比較

組別造模后2周給藥1周后給藥3周后空白對照組0.43±0.330.46±0.040.45±0.56模型對照組0.91±0.24?10.90±0.410.93±0.03雷公藤多苷組0.92±0.23?10.79±0.040.71±0.03?2復(fù)方芪芎顆粒 小劑量組0.93±0.08?10.81±0.050.73±0.07?2 中劑量組0.89±0.34?10.77±0.05 0.51±0.15?2?3?4 大劑量組0.91±0.03?10.74±0.17 0.50±0.83?2?3?4

與空白對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05；與復(fù)方芪芎顆粒小劑量組比較，*3P<0.05；與雷公藤多苷組比較，*4P<0.05。

Compared with blank control group,*1P<0.05;Compared with model control group,*2P<0.05;Compared with low-dose compoundQixionggranule group,*3P<0.05;Compared with tripterygium glycosides group,*4P<0.05.

2.3各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、MyD88蛋白表達(dá)水平 各造模組大鼠滑膜組織TLR2、MyD88蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.05)。各給藥組TLR2、MyD88表達(dá)水平低于模型對照組(P<0.05)。與雷公藤多苷組比較，復(fù)方芪芎顆粒中、大劑量組TLR2、MyD88的蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表3。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.復(fù)方芪芎顆粒小劑量組；D.復(fù)方芪芎顆粒中劑量組；E.復(fù)方芪芎顆粒大劑量組；F.雷公藤多苷組。

圖1 6組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、MyD88蛋白表達(dá)水平

A.blank control group; B.model control group; C.low-dose compoundQixionggranule group; D.medium-dose compoundQixionggranule group; E.high-dose compoundQixionggranule group; F.Tripterygium glycosides group.

Fig.1ProteinexpressionlevelsofTLR2andMyD88insynovialtissuesofsixgroupsofrats

表3 6組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2和MyD88蛋白表達(dá)水平比較

組別TLR2MyD88空白對照組1.03±0.011.12±0.11模型對照組3.85±0.08?14.12±0.42?1雷公藤多苷組2.53±0.03?22.87±0.22?2復(fù)方芪芎顆粒 小劑量組2.78±0.06?22.98±0.31?2 中劑量組1.73±0.11?2?31.91±0.34?2?3 大劑量組1.63±0.41?2?31.78±0.24?2?3

與空白對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05；與雷公藤多苷組比較，*3P<0.05。

Compared with blank control group,*1P<0.05;Compared with model control group,*2P<0.05;Compared with Tripterygium glycosides group,*3P<0.05.

2.4大鼠滑膜組織中TLR mRNA的表達(dá)水平 給藥組TLR2 mRNA的表達(dá)水平明顯低于模型對照組(P<0.05)。雷公藤多苷組TLR2 mRNA的表達(dá)水平高于復(fù)方芪芎顆粒大、中劑量組(P<0.05)，與蛋白表達(dá)情況相似。見表4。

表4 6組大鼠TLR2 mRNA的表達(dá)情況

組別TLR2 mRNA空白對照組0.92±0.11模型對照組2.32±0.24?1雷公藤多苷組2.08±0.31組別TLR2 mRNA復(fù)方芪芎顆粒 小劑量組2.11±0.30 中劑量組1.42±0.23?2 大劑量組1.29±0.08?2

與空白對照組比較，*1P<0.05；與雷公藤多苷組比較，*2P<0.05。

Compared with blank control group，*1P<0.05；Compared with Tripterygium glycosides group，*1P<0.05.

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，其基本病理變化為小關(guān)節(jié)持續(xù)性滑膜炎，逐漸演變造成關(guān)節(jié)軟骨侵蝕和骨破壞[9]，最終導(dǎo)致肢體功能障礙。炎癥信號通路的研究一直是該疾病的熱點(diǎn)研究方向[10]，其中TLR/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是人體先天性免疫最重要的信號通路之一，此通路的過度表達(dá)被認(rèn)為在RA病程進(jìn)展中影響較大[11]。

SABER等[12]通過研究小鼠關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn)，在炎癥起始階段TLR2活化后促進(jìn)血管的發(fā)生，便于炎癥細(xì)胞黏附與侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨與骨破壞。HUANG等[13]發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)腔滑液中巨噬細(xì)胞與正常巨噬細(xì)胞相比，高表達(dá)TLR2。而MyD88是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，負(fù)責(zé)承接上游 TLRs 活化信號和募集下游的含有死亡區(qū)域(death domain，DD)的信號分子[14]，最終導(dǎo)致炎癥因子的釋放。PARK等[15]發(fā)現(xiàn)阻斷MyD88可改善RA患者臨床癥狀和炎性指標(biāo)，也說明MyD88在TLR和細(xì)胞炎性因子之間的橋梁作用。本課題組前期研究[16]發(fā)現(xiàn)TLR2在RA模型大鼠滑膜組織中高度表達(dá)，經(jīng)復(fù)方芪芎顆粒干預(yù)后，大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕，且TLR2蛋白的表達(dá)也受到明顯抑制，也說明TLR2蛋白過度表達(dá)在RA的病程進(jìn)展中起到重要作用。

針對RA的新藥開發(fā)一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，近年來國外醫(yī)藥公司不斷推出新的生物制劑[17]，國內(nèi)學(xué)者亦致力于中藥復(fù)方的開發(fā)。敬博[18]應(yīng)用獨(dú)活寄生湯治療RA患者，可明顯縮短患者患肢晨僵時(shí)間、減輕關(guān)節(jié)疼痛。楊俏雯等[19]研究發(fā)現(xiàn)患者服用黃芪桂枝五物湯，其關(guān)節(jié)炎癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均優(yōu)于口服來氟米特片。

復(fù)方芪芎顆粒以經(jīng)典的臨床有效方劑補(bǔ)陽還五湯[20]為基礎(chǔ)，在原方基礎(chǔ)上增加具有祛濕止痛功效的中藥，如獨(dú)活、秦艽等。前期實(shí)驗(yàn)研究[6，21]表明其可通過下調(diào)IL-8、IL-15、IL-33、核因子κB(nuclear factor-kappa-B，NF-κB)等細(xì)胞因子起到抑制RA進(jìn)程的作用，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示其具體機(jī)制可能是通過抑制TLR2/MyD88途徑，從而達(dá)到調(diào)控下游各細(xì)胞因子的作用。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中、大劑量復(fù)方芪芎顆粒對改善RA大鼠的足跖腫脹程度作用明顯，能明顯抑制大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、MyD88蛋白及TLR2 mRNA的表達(dá)，其可能的機(jī)制為抑制滑膜組織中TLR2/MyD88信號通路。