羅格列酮對哮喘小鼠氣道炎癥因子及MUC5ac蛋白表達水平的影響*

楊紅霞，張建勇，趙建軍，陳玲，鄭飛彥，畢海，張紅

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸二科，遵義 563003)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)常見病和多發(fā)病之一，氣道慢性炎癥、氣道重塑、氣道黏液高分泌及氣道高反應性為其主要特征[1]。其中氣道黏液高分泌可阻塞氣道，從而使氣道處于高反應狀態(tài)，同時可加重呼吸困難和引起呼吸道感染，增加哮喘發(fā)病率和死亡率。氣道黏液高分泌的主要機制為氣道上皮杯狀細胞增生及產生的黏蛋白高表達，而黏蛋白MUC5ac過度表達被認為是氣道上皮杯狀細胞增生及高分泌的標志[2]，因此氣道MUC5ac表達水平可一定程度反映氣道黏液高分泌的強度。羅煒等[3]報道，MUC5ac的表達與炎癥因子白細胞介素(IL)-5、IL-13及腫瘤壞死因子(TNF)-α密切相關。羅格列酮是高選擇性過氧化物酶體增殖活化受體γ(peroxidosome proliferation activates receptor gamma，PPAR-γ)的外源性強力配體激動劑，具有調控炎癥反應因子的作用[4]。目前關于羅格列酮灌胃對哮喘小鼠氣道炎癥因子及MUC5ac表達水平的影響的研究較少，筆者在本研究中探討羅格列酮對哮喘氣道黏液高分泌的治療作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性BALB/c小鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(滬)2011-0005，體質量(18±2) g，6～8周齡。飼養(yǎng)條件：濕度40%～70%，室溫22～25 ℃，清潔級環(huán)境，自由飲水，無卵蛋白(ovalbumin，OVA)進食。清楚小鼠免疫遺傳背景，個體之間差異較小，對OVA的反應穩(wěn)定，可速發(fā)相哮喘及遲發(fā)相哮喘反應，適合過敏性哮喘動物模型的制作。動物實驗在遵義醫(yī)學院藥理實驗室完成，經遵義醫(yī)學院動物實驗委員會批準，實驗設計符合有關動物保護原則、實驗動物福利等倫理要求。

1.1.2試劑 雞卵清白蛋白(Ⅴ級，美國Sigma公司)，氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司)，羅格列酮片(天津葛蘭素史克有限公司)，阿爾新藍-碘酸雪夫(Alxin blue -periodie acid Schiff，AB-PAS)染色試劑盒 (上海源葉生物科技有限公司)，IL-5試劑盒(美國BioLegend公司)，IL-13、TNF-α試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)，小鼠抗小鼠-MUC5ac單克隆抗體(英國abcam公司)，免疫組化通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)，RNAiso Reagent、實時熒光定量(RT-PCR)試劑盒、RT-PCR引物(MUC5ac、TSLP、β-actin，大連TaKaRa公司)。

1.1.3儀器 壓縮霧化器L2160003(德國PARI公司)，電子分析天平(德國賽多利思公司，感量：0.1 mg)，高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)，Multiskan spectrum酶標儀(美國Thermo scientific公司)，光學顯微鏡(日本NIKON公司)，核酸蛋白測量儀ND-1000(美國Nanodrop公司)，Icycler iQ5熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動物分級與模型制備 30只小鼠隨機分為正常對照組、哮喘組和羅格列酮組，各10只。正常對照組小鼠分別于第1和第13天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，第19天起連續(xù)5 d每天超聲霧化吸入0.9%氯化鈉溶液8 mL，每天30 min，至第24天，無小鼠死亡。哮喘組和羅格列酮組分別于第1和第13天各腹腔注射致敏液0.2 mL(含OVA 60 μg和氫氧化鋁凝膠2.25 mg)致敏，第19天起連續(xù)5 d超聲霧化吸入OVA溶液(濃度為5%)8 mL激發(fā)，每天30 min，至第24天，共計20只小鼠成功構建哮喘模型，無小鼠死亡。

1.2.2給藥方法 羅格列酮組于第17天起每天給予小鼠羅格列酮片5 mg·kg-1(純化水溶解后1 mL)灌胃1次，第19天起給藥時間定于每次霧化激發(fā)前30 min，共連續(xù)灌胃7 d。正常對照組和哮喘組采用等劑量0.9%氯化鈉溶液1 mL灌胃。

1.2.3標本采集 小鼠于末次激發(fā)24 h后予以麻醉、固定并處死，開胸取右肺組織，其中右上葉和中葉肺組織置入EP管，保存于-70 ℃ 冰箱用于RNA提取，取右下葉肺組織放入多聚甲醛(濃度為4%)固定24 h，常規(guī)漂洗脫水，石蠟包埋，切片。頸部氣管充分暴露，作“V”型切口將留置針插入氣管，緩慢注入0.9%氯化鈉溶液0.3 mL于肺內，回抽灌洗液，灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)且置于EP管(高壓滅菌)，離心，上清液保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4肺組織病理學檢查及病理圖像分析 制備肺組織切片，根據試劑盒說明書行HE、AB-PAS染色，在普通光學顯微鏡下觀察。參照HENDERSON等[5]方法進行支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分，判斷標準：①無炎癥細胞(0分)；②少許炎癥細胞(1分)；③較多分布不均炎癥細胞(2分)；④大量炎癥細胞，分布較均勻，少見聚集成團(3分)；⑤大量炎癥細胞聚集成團(4分)；由兩位病理科醫(yī)生進行盲法閱片，每組測定≥25個氣道。AB-PAS染色：酸性黏液物質或細胞呈藍色，中性黏液物質或細胞呈紅色，混合黏液物質或細胞呈紫紅色，使用圖象分析軟件測量氣道杯狀細胞和黏液物質陽性相對著色面積。

1.2.5采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測IL-5、IL-13及TNF-α水平 按試劑盒說明操作，用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值，計算BALF中IL-5、IL-13及TNF-α的濃度。

1.2.6采用免疫組化(immunohistochemical，IHC)測定肺組織MUC5ac蛋白含量 常規(guī)脫蠟、水化，采用過氧化氫(濃度為3%)將內源性氧化酶去除，高壓修復抗原，其余操作嚴格按試劑盒說明書進行。陽性對照：已知陽性片，陰性對照：PBS代替一抗。MUC5ac黏蛋白單克隆抗體稀釋濃度為1：100。高倍鏡下，IHC染色呈棕黃色染色為陽性細胞。

1.2.7RT-PCR檢測小鼠肺組織MUC5ac mRNA水平 采用大連TaKaRa公司的Trizol試劑提取小鼠肺組織中的RNA，將mRNA逆轉錄成cDNA，以此為模板行RT-PCR擴增。設置MUC5ac mRNA引物序列：上游引物：5′- AATGGCGAGTCTGTGCAGGA-3′，下游引物：5′-CACCAGGTGTGGCATTGTGA -3′，擴增產物139 bp，β-actin上游引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCA AC-3′，下游引物：5′-ATGGAGCCACCGATCC ACA -3′，擴增產物171 bp。每一樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值(threshold cycle)。采用2-△△Ct法計算Muc5ac mRNA(△Ct=Ctβ-actin-Ct Muc5ac)的相對表達量。

2 結果

2.1各組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分比較 正常對照組、哮喘組和羅格列酮組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分分別為(0.24±0.44)，(3.12±0.67)和(1.72±0.68)分(氣道數n=25)，羅格列酮組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分較哮喘組降低，但仍高于正常對照組(F=135.540，P<0.01)。

2.2各組小鼠氣道上皮杯狀細胞和黏液物質AB-PAS染色結果 正常對照組、哮喘組和羅格列酮組AB-PAS染色陽性相對著色面積分別為(0.51±0.41)%，(12.41±4.69)%和(4.25±1.88)%(F=38.912，P<0.01)。在正常對照組小鼠氣道組織中極少觀察到杯狀細胞，黏液分泌較少；哮喘組小鼠染色后出現(xiàn)大量杯狀細胞，黏液大量分泌，其相對著色面積較正常對照組升高(t=6.146，P<0.01)；羅格列酮組氣道上皮杯狀細胞和黏液物質相對著色面積較哮喘組降低(t=5.107，P<0.01)，見圖1。

2.3各組小鼠BALF中炎癥因子水平比較 羅格列酮組小鼠BALF中IL-5、IL-13及TNF-α水平較哮喘組降低，但仍然高于正常對照組(F=863.466，57.324，42.335，P<0.01)。見表1。

2.4各組小鼠肺組織MUC5ac蛋白和MUC5acmRNA含量比較 IHC染色顯示MUC5ac蛋白陽性表達主要在氣道上皮杯狀細胞及管腔內；羅格列酮組小鼠肺組織MUC5ac蛋白和mRNA含量較哮喘組降低，但仍高于正常對照組(F=327.786，129.086，P<0.01)。見表2和圖2。

3 討論

哮喘的臨床常見癥狀為喘息、氣促、胸悶、咳嗽，其發(fā)生的病理學基礎為肺組織病理學變化[6]。小鼠的哮喘癥狀主要表現(xiàn)為呼吸急促、焦躁不安、抓鼻、腹肌痙攣等異常行為[7]。本研究通過OVA致敏成功建立哮喘BALB/c小鼠模型，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸異常等哮喘癥狀，同時可見撓癢、抓鼻等過敏癥狀。在OVA激發(fā)時給予小鼠羅格列酮灌胃，哮喘小鼠未發(fā)生明顯的哮喘癥狀。肺組織病理學結果顯示，羅格列酮組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分較哮喘組降低，但仍高于正常對照組。提示羅格列酮可改善哮喘BALB/c小鼠的肺組織病理狀況。

哮喘是多種炎癥因子參與的氣道慢性炎癥疾病，其關鍵的效應細胞為嗜酸性粒細胞(eosinophile granulocyte，EOS)和T淋巴細胞[8]。正常情況下，Th1/Th2免疫應答處于平衡狀態(tài)，而支氣管哮喘患者Th1/Th2免疫應答失衡，導致炎癥因子IL-5、IL-13過度產生。IL-5是調節(jié)EOS功能最重要的細胞因子，其參與EOS活化、成熟、存活和募集至氣道的整個過程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠BALF中IL-5水平顯著高于正常對照組，胡志紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-5水平上調，嗜酸粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)水平也隨之升高。由此說明，IL-5水平升高可作為反映哮喘發(fā)作的重要指標。IL-13對嗜酸粒細胞趨化因子的合成具有上調作用，而嗜酸粒細胞趨化因子能激活EOS并誘導其聚集于炎癥部位[11]。此外，IL-13能誘導氣道黏蛋白MUC5ac及其mRNA的表達[12]，從而誘導呼吸道杯狀細胞增生和黏液過度分泌。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠BALF中IL-13水平顯著高于正常對照組，說明IL-13升高對哮喘發(fā)作可能發(fā)揮一定作用。炎癥反應時巨噬細胞分泌的TNF-α能夠通過損傷血管內皮細胞，誘發(fā)凝血過程，促進巨噬細胞的黏附作用，并且能促進血管平滑肌細胞增殖。大量研究證明[13-14]，哮喘發(fā)作時患者體內TNF-α的表達水平顯著上升，在哮喘發(fā)作過程中發(fā)揮重要作用，王夢航等[15]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有間接促進黏蛋白MUC5ac分泌的作用，從而加重哮喘癥狀。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠BALF中TNF-α水平顯著高于正常對照組，說明TNF-α水平與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關。氣道杯狀細胞增生及黏蛋白高表達導致的黏液高分泌是哮喘的重要特征之一。哮喘發(fā)作時杯狀細胞增生從而大量產生和分泌黏液，其較高的黏滯性嚴重阻塞氣道，加重哮喘及肺功能急劇下降[16]。MUC5ac被認為是氣道杯狀細胞增生的標志，本研究發(fā)現(xiàn)喘組小鼠肺組織中MUC5ac表達水平顯著高于正常對照組。王艷杰等[17]研究報道黏蛋白MUC5ac在哮喘發(fā)作時高表達，與本研究結果一致。說明小鼠肺組織中MUC5ac表達水平上調在氣道炎癥和氣道黏液高分泌中發(fā)揮重要作用。

A.正常對照組； B.哮喘組；C.羅格列酮組。

表1 3組小鼠BALF中炎癥因子水平比較

組別IL-5IL-13TNF-α正常對照組41.96±6.108.36±2.7058.35±15.38哮喘組361.50±19.89?152.54±13.46?1191.08±41.04?1羅格列酮組150.69±19.81?228.52±6.48?2119.72±29.88?2

與正常對照組比較，*1P<0.01；與哮喘組比較，*2P<0.01。

Compared with normal control group,*1P<0.01; compared with asthma group,*2P<0.01.

表2 3組小鼠肺組織MUC5ac蛋白和mRNA含量的比較

組別MUC5ac蛋白陽性著色相對面積MUC5ac mRNA正常對照組1 483.61±220.871.48±0.47哮喘組87 817.97±8 410.95?1602.14±134.93?1羅格列酮組26 760.86±9 564.79?2180.50±41.05?2

與正常對照組比較，*1P<0.01；與哮喘組比較，*2P<0.01。

Compared with normal control group,*1P<0.01; compared with asthma group,*2P<0.01.

PPAR-γ是一類核激素受體，主要在肺組織氣道平滑肌細胞、內皮細胞及上皮細胞表達，受配體激動劑激活后可發(fā)揮生理效應[18]：降低哮喘小鼠氣道高反應性和Th2細胞因子、IgE水平表達、減少黏蛋白分泌等。羅格列酮是PPAR-γ高選擇性的外源性強力配體激動劑，可顯著減輕哮喘小鼠過敏性炎癥反應。本實驗發(fā)現(xiàn)，羅格列酮組小鼠BALF中IL-5、IL-13及TNF-α水平，氣道上皮杯狀細胞和黏液物質相對著色面積及肺組織MUC5ac蛋白和mRNA含量較哮喘組降低，提示羅格列酮可有效減少哮喘小鼠IL-5、IL-13及TNF-α水平表達和肺組織MUC5ac蛋白和mRNA含量。

A.正常對照組； B.哮喘組 ；C.羅格列酮組。

綜上所述，羅格列酮可有效減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應，調節(jié)氣道黏蛋白MUC5ac的表達，抑制氣道黏液高分泌。