復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿對功能性消化不良大鼠的改善作用及機制研究

趙優(yōu)琴，黃鳴清，鐘曉琴，葉水國，蘇志偉

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建省中藥學(xué)重點實驗室，福建 福州350122；2.國藥控股星鯊制藥<廈門>有限公司，福建 廈門361028)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床常見的一種胃腸動力障礙性疾病，其典型癥狀包括反酸、腹脹、腹瀉、早飽感等。胃腸動力障礙、內(nèi)臟高敏性及心理因素等被認為是FD的主要發(fā)病機制，同時胃腸動力障礙也是FD發(fā)生的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1]。研究表明，廣泛分布于胃腸道的Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)是腸胃活動的重要調(diào)節(jié)者，其數(shù)量或結(jié)構(gòu)的異常變化，可引起胃腸動力障礙；而ICCs特異性標(biāo)志物c-kit受體與其天然配體干細胞生長因子(stem cell factor,SCF)組成的SCF/c-kit信號通路，可調(diào)控ICCs的生長發(fā)育及其表型的維持，從而調(diào)節(jié)胃腸動力[2]。此外，水通道蛋白(aquaporins,AQPs)可高效、選擇性地轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)外的水分子以維持內(nèi)環(huán)境的水液平衡，其在腸道的異常表達會導(dǎo)致腸道對水分的吸收減少，導(dǎo)致水分大量在腸腔聚集，最終形成腹瀉[3]。

復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿(以下簡稱：復(fù)方糖漿)是一種中藥復(fù)方制劑，含黨參、白術(shù)、茯苓、山楂、山藥等多味中藥及多種B族維生素，臨床用于治療消化不良和小兒厭食。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方糖漿可有效調(diào)節(jié)FD大鼠的胃腸運動，改善小腸吸收功能[4]，但其具體機制尚不清楚。因此本實驗以此為基礎(chǔ)，進一步考察復(fù)方糖漿對FD大鼠胃竇組織中SCF、Cx43、c-kit及結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達表達水平的影響，探討復(fù)方糖漿治療FD的可能分子機制，從而為該方劑的進一步開發(fā)及臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠(體重180～200 g)，購于上海斯萊克實驗動物中心，合格證號：SCXK(滬)2017-0005。于福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[使用許可證：SYXK(閩)2016-0006]適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫(25±1)℃，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥品與試劑 復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿[國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，批號：20970104]；多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，批號：180306533)；氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：C18082207)；水合氯醛(阿拉丁，批號：40935760)；大鼠胃泌素ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，批號：CSB-E12743r)；大鼠VIP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海西塘生物科技有限公司，批號：f17131)；抗AQP4抗體(Abcam公司，批號：ab9512)；抗AQP8抗體(Abcam公司，批號：ab14363-2)； 抗c-kit抗體(Abcam公司，批號：ab5506)；抗Connexin-43抗體(PTG，批號：15386)；抗SCF抗體(Novusbio，批號：NBP1-77030)；抗β-Actin抗體(北京全式金生物，批號：HC201)。

1.3 儀器 XY2000C電子天平(常州市幸運電子設(shè)備有限公司)；Primo R高速臺式冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技有限公司)；SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司)；Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 48只合格大鼠隨機分為正常組，模型組，復(fù)方糖漿低、中、高劑量組及多潘立酮組，每組8只。除正常組每日常規(guī)飼養(yǎng)不予造模外，其余各組均采用夾尾刺激(每天2次)+不規(guī)則飲食(逢單日禁食，飲水正常)+冰生理鹽水灌胃(每次2 mL，每天1次)，連續(xù)造模2周，2周后若大鼠出現(xiàn)緊張易怒反應(yīng)、進食量明顯減少、體重明顯減輕等情況，表明造模成功。

2.2 給藥 根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[4]，復(fù)方糖漿低、中、高劑量組分別予復(fù)方糖漿2.7、5.4、10.8 g·kg-1，多潘立酮組給予多潘立酮4 mg·kg-1，正常組及模型組灌胃等體積生理鹽水，于造模后第7天開始給藥，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

2.3 小腸推進率、胃排空率測定及標(biāo)本采集 末次給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，灌胃1 mL的炭餐指示劑，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血后處死，即刻剖開腹腔，迅速剪取全胃，濾紙拭干后稱全質(zhì)量，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干后稱凈重，胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/所灌糊質(zhì)重量]×100%；剪取距幽門0.5 cm處適量大小的胃竇組織，冰生理鹽水沖洗后，置于凍存管中，液氮凍存；分離上至幽門下至回盲部的腸管，在松弛狀態(tài)下測量并記錄幽門至炭餐指示劑最前端的距離，記為炭餐指示劑推進長度，小腸推進率=炭餐指示劑推進長度/小腸總長度×100%；剪取近端結(jié)腸組織適量，冰生理鹽水沖洗后，置于凍存管中，液氮凍存。

2.4 血清胃泌素(GAS)、血管活性肽(VIP)檢測 各組大鼠取血后，4 ℃，3 500 rpm離心15 min，取上清分裝，于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。嚴格按照試劑盒說明操作，檢測血清中的GAS、VIP水平。

2.5 組織中AQP4、AQP8、SCF、Cx43、c-Kit蛋白檢測 取適量大小的胃竇組織和結(jié)腸組織，分別經(jīng)液氮充分研磨，每100 mg組織樣品中加1 mL含蛋白酶抑制劑的裂解液，1 mL注射器抽提數(shù)次充分勻漿，冰上靜置30 min后，14 000 rpm離心10 min，取上清液。BCA法檢測上清濃度，加入適量的蛋白上樣緩沖液混勻、離心、變性、上樣，每孔上樣總量為40 μg蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃敷一抗過夜，隔天TBST洗30 min，室溫敷二抗1.5 h，TBST洗30 min，ECL發(fā)光液顯影，Image Lab軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方糖漿對FD大鼠腹瀉等一般情況的影響 造模前，各組大鼠狀態(tài)、毛色、體態(tài)等均正常。造模5 d后，各實驗組大鼠煩躁易怒，大便濕軟，食欲下降；造模7 d后，各實驗組大鼠倦怠萎靡、靜臥少動，糞便呈黃綠色不成形的稀便；經(jīng)治療14 d后，與模型組相比，復(fù)方糖漿各劑量組及多潘立酮組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動量明顯增加、毛色光澤，大便恢復(fù)正常。

3.2 復(fù)方糖漿對FD大鼠體重的影響 與正常組比較，模型組大鼠的體重明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿中、高劑量及多潘立酮組大鼠體重明顯升高(P<0.05，P<0.01)，復(fù)方糖漿低劑量組大鼠體重與模型組相比也有一定程度的升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

3.3 復(fù)方糖漿對FD大鼠胃排空率及小腸推進率的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃排空率和小腸推進率均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組大鼠的胃排空率及小腸推進率均顯著升高(P<0.01)，復(fù)方糖漿中劑量組大鼠的胃排空率及小腸推進率亦有明顯升高(P<0.05)，而復(fù)方糖漿低劑量組的胃排空率及小腸推進率與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方糖漿對FD大鼠體重、胃排空率及小腸推進率的影響

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 復(fù)方糖漿對FD大鼠血清GAS、VIP的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中GAS含量顯著降低(P<0.01)，VIP水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，多潘立酮組及復(fù)方糖漿高劑量組GAS水平明顯升高(P<0.01)，VIP水平明顯降低(P<0.01)；復(fù)方糖漿中劑量組VIP水平顯著降低(P<0.05)，而復(fù)方糖漿低劑量組的GAS、VIP水平與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方糖漿對FD大鼠血清GAS、SCF、VIP的影響

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 復(fù)方糖漿對FD大鼠胃竇組織中SCF、c-kit、Cx43蛋白表達的影響 與正常組相比，模型組SCF、c-kit、Cx43蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組SCF、c-kit、Cx43蛋白表達顯著升高(P<0.01，P<0.05)，復(fù)方糖漿中劑量組c-kit、Cx43蛋白表達明顯增加(P<0.01，P<0.05)，復(fù)方糖漿低劑量組c-kit蛋白表達水平也明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

3.6 復(fù)方糖漿對FD大鼠結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組AQP4、AQP8蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組AQP4、AQP8蛋白表達顯著增加(P<0.01)；復(fù)方糖漿中劑量組AQP8蛋白表達明顯增加(P<0.05)，但AQP4蛋白表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖2。

圖1 復(fù)方糖漿對FD大鼠胃竇組織SCF、c-kit、Cx43蛋白表達的影響 注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 復(fù)方糖漿對FD大鼠結(jié)腸組織AQP4、AQP8蛋白表達的影響(n=4) 注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

FD屬中醫(yī)學(xué)中的胃脘痛、嘈雜、痞滿、納呆、反酸等范疇，其誘因與腦腸軸失衡、內(nèi)臟高敏、飲食失衡以及精神壓力過大有密切聯(lián)系，其中胃腸動力障礙是FD最重要的發(fā)病機制之一。目前西醫(yī)多以促胃動力藥等手段加以干預(yù)，雖可改善患者部分癥狀，但其方法單一，療效不明顯。中藥具有多成分、多靶點、多途徑等特點，其在治療胃腸障礙性疾病方面具有療效確切、副作用小等優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究表明，復(fù)方糖漿中黨參、白術(shù)、芡實、山楂、山藥補氣益脾、健胃消食，可促進胃腸運動；茯苓、薏苡仁健脾滲濕、除濕止瀉，可改善腹瀉。此外，方中維生素B1、B2、B6、煙酰胺等B族維生素，可改善機體能量代謝，促進營養(yǎng)成分的吸收和利用能力。

ICCs是胃腸道基本動力單位“ENS(腸神經(jīng))-ICCs-SMCs(平滑肌細胞)”中最重要的協(xié)調(diào)者，也是治療胃腸動力障礙的重要靶點[5]。Cx43是ICC細胞表達的主要連接蛋白，其表達降低會引起胃腸運動功能紊亂，干細胞因子受體(c-kit)是胃腸道ICCs的特異性受體，與Cx43存在共定位表達，c-kit與Cx43表達異?？梢鹞改c運動功能的紊亂，SCF是c-kit的特異性配體，可與c-kit結(jié)合后激活一系列信號分子，從而調(diào)節(jié)胃腸動力[6-8]。GAS是一種廣泛分布于整個胃腸道的腦腸肽，具有刺激胃酸、胃蛋白酶分泌的作用，可助消化和促進胃排空，血清GAS水平在一定程度上可以反映胃腸道的功能狀態(tài)[9]。本研究表明，復(fù)方糖漿可促進FD大鼠GAS的分泌，上調(diào)胃竇組織中SCF、c-kit、Cx43蛋白的表達水平，增強胃腸平滑肌收縮，從而促進胃腸蠕動及胃排空。

腹瀉作為FD典型癥狀中一種，與AQPs有著密切聯(lián)系。研究表明，腸道AQP4異常表達會導(dǎo)致結(jié)腸對水分的吸收和分泌紊亂，進而引發(fā)腹瀉[10-11]。腸易激綜合征患者AQP8表達顯著降低，使得結(jié)腸對水分的吸收明顯減少，可導(dǎo)致糞便松散甚至腹瀉[12-13]。此外，VIP是一種可以抑制胃腸運動的腸激肽，其水平異常增加會導(dǎo)致水分不能完全吸收，從而引起腹瀉。本研究表明，復(fù)方糖漿可抑制FD大鼠VIP的分泌，調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達水平，進而改善FD大鼠的腹瀉癥狀。

綜上所述，復(fù)方糖漿可上調(diào)胃竇組織中SCF、Cx43、c-kit的蛋白表達，增強胃腸平滑肌收縮，促進胃腸動力活動，從而改善FD模型大鼠的胃腸功能障礙；并可通過增加結(jié)腸組織中AQP3、AQP4蛋白表達水平，平衡水液吸收，減少水液電解質(zhì)在腸腔的累積，從而改善腹瀉癥狀。