LSD1對前列腺癌LNCaP細胞的上皮間質轉化和侵襲能力的影響

王 敏，劉修恒，陳志遠

(武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性發(fā)病率極高的惡性腫瘤。在我國，PCa的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率高居男性惡性腫瘤的第6位，而病死率居男性惡性腫瘤的第9位，在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中其發(fā)病率已經(jīng)超過膀胱癌和腎癌，位居第1[1]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)導致腫瘤細胞侵襲能力增強，是介導腫瘤轉移發(fā)生的重要機制[2-3]。在前列腺癌中，EMT參與雄激素信號軸的調控[4]，并增加前列腺癌細胞的轉移和侵襲能力，參與前列腺癌的轉移過程[5]。E-鈣黏素(E-cadherin)表達的丟失同N-鈣黏素(N-cadherin)和α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的高表達是EMT的標志。賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine-specific demethylase 1，LSD1)是第1個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[6]，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系密切，它的表達增加與神經(jīng)母細胞瘤、肺癌、結直腸癌、膀胱癌等諸多腫瘤相關[7-9]。LSD1同組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)、REST輔助抑制因子(CoREST)和Snail等輔助因子形成功能復合體，能夠催化組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基和一甲基化(histone H3 dimethyl Lys4，H3K4me1、me2)的去甲基化，抑制E-cadherin基因的轉錄，從而調節(jié)EMT過程[10]。LSD1不僅參與雄激素信號通路的調節(jié)，還參與調節(jié)EMT過程，因此，我們推測LSD1在前列腺癌細胞中可能通過調節(jié)EMT過程，來介導前列腺癌發(fā)生、轉移和進展。本文初步探討LSD1與前列腺癌細胞EMT過程之間的關系，試圖為臨床治療前列腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集2006年1月至2008年12月在武漢大學人民醫(yī)院接受前列腺癌根治術的前列腺癌患者標本46例，其中15例為低Gleason評分(4～7分)、31例為高Gleason評分(8～10分)。另收集診斷為良性前列腺增生并接受經(jīng)尿道前列腺電切術患者的標本25例。

1.2 試劑及抗體前列腺癌LNCaP細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol 購自美國Invitrogen公司，SYBR Green I PCR試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，LSD1小鼠抗人抗體和E-cadherin小鼠抗人抗體購自美國Santacruz公司，N-cadherin兔抗人抗體和α-SMA兔抗人抗體購自美國CST公司，羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森公司，ECL試劑盒購自美國Millipore公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。LSD1過表達質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，LSD1siRNA購自美國Santacruz公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化檢測 組織切片用新鮮配制的體積分數(shù)為3%的H2O2滅活細胞內源性過氧化物酶，然后用血清封閉，根據(jù)測試指標滴加LSD1抗體以及相應生物素化二抗，DAB顯色，封片。

1.3.2實驗分組 實驗分為3組：轉染LSDl過表達質粒的LNCaP細胞組 (過表達組)、轉染LSD1siRNA的LNCaP細胞組 (干擾組)和正常的LNCaP細胞組(空白對照組)。我們前期預實驗已經(jīng)證實轉染過表達質粒空載體和siRNA空載體的LNCaP與正常的LNCaP細胞的各項基因表達無明顯差異。

1.3.3細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件是含10%(體積分數(shù))胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件設置為5%CO2、95%空氣(體積分數(shù))、37 ℃，硫酸銅溶液保持培養(yǎng)箱內濕度并滅菌，每3～4 d更換培養(yǎng)液1次。

1.3.4質粒轉染和目的基因檢測 轉染步驟參見Lipofectamine 2000操作說明，轉染細胞數(shù)為1×105個，轉染48 h后收獲細胞，用聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction，PCR)檢測LSDl表達情況：采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度后，取2 μg進行逆轉錄，生成cDNA。采用PCR試劑盒定量檢測LSDl和內參Actin表達。引物信息如下：LSD-1，F(xiàn)：5-GCCCAAAGAAACTGTGGTGTC-3，R：5-TGTGGCTGGGTAGTTACGGAT-3；Actin，F(xiàn)：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3，R：5-CCAGTTTTTAAATC-CTGAGTCAAGC-3。

1.3.5Matrigel遷移和侵襲實驗 將無或有包被Matrigel基質膠的Transwell小室放人24孔培養(yǎng)板孔中，上層加入200 μL無血清培養(yǎng)基單細胞懸液(含1 ×103個細胞)，下室加入800 μL含10%胎牛血清(體積分數(shù))培養(yǎng)基，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h。用濕潤的棉簽去除小室上層的基質膠和細胞，4%多聚甲醛(質量分數(shù))固定20 min，PBS漂洗3次，0.1%結晶紫(質量分數(shù))染色5 min，PBS漂洗3次。取下Transwell小室置于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察，任意選取5個視野(×200)計數(shù)，拍照。

1.3.6Western blot分析 提取細胞總蛋白，用BCA法測蛋白含量，分裝后于-70 ℃冰箱保存。取上述蛋白 (約40 μg)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳[SDS-PAGE，10%分離膠(質量分數(shù))]，然后電轉移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉、洗脫后分別加入LSDl小鼠抗人抗體(1∶1 000)，E-cadherin小鼠抗人抗體(1∶800)、N-cadherin兔抗人抗體(1∶1 000)和α-SMA兔抗人抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后以相應的二抗室溫孵育1 h，并以小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶2 000)作為上樣對照。用ECL，暗室X光膠片曝光。

2 結 果

2.1 LSD1在良性前列腺增生組織和前列腺癌組織中的表達水平我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LSD1主要在正常前列腺上皮細胞和前列腺癌細胞核表達[11]。一方面，LSD1在前列腺癌組織內高表達，顯著高于良性前列腺增生組織；另一方面，其在高Gleason評分的前列腺癌組織中表達顯著高于低Gleason評分的前列腺癌組織(圖1)。

圖1 免疫組化檢測LSD1在良性前列腺增生組織和前列腺癌組織中的表達水平(×400)

A：良性前列腺增生組織；B：低Gleason評分前列腺癌組織；C：高Gleason評分前列腺癌組織。

2.2 LSDl在各實驗組中的表達水平PCR結果顯示，過表達組LSDl基因的mRNA相對表達水平顯著高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.002)；干擾組LSDl基因的mRNA相對表達水平顯著低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。這說明通過轉染LSD1基因質?？梢燥@著上調LNCaP細胞的LSD1基因表達水平，而轉染LSD1siRNA可以顯著下調LNCaP細胞的LSD1基因表達水平(圖2)。

2.3 LSDl影響LNCaP細胞的遷移和侵襲能力同步化處理過表達組、空白對照組和干擾組LNCaP細胞后，以Transwell小室法檢測各組細胞的遷移能力，結果表明過表達組穿過細胞數(shù)顯著多于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007)，而干擾組穿過細胞數(shù)顯著少于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.012)；同時，以包被Matrigel基質膠的Transwell小室法檢測各組細胞的侵襲能力，結果表明過表達組穿過細胞數(shù)顯著多于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，而干擾組穿過細胞數(shù)顯著少于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.009)。這表明上調LSDl基因表達可以增加前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力，而抑制LSDl基因表達能夠減弱前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力(圖3)。

2.4 LSDl促進LNCaP細胞的上皮間質轉化Western blot分析結果顯示，過表達組LSDl蛋白表達水平顯著高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000 3)；干擾組LSDl蛋白表達水平顯著低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。過表達組細胞N-cadherin(P=0.002)和α-SMA(P=0.006)的表達水平顯著高于空白對照組，而E-cadherin(P<0.001)的表達水平顯著低于空白對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義；同時，干擾組細胞N-cadherin和α-SMA的表達水平顯著低于空白對照組(P均<0.001),而E-cadherin的表達水平顯著高于空白對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。這說明上調LSDl基因表達顯著增加N-cadherin和α-SMA的表達，并顯著降低E-cadherin的表達，從而促進上皮間質轉化；而下調LSDl基因表達則能夠抑制上皮間質轉化(圖4)。

圖2 PCR鑒定各組LSD1基因的mRNA表達水平

A：PCR結果顯示LSD1mRNA在過表達組表達明顯上調，而在干擾組中的表達明顯下調；B：LSD1mRNA在對照組、過表達組和干擾組中擴增倍數(shù)的比較。

圖3 各組細胞Transwell遷移和侵襲實驗結果對比

圖4 Western blot分析各組LSDl、α-SMA、N-cadherin和E-cadherin蛋白表達水平

3 討 論

組蛋白甲基化在表觀遺傳中發(fā)揮著十分重要的作用，在2004年LSD1首次被發(fā)現(xiàn)以前，組蛋白甲基化一直被認為是不可逆的[6]。組蛋白甲基化轉移酶(histonemethyl transferase，HMT)使組蛋白發(fā)生甲基化修飾，LSD1是組蛋白去甲基化酶。多項研究表明，LSD1對于維持腫瘤的生物學特性發(fā)揮了重要作用，與腫瘤發(fā)生、轉移、增殖和凋亡等多種行為關系密切[7-8，12-14]。

ZHENG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，使用siRNA或抑制劑抑制LSD1功能能夠誘導某些表達異常的基因沉默，從而有效治療癌癥。HAN等[16]報道，聯(lián)合使用LSD1抑制劑和DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMTs) 抑制劑，能夠明顯抑制膀胱癌、白血病和結腸癌等多種癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在前列腺癌中的表達顯著高于良性前列腺增生組織，并且在高Gleason評分的前列腺癌組織中的表達顯著高于低Gleason評分的前列腺癌組織。因此，我們推測LSD1可能跟前列腺癌進展和轉移相關。

上皮細胞通過一系列機制再分化為間質細胞，這一過程被稱為EMT[17]。在腫瘤進展過程中，EMT被認為與腫瘤細胞獲得干細胞潛能、治療抵抗和轉移進展等惡性潛能相關[18-19]。同時，EMT被認為在前列腺癌轉移中發(fā)揮著非常重要的作用[20]。E-cadherin的丟失被認為是EMT的標志性改變，與腫瘤獲得侵襲性和發(fā)生遠處轉移關系密切[21-22]。近年來，EMT在腫瘤進展、轉移中的作用已經(jīng)成為研究的熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌LNCaP細胞中通過過表達的方法上調LSD1表達，能夠增加LNCaP細胞的遷移和侵襲能力，同時，能夠顯著降低EMT標志物E-cadherin的表達、并增加間質表型N-cadherin和α-SMA的表達；而在前列腺癌LNCaP細胞中通過siRNA干擾的方法抑制LSD1表達，能夠降低LNCaP細胞的遷移和侵襲能力，同時，能夠顯著增加EMT標志物E-cadherin的表達、并減少間質表型N-cadherin和α-SMA的表達。LSD1主要表達于細胞核內，具有調控基因轉錄的功能，一方面它可以作用于H3K4，使單甲基化和雙甲基化的H3K4去甲基化，從而抑制相關基因的表達；另一方面，它可以作用于H3K9，使單甲基化和雙甲基化的H3K9去甲基化，從而激活相關基因的表達。說明LSD1能夠增加前列腺癌細胞的侵襲能力、促進前列腺癌細胞EMT的發(fā)生，可能通過調節(jié)EMT過程促進前列腺癌進展、轉移。研究顯示，在Snail 誘導發(fā)生的EMT過程中，Snail能夠通過招募LSD1，沉默上皮細胞基因E-cadherin的表達[10]。Snail 包含1個Snag 結構域，該結構域含有豐富的精氨酸和賴氨酸殘基，類似于組蛋白H3的N末端尾部序列，從而使得Snail 能夠借助Snag結構域將LSD1 鉤住，同時還能夠招募HDAC 和CoREST 輔助抑制因子等，與E-cadherin 啟動子區(qū)域形成功能復合體，催化H3K4me1、me2 的去甲基化，從而抑制E-cadherin基因的轉錄。因此，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，過表達的LSD1可能以功能復合體的形式催化前列腺癌細胞H3K4me1、me2 的去甲基化，導致E-cadherin基因表達的降低以及N-cadherin和α-SMA基因表達的增加，從而促進EMT過程。

因此，我們推測LSD1高表達可能成為判斷前列腺癌進展、轉移和預后的一個標志，前列腺癌細胞可能通過高表達LSD1，促進EMT發(fā)生，使腫瘤細胞更具有侵襲和轉移性，從而利于發(fā)生遠處轉移。LSD1有可能成為一個治療前列腺癌的新型抗癌靶點。