超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定圓椒中甘油磷脂含量

何秀梅，藏志煥，陳 晴，趙瑛博*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

圓椒，又名川菜椒（Capsicum annuum var.grossum），俗稱燈籠椒、柿子椒，是茄科辣椒屬辣椒的一個(gè)變種。圓椒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中屬于大宗蔬菜品種，在我國(guó)的生產(chǎn)和消費(fèi)量都十分巨大[1]。對(duì)于圓椒的貯藏保鮮方法通常是低溫貯藏，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的降低，圓椒會(huì)出現(xiàn)一系列的冷害現(xiàn)象[2-3]，例如表皮全部或局部出現(xiàn)水漬樣凹陷斑，表皮顏色轉(zhuǎn)為深綠，進(jìn)而腐爛，完全失去商品屬性。研究表明，這些冷害現(xiàn)象的出現(xiàn)與細(xì)胞膜脂代謝紊亂有重大關(guān)聯(lián)。在發(fā)生冷害時(shí)，細(xì)胞膜由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，膜間隙變大，流動(dòng)性降低，透性升高，而影響到細(xì)胞膜功能。膜脂的種類、含量以及不飽和度的高低影響著膜脂的相變，其中含量最高的是磷脂，其他還有糖脂、甘油脂等，這些脂類在各代謝網(wǎng)絡(luò)中可以相互轉(zhuǎn)化，彼此關(guān)聯(lián)[4]。因此，監(jiān)測(cè)冷藏過程中圓椒細(xì)胞膜磷脂種類和含量的變化對(duì)于評(píng)估圓椒冷害發(fā)生的程度以及提出調(diào)控冷害發(fā)生的有效方法具有重要意義。

甘油磷脂是最重要的磷脂，是親水脂兩性分子。甘油主鏈的第3個(gè)羥基被磷酸酯化，磷酸基團(tuán)又與各種結(jié)構(gòu)不同的小分子化合物相連接，而具有極性，成為極性頭部。另外2 個(gè)羥基被脂肪酸酯化，具有非極性特性，成為非極性尾部。根據(jù)磷酸基連接的小分子種類的不同，甘油磷脂可以分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylamide ethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl amide serine，PS）、磷脂酰甘油酸（phosphatidyl amide glycerol，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）及磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等；如果甘油主鏈sn-2位未被取代，則得到溶血磷脂，包括溶血磷脂膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂乙醇胺（lysophosphatidylamide ethanolamine，LPE）、溶血磷脂絲氨酸（lysophosphatidyl amide serine，LPS）、溶血磷脂甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、溶血磷脂肌醇（lysophosphatidylinositol，LPI）、溶血磷脂酸（lysophosphatidyl amide glycerol，LPA）等[5-6]。在每一類磷脂中又可因組成的脂肪酸不同而有若干種，因此甘油磷脂的種類繁多。這為磷脂分子的定性定量分析帶來一定困難，因此需要采用可靠的手段確認(rèn)磷脂的種類，并采用相對(duì)定量的方法為每種磷脂定量。

磷脂成分的分離和鑒別有多種方法，例如液相色譜-蒸發(fā)光散射、電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9]（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）等。在這些方法中，由于具有更高的柱效和更強(qiáng)的定性能力，UPLCMS/MS法可以使磷脂獲得更佳的分離并能夠方便的對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。分離的方式有正相分離和反相分離[10]，正相分離采用的流動(dòng)相極性較低，與質(zhì)譜的兼容性較差；磷脂在反相C8柱[11]或C18柱[12-13]的分離主要依靠支鏈碳數(shù)的差別，而在不同極性頭部磷脂間的分離則較弱。近年來開發(fā)的HILIC色譜柱采用了極性改性的固定相，而增強(qiáng)了對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留能力，Ma Xiaoxiao[14]和Ali[15]等使用HILIC色譜體系對(duì)磷脂成分進(jìn)行分離，獲得了較傳統(tǒng)正相、反相系統(tǒng)更好的分離效果。在串聯(lián)質(zhì)譜法中應(yīng)用于磷脂鑒別的主要為三重四極桿質(zhì)譜[16-17]和四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜[12,15,18-22]兩種。前者可以通過母離子掃描和中性丟失掃描等方式確定特征碎片，而后者則是通過測(cè)量精確分子質(zhì)量和特征碎片對(duì)磷脂分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

關(guān)于細(xì)胞膜磷脂的樣品來源，既有植物樣品也有動(dòng)物樣品。動(dòng)物源樣品包括組織[16,23-24]、血漿[11,18,25]、蛋類、奶等[15]；植物樣品包括蔬菜[22]、水果、葉片、模式植物擬南芥等[26]。相對(duì)于動(dòng)物樣品，由于含有細(xì)胞壁，所以植物來源的磷脂成分的提取過程相對(duì)繁瑣。液液萃取法通常用于動(dòng)植物樣品中磷脂的提取，采用的溶劑主要為甲醇-氯仿[11,12,27]以及甲醇[19-20]、異丙醇等。另外，Karin等[17]也采用固相萃取法提取磷脂。本實(shí)驗(yàn)將分別采取以上各方法分別提取圓椒中磷脂，并對(duì)提取出的磷脂種類和含量進(jìn)行比較和評(píng)估，以優(yōu)化提取方法。

本研究分別討論以甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑的液液萃取方法以及固相萃取法提取圓椒中的磷脂，通過比較各方法測(cè)出的磷脂種類和含量評(píng)估最優(yōu)前處理方法。采用HILIC系統(tǒng)分離不同種類的磷脂，以三重四極桿質(zhì)譜法鑒別其結(jié)構(gòu)并用相對(duì)定量法定量。同時(shí)對(duì)方法的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而建立針對(duì)圓椒樣品磷脂測(cè)定的UPLC-MS/MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圓椒購(gòu)自沈陽(yáng)市當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。樣品新鮮無機(jī)械損傷。取果肉部分切成0.5 cm×1.0 cm的小塊，備用。

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：PA（C28:0）、LPS（C16:0）、LPC（C14:0）、LPE（C14:0） 美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；PG（C28:0）、PC（C28:0） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

甲醇、乙腈、甲酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司。用于樣品制備的其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型液相色譜系統(tǒng)、LCMS-8050型LC-MS聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津公司；ACQUITY UPLC?BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Sep-Pak硅膠固相萃取柱（500 mg） 美國(guó)Waters公司；902超低溫冰箱（-80 ℃） 美國(guó)Thermo公司；CR21N低溫高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；Cenco渦旋儀 荷蘭Breda公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

為選擇適合圓椒樣品的磷脂提取方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)5 種經(jīng)典的磷脂提取方法進(jìn)行修改，并分別應(yīng)用于圓椒磷脂的提取。為了表述方便，將這些方法依次命名為甲醇法、異丙醇法、異丙醇-氯仿-水法、BD（Bligh and Dyer）法和固相萃取法。具體的前處理過程如下：

甲醇法：稱取約3 g樣品，加入3 mL甲醇，渦旋1 min，離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜。

異丙醇法：稱取約3 g青椒樣品，加入3 mL異丙醇，渦旋1 min，離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸至近干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜。

異丙醇-氯仿-水法：取3 g青椒樣品，迅速置于75 ℃預(yù)熱的3 mL異丙醇（含0.01%二丁基羥基甲苯（dibutylhydroxytoluene，BHT））中浸泡15 min，然后加入1.5 mL氯仿和0.6 mL超純水，搖床中150×g避光振搖1 h。提取液轉(zhuǎn)移到50 mL玻璃管中。殘?jiān)儆? mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V，含0.01% BHT）溶液抽提5 次，每次用搖床振搖30 min，直到樣品變白。合并所有提取液，然后分別用1 mL 1 mol/L的KCl溶液和2 mL超純水洗滌提取液。取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解，濾膜過濾。

BD法：取3 g樣品置于30 mL玻璃管中，加入2 mL甲醇（含0.01% BHT）和4 mL氯仿，超聲60 s后渦旋30 s，室溫下靜置10 h。向提取液中加入2 mL超純水，4 ℃、2 600×g離心10 min。移除上層與中層溶液，底層溶液加入3 mL氯仿，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解，過0.22 μm濾膜。

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法：取3 g樣品，加入2.5 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液及12.5 mL 1 mol/L的NaCl溶液，渦旋后靜置分層，棄去上層溶液，下層氯仿層氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液溶解，得到樣品溶液。以3 mL正己烷活化Waters Sep-Pak硅膠固相萃取柱。上樣，分別加入3 mL正己烷-乙醚（8∶2，V/V）和3 mL正己烷-乙醚（1∶1，V/V）溶液淋洗，再用6 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水（3∶5∶2，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈伞? mL甲醇溶解殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜。

因?yàn)榱字N類眾多，不同來源樣品中磷脂種類也不盡相同，所以在對(duì)使用的5 種前處理方法進(jìn)行選擇時(shí)，根據(jù)每種方法能夠檢測(cè)到的磷脂種類、相應(yīng)峰的峰面積作為考核指標(biāo)，選擇提取得到磷脂種類多且峰面積大的方法作為最優(yōu)的前處理方法。

1.3.2 UPLC條件

處理后的樣品用配有ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×75 mm，2 μm）的液相色譜系統(tǒng)分離。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的50 mmol/L乙酸銨溶液（pH 3.18），流動(dòng)相B為乙腈。使用梯度程序洗脫：0～6 min，95%～85% B；16 min，60% B；16.01～20 min，95% B，保持3 min；流速300 μL/min，總運(yùn)行時(shí)間20 min。進(jìn)樣量1.0 μL，柱溫40 ℃。

1.3.3 MS條件

電噴霧離子源，干燥氣、霧化氣為氮?dú)?，加熱氣為空氣，干燥氣流?0 L/min，霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min。離子源溫度300 ℃，脫溶劑溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃、噴霧電壓±3 000 V。PC、LPE、LPC、LPS在正離子模式下測(cè)定，PA和PG在負(fù)離子模式下測(cè)定。各磷脂測(cè)定參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters in the MRM mode

1.3.4 方法適應(yīng)性

為考察方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。方法的靈敏度用檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）表示。分別測(cè)定質(zhì)量濃度為125 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）基質(zhì)溶液，測(cè)定信噪比，計(jì)算檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）?？紤]到樣品基質(zhì)中可能含有的磷脂本底情況，添加的磷脂均為基質(zhì)中不含有或含量極少。方法的準(zhǔn)確度和精密度用方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。向3 g樣品中分別添加125、250 ng/mL和375 ng/mL三個(gè)水平的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按上述方法進(jìn)行前處理和UPLC-三重四極桿質(zhì)譜方法測(cè)定。每個(gè)添加水平做6 個(gè)重復(fù)，計(jì)算方法回收率和RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

利用不同種類磷脂極性頭部的特征碎片進(jìn)行中性丟失掃描或母離子掃描可以在一定程度上說明各前處理方法提取得到的磷脂種類，進(jìn)而判斷各前處理方法性能的優(yōu)劣。各種類磷脂的特征碎片和掃描方式見表2。

表2 磷脂掃描方式及特征碎片Table 2 Scanning modes and characteristic fragments for phospholipids

利用母離子掃描和中性丟失掃描的方式分別對(duì)5 種前處理方法抽提得到的磷脂進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)到的磷脂數(shù)量和相關(guān)峰面積結(jié)果見表3。

表3 前處理方法的選擇Table 3 Selection of pretreatment methods

在這5 種方法中，異丙醇法和異丙醇-氯仿-水法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較多，但是在相關(guān)峰的峰面積比較中，異丙醇-氯仿-水法比異丙醇法多，且異丙醇法未能測(cè)得PS；其余3 種方法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較少、峰面積較低，BD法未能測(cè)得PI和PE，SPE法未能測(cè)得PI。因此選擇異丙醇-氯仿-水法作為提取磷脂的方法較為合適。

2.2 磷脂組分的分離

在HILIC體系中，流動(dòng)相的pH值對(duì)組分的保留和選擇性的影響相比反相體系更大。因此，在實(shí)驗(yàn)中分別使用pH 3.18、pH 4.45、pH 2.78的流動(dòng)相B分析樣品，最終確定在不同的pH值條件下，各磷脂的峰形、流出時(shí)間均有所不同。綜合考察分離及流出情況，選擇流動(dòng)相B的pH值為3.18。

由于極性頭部的不同，PG、LPI在僅負(fù)離子模式下有響應(yīng)；PC、LPC只在正離子模式下有響應(yīng)；LPS、LPE在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但在負(fù)離子模式下的響應(yīng)更高，因此，PG、LPI、LPE、LPS在負(fù)離子模式下采集，PC、LPC在正離子模式下采集。各磷脂梯度洗脫順序?yàn)镻G＜LPI＜LPE＜PC＜LPC＜LPS。各組分總離子流圖見圖1。

圖1 磷脂組分總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram

2.3 磷脂的裂解規(guī)律

在外界有能量輸入時(shí)，磷脂分子的化學(xué)鍵會(huì)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生若干二級(jí)碎片離子，這些離子反映磷脂分子的結(jié)構(gòu)，因此這些碎片離子也被稱為特征碎片。根據(jù)特征碎片可以判斷與甘油骨架酯化的脂肪酸殘基和極性頭部，從而確認(rèn)磷脂的分子結(jié)構(gòu)。

分別將PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID），使其中的化學(xué)鍵進(jìn)行斷裂和重排，獲得其特征碎片，進(jìn)而解釋其裂解規(guī)律。由于磷脂分子結(jié)構(gòu)的不同，不同種類的磷脂會(huì)分別在正離子模式或負(fù)離子模式下有更好地響應(yīng)，在本實(shí)驗(yàn)中PC、LPC、LPE、LPS在正離子模式下響應(yīng)更高，而PA、PG在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高。

圖2 正離子模式下的PC（A）、LPC（B）、LPE（C）、LPS（D）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 Tandem mass spectra of PC (A), LPC (B), LPE (C), and LPS (D) in the positive ion mode

如圖2A所示，母離子為[M＋H]＋，m/z 678，磷酸酯鍵被打斷后產(chǎn)生PC（[C5H14O4NP＋H]＋）特征離子，m/z 184，該碎片離子為PC和溶血PC類分子的特征離子。其他的離子碎片m/z 495.4對(duì)應(yīng)[M＋H-183]＋，m/z 211.2對(duì)應(yīng)脫水肉豆蔻酸殘基離子；m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-183-211]＋。在二級(jí)質(zhì)譜圖中無其他脂肪酸殘基碎片，表明在甘油骨架sn-1和sn-2上都與肉豆蔻酸殘基相連。

如圖2B所示，LPC（C14:0）的二級(jí)質(zhì)譜圖與PC的裂解規(guī)律類似。m/z 468為母離子，對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，在CID模式下，磷酸酯鍵被打斷，產(chǎn)生PC[C5H14O4NP＋H]＋和[C5H12N＋H]＋，對(duì)應(yīng)m/z 184和m/z 86。m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-183-211]＋。

如圖2C所示，母離子為[M＋H]＋，m/z 426，磷酸酯鍵被打斷后出現(xiàn)PE的特征碎片[C2H7O4NP＋H]＋，m/z 141（未顯示），離子碎片m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-140]＋。m/z 211.2為脫水肉豆蔻酸殘基離子。在丟失肉豆蔻酸殘基后，PE再繼續(xù)裂解，中性丟失乙醇胺部分后的碎片對(duì)應(yīng)為m/z 155.01。

如圖2D所示，m/z 498為母離子[M＋H]＋，m/z 313.2對(duì)應(yīng)LPS（C16:0）甘油骨架上sn-3位上磷酸酯鍵斷裂后產(chǎn)生的碎片，即[M＋H-C3H7O6NP]＋；m/z 239.2對(duì)應(yīng)脫水棕櫚酸殘基；m/z 155.01對(duì)應(yīng)[M＋H-C16H29O-C3H7O3N]＋，即LPS（C16:0）丟失脫水肉豆蔻酸殘基后中性丟失絲氨酸殘基后的碎片。

圖3 負(fù)離子模式下的PA（C28:0）（A）、PG（C28:0）（B）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 Tandem mass spectra of PA (C28:0) (A) and PG (C28:0) (B)in the negative ion mode

如圖3A所示，m/z 591為PA（C28:0）的母離子[MH]-，m/z 363.2為磷脂酸sn-1位丟失肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片；m/z 381為sn-1位丟失脫水肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片；m/z 363.2碎片繼續(xù)裂解，丟失sn-2位脫水肉豆蔻酸殘基后得到m/z 153.0離子。圖3A中響應(yīng)值最高的m/z 227.2碎片為脫水肉豆蔻酸殘基。

如圖3B所示，m/z 665.4為PG（C28:0）的母離子[MH]-，m/z 455.2為PG分子丟失sn-1位脫水肉豆蔻酸殘基產(chǎn)生的碎片；m/z 363.2碎片對(duì)應(yīng)為m/z 455.2碎片上sn-3位甘油殘基繼續(xù)裂解丟失得到；然后該碎片上的sn-2位酯鍵繼續(xù)斷裂丟失脫水肉豆蔻酸殘基，得到m/z 153.0碎片。m/z 227.2對(duì)應(yīng)肉豆蔻酸殘基。

通過對(duì)正、負(fù)離子模式下各類磷脂裂解規(guī)律的分析可以發(fā)現(xiàn)，在受到外界能量輸入時(shí)，甘油骨架sn-3位上的磷酸酯鍵以及sn-1和sn-2位上的酯鍵更容易斷裂，產(chǎn)生磷脂的極性頭部和脂肪酸相關(guān)殘基特征碎片，根據(jù)這些特征碎片可以為磷脂做定性分析。

2.4 方法適應(yīng)性

2.4.1 方法的線性范圍和靈敏度

為了避免基質(zhì)效應(yīng)，以圓椒樣品提取溶液作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為10、50、100、500、1 000 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)溶液質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各磷脂的LOD和LOQ，結(jié)果見表4。

表4 磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LOD及LOQTable 4 Standard curves, linear ranges, limits of detection and limits of quantification

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

表5 3 個(gè)添加水平的磷脂回收率與RSD（n=8）Table 5 Recoveries of phospholipids at three spiked levels and relative standard deviation (RSD) (n= 8)

由表5可知，6 種磷脂在3 個(gè)添加水平的平均回收率在68.06%～84.17%之間，RSD在3.40%～9.60%之間。參照農(nóng)殘分析實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（LOQ在0.01～0.1 mg/kg時(shí)，回收率在70%～120%之間，變異系數(shù)小于22%；LOQ在0.1～1.0 mg/kg時(shí)，回收率在70%～110%之間，變異系數(shù)小于18%），該方法基本滿足要求。在各種磷脂中PC和LPC在各添加水平中回收率較高，RSD較小，可能是因?yàn)镻C和LPC在質(zhì)譜中的響應(yīng)更高。

2.5 方法的應(yīng)用

由于極性頭部的不同和甘油骨架上酯化的脂肪酸殘基種類眾多，導(dǎo)致磷脂種類數(shù)量十分巨大，市場(chǎng)上的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品種類十分有限且價(jià)格高昂，采用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法鑒別磷脂分子顯然不現(xiàn)實(shí)，因此在定性過程中，根據(jù)磷脂的保留時(shí)間和流出順序以及得到的二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行定性分析；同時(shí)，雖然不同磷脂在質(zhì)譜中的響應(yīng)不同，定量時(shí)也只能采用相對(duì)定量法進(jìn)行。在HILIC體系中，各磷脂的分離主要依靠極性頭部，定量時(shí)，向樣品中分別加入一定量的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其作為對(duì)照為具有相同極性頭部的磷脂定量。同時(shí)將相同類別磷脂做歸一化處理，用以表明各磷脂在同類磷脂中的比例。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)圓椒樣品進(jìn)行測(cè)定，如表6所示。

表6 圓椒中磷脂種類及其相對(duì)含量Table 6 Types and relative contents of phospholipids in bell pepper determined by the developed method

由表6可知，圓椒樣品中含有PC、PG、LPS、LPI、LPC、LPE。其中，共發(fā)現(xiàn)7 種PC、6 種LPE、7 種LPC、6 種LPS、6 種PG、6 種PA，共38 種磷脂。各磷脂的含量在0.95～18.49 μg/kg之間。在各種磷脂種類中，PC（C34:2）在PC中占比最高，達(dá)到31.18%；LPE（C16:0）和LPE（C18:1）在LPE中占比最高，分別達(dá)到28.91%和28.75%；LPC（C16:1）在LPC中占比最高，達(dá)到25.37%；在LPS中LPS（C16:3）占比35.55%，含量最高，是最主要的LPS；在PG中PG（C32:0）占比最高，達(dá)到23.89%；在PA中PA（C34:2）的含量最高，為29.83%。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立一種針對(duì)圓椒中磷脂含量測(cè)定的方法。分別對(duì)采用甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑，使用液液萃取或固相萃取為凈化方法的前處理過程進(jìn)行討論，最終確定異丙醇-氯仿-水法抽提得到的磷脂種類最多、含量最高。方法以PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）為對(duì)照，探討了方法的適應(yīng)性。結(jié)果表明，該方法能夠滿足對(duì)圓椒磷脂含量測(cè)定的要求。