• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定圓椒中甘油磷脂含量

    2019-12-04 02:59:34何秀梅藏志煥趙瑛博
    食品科學(xué) 2019年22期
    關(guān)鍵詞:異丙醇殘基磷脂

    何秀梅,藏志煥,陳 晴,趙瑛博*

    (沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)

    圓椒,又名川菜椒(Capsicum annuum var.grossum),俗稱燈籠椒、柿子椒,是茄科辣椒屬辣椒的一個(gè)變種。圓椒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中屬于大宗蔬菜品種,在我國(guó)的生產(chǎn)和消費(fèi)量都十分巨大[1]。對(duì)于圓椒的貯藏保鮮方法通常是低溫貯藏,但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的降低,圓椒會(huì)出現(xiàn)一系列的冷害現(xiàn)象[2-3],例如表皮全部或局部出現(xiàn)水漬樣凹陷斑,表皮顏色轉(zhuǎn)為深綠,進(jìn)而腐爛,完全失去商品屬性。研究表明,這些冷害現(xiàn)象的出現(xiàn)與細(xì)胞膜脂代謝紊亂有重大關(guān)聯(lián)。在發(fā)生冷害時(shí),細(xì)胞膜由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài),膜間隙變大,流動(dòng)性降低,透性升高,而影響到細(xì)胞膜功能。膜脂的種類、含量以及不飽和度的高低影響著膜脂的相變,其中含量最高的是磷脂,其他還有糖脂、甘油脂等,這些脂類在各代謝網(wǎng)絡(luò)中可以相互轉(zhuǎn)化,彼此關(guān)聯(lián)[4]。因此,監(jiān)測(cè)冷藏過程中圓椒細(xì)胞膜磷脂種類和含量的變化對(duì)于評(píng)估圓椒冷害發(fā)生的程度以及提出調(diào)控冷害發(fā)生的有效方法具有重要意義。

    甘油磷脂是最重要的磷脂,是親水脂兩性分子。甘油主鏈的第3個(gè)羥基被磷酸酯化,磷酸基團(tuán)又與各種結(jié)構(gòu)不同的小分子化合物相連接,而具有極性,成為極性頭部。另外2 個(gè)羥基被脂肪酸酯化,具有非極性特性,成為非極性尾部。根據(jù)磷酸基連接的小分子種類的不同,甘油磷脂可以分為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylamide ethanolamine,PE)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl amide serine,PS)、磷脂酰甘油酸(phosphatidyl amide glycerol,PA)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)及磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)等;如果甘油主鏈sn-2位未被取代,則得到溶血磷脂,包括溶血磷脂膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)、溶血磷脂乙醇胺(lysophosphatidylamide ethanolamine,LPE)、溶血磷脂絲氨酸(lysophosphatidyl amide serine,LPS)、溶血磷脂甘油(lysophosphatidylglycerol,LPG)、溶血磷脂肌醇(lysophosphatidylinositol,LPI)、溶血磷脂酸(lysophosphatidyl amide glycerol,LPA)等[5-6]。在每一類磷脂中又可因組成的脂肪酸不同而有若干種,因此甘油磷脂的種類繁多。這為磷脂分子的定性定量分析帶來一定困難,因此需要采用可靠的手段確認(rèn)磷脂的種類,并采用相對(duì)定量的方法為每種磷脂定量。

    磷脂成分的分離和鑒別有多種方法,例如液相色譜-蒸發(fā)光散射、電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9](ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)等。在這些方法中,由于具有更高的柱效和更強(qiáng)的定性能力,UPLCMS/MS法可以使磷脂獲得更佳的分離并能夠方便的對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。分離的方式有正相分離和反相分離[10],正相分離采用的流動(dòng)相極性較低,與質(zhì)譜的兼容性較差;磷脂在反相C8柱[11]或C18柱[12-13]的分離主要依靠支鏈碳數(shù)的差別,而在不同極性頭部磷脂間的分離則較弱。近年來開發(fā)的HILIC色譜柱采用了極性改性的固定相,而增強(qiáng)了對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留能力,Ma Xiaoxiao[14]和Ali[15]等使用HILIC色譜體系對(duì)磷脂成分進(jìn)行分離,獲得了較傳統(tǒng)正相、反相系統(tǒng)更好的分離效果。在串聯(lián)質(zhì)譜法中應(yīng)用于磷脂鑒別的主要為三重四極桿質(zhì)譜[16-17]和四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜[12,15,18-22]兩種。前者可以通過母離子掃描和中性丟失掃描等方式確定特征碎片,而后者則是通過測(cè)量精確分子質(zhì)量和特征碎片對(duì)磷脂分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

    關(guān)于細(xì)胞膜磷脂的樣品來源,既有植物樣品也有動(dòng)物樣品。動(dòng)物源樣品包括組織[16,23-24]、血漿[11,18,25]、蛋類、奶等[15];植物樣品包括蔬菜[22]、水果、葉片、模式植物擬南芥等[26]。相對(duì)于動(dòng)物樣品,由于含有細(xì)胞壁,所以植物來源的磷脂成分的提取過程相對(duì)繁瑣。液液萃取法通常用于動(dòng)植物樣品中磷脂的提取,采用的溶劑主要為甲醇-氯仿[11,12,27]以及甲醇[19-20]、異丙醇等。另外,Karin等[17]也采用固相萃取法提取磷脂。本實(shí)驗(yàn)將分別采取以上各方法分別提取圓椒中磷脂,并對(duì)提取出的磷脂種類和含量進(jìn)行比較和評(píng)估,以優(yōu)化提取方法。

    本研究分別討論以甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑的液液萃取方法以及固相萃取法提取圓椒中的磷脂,通過比較各方法測(cè)出的磷脂種類和含量評(píng)估最優(yōu)前處理方法。采用HILIC系統(tǒng)分離不同種類的磷脂,以三重四極桿質(zhì)譜法鑒別其結(jié)構(gòu)并用相對(duì)定量法定量。同時(shí)對(duì)方法的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)而建立針對(duì)圓椒樣品磷脂測(cè)定的UPLC-MS/MS方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    圓椒購(gòu)自沈陽(yáng)市當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。樣品新鮮無機(jī)械損傷。取果肉部分切成0.5 cm×1.0 cm的小塊,備用。

    磷脂標(biāo)準(zhǔn)品:PA(C28:0)、LPS(C16:0)、LPC(C14:0)、LPE(C14:0) 美國(guó)Avanti Polar Lipids公司;PG(C28:0)、PC(C28:0) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

    甲醇、乙腈、甲酸銨(均為色譜純) 美國(guó)Fisher Scientific公司。用于樣品制備的其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-20A型液相色譜系統(tǒng)、LCMS-8050型LC-MS聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源) 日本島津公司;ACQUITY UPLC?BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、Sep-Pak硅膠固相萃取柱(500 mg) 美國(guó)Waters公司;902超低溫冰箱(-80 ℃) 美國(guó)Thermo公司;CR21N低溫高速離心機(jī) 日本Hitachi公司;Cenco渦旋儀 荷蘭Breda公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    為選擇適合圓椒樣品的磷脂提取方法,本實(shí)驗(yàn)對(duì)5 種經(jīng)典的磷脂提取方法進(jìn)行修改,并分別應(yīng)用于圓椒磷脂的提取。為了表述方便,將這些方法依次命名為甲醇法、異丙醇法、異丙醇-氯仿-水法、BD(Bligh and Dyer)法和固相萃取法。具體的前處理過程如下:

    甲醇法:稱取約3 g樣品,加入3 mL甲醇,渦旋1 min,離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,殘?jiān)? mL甲醇溶解,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜。

    異丙醇法:稱取約3 g青椒樣品,加入3 mL異丙醇,渦旋1 min,離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸至近干,殘?jiān)? mL甲醇溶解,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜。

    異丙醇-氯仿-水法:取3 g青椒樣品,迅速置于75 ℃預(yù)熱的3 mL異丙醇(含0.01%二丁基羥基甲苯(dibutylhydroxytoluene,BHT))中浸泡15 min,然后加入1.5 mL氯仿和0.6 mL超純水,搖床中150×g避光振搖1 h。提取液轉(zhuǎn)移到50 mL玻璃管中。殘?jiān)儆? mL氯仿-甲醇(2∶1,V/V,含0.01% BHT)溶液抽提5 次,每次用搖床振搖30 min,直到樣品變白。合并所有提取液,然后分別用1 mL 1 mol/L的KCl溶液和2 mL超純水洗滌提取液。取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解,濾膜過濾。

    BD法:取3 g樣品置于30 mL玻璃管中,加入2 mL甲醇(含0.01% BHT)和4 mL氯仿,超聲60 s后渦旋30 s,室溫下靜置10 h。向提取液中加入2 mL超純水,4 ℃、2 600×g離心10 min。移除上層與中層溶液,底層溶液加入3 mL氯仿,氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解,過0.22 μm濾膜。

    固相萃?。╯olid phase extraction,SPE)法:取3 g樣品,加入2.5 mL氯仿-甲醇(2∶1,V/V)溶液及12.5 mL 1 mol/L的NaCl溶液,渦旋后靜置分層,棄去上層溶液,下層氯仿層氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL氯仿-甲醇(2∶1,V/V)溶液溶解,得到樣品溶液。以3 mL正己烷活化Waters Sep-Pak硅膠固相萃取柱。上樣,分別加入3 mL正己烷-乙醚(8∶2,V/V)和3 mL正己烷-乙醚(1∶1,V/V)溶液淋洗,再用6 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水(3∶5∶2,V/V)溶液洗脫,收集洗脫液,氮?dú)獯蹈伞? mL甲醇溶解殘?jiān)?,過0.22 μm濾膜。

    因?yàn)榱字N類眾多,不同來源樣品中磷脂種類也不盡相同,所以在對(duì)使用的5 種前處理方法進(jìn)行選擇時(shí),根據(jù)每種方法能夠檢測(cè)到的磷脂種類、相應(yīng)峰的峰面積作為考核指標(biāo),選擇提取得到磷脂種類多且峰面積大的方法作為最優(yōu)的前處理方法。

    1.3.2 UPLC條件

    處理后的樣品用配有ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×75 mm,2 μm)的液相色譜系統(tǒng)分離。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的50 mmol/L乙酸銨溶液(pH 3.18),流動(dòng)相B為乙腈。使用梯度程序洗脫:0~6 min,95%~85% B;16 min,60% B;16.01~20 min,95% B,保持3 min;流速300 μL/min,總運(yùn)行時(shí)間20 min。進(jìn)樣量1.0 μL,柱溫40 ℃。

    1.3.3 MS條件

    電噴霧離子源,干燥氣、霧化氣為氮?dú)?,加熱氣為空氣,干燥氣流?0 L/min,霧化氣流量3 L/min,干燥氣流量10 L/min。離子源溫度300 ℃,脫溶劑溫度250 ℃,加熱塊溫度400 ℃、噴霧電壓±3 000 V。PC、LPE、LPC、LPS在正離子模式下測(cè)定,PA和PG在負(fù)離子模式下測(cè)定。各磷脂測(cè)定參數(shù)見表1。

    表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters in the MRM mode

    1.3.4 方法適應(yīng)性

    為考察方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度,進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。方法的靈敏度用檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)表示。分別測(cè)定質(zhì)量濃度為125 ng/mL的PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)基質(zhì)溶液,測(cè)定信噪比,計(jì)算檢出限(RSN=3)和定量限(RSN=10)??紤]到樣品基質(zhì)中可能含有的磷脂本底情況,添加的磷脂均為基質(zhì)中不含有或含量極少。方法的準(zhǔn)確度和精密度用方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示。向3 g樣品中分別添加125、250 ng/mL和375 ng/mL三個(gè)水平的PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,按上述方法進(jìn)行前處理和UPLC-三重四極桿質(zhì)譜方法測(cè)定。每個(gè)添加水平做6 個(gè)重復(fù),計(jì)算方法回收率和RSD。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 前處理方法的選擇

    利用不同種類磷脂極性頭部的特征碎片進(jìn)行中性丟失掃描或母離子掃描可以在一定程度上說明各前處理方法提取得到的磷脂種類,進(jìn)而判斷各前處理方法性能的優(yōu)劣。各種類磷脂的特征碎片和掃描方式見表2。

    表2 磷脂掃描方式及特征碎片Table 2 Scanning modes and characteristic fragments for phospholipids

    利用母離子掃描和中性丟失掃描的方式分別對(duì)5 種前處理方法抽提得到的磷脂進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)到的磷脂數(shù)量和相關(guān)峰面積結(jié)果見表3。

    表3 前處理方法的選擇Table 3 Selection of pretreatment methods

    在這5 種方法中,異丙醇法和異丙醇-氯仿-水法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較多,但是在相關(guān)峰的峰面積比較中,異丙醇-氯仿-水法比異丙醇法多,且異丙醇法未能測(cè)得PS;其余3 種方法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較少、峰面積較低,BD法未能測(cè)得PI和PE,SPE法未能測(cè)得PI。因此選擇異丙醇-氯仿-水法作為提取磷脂的方法較為合適。

    2.2 磷脂組分的分離

    在HILIC體系中,流動(dòng)相的pH值對(duì)組分的保留和選擇性的影響相比反相體系更大。因此,在實(shí)驗(yàn)中分別使用pH 3.18、pH 4.45、pH 2.78的流動(dòng)相B分析樣品,最終確定在不同的pH值條件下,各磷脂的峰形、流出時(shí)間均有所不同。綜合考察分離及流出情況,選擇流動(dòng)相B的pH值為3.18。

    由于極性頭部的不同,PG、LPI在僅負(fù)離子模式下有響應(yīng);PC、LPC只在正離子模式下有響應(yīng);LPS、LPE在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng),但在負(fù)離子模式下的響應(yīng)更高,因此,PG、LPI、LPE、LPS在負(fù)離子模式下采集,PC、LPC在正離子模式下采集。各磷脂梯度洗脫順序?yàn)镻G<LPI<LPE<PC<LPC<LPS。各組分總離子流圖見圖1。

    圖1 磷脂組分總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram

    2.3 磷脂的裂解規(guī)律

    在外界有能量輸入時(shí),磷脂分子的化學(xué)鍵會(huì)發(fā)生斷裂,產(chǎn)生若干二級(jí)碎片離子,這些離子反映磷脂分子的結(jié)構(gòu),因此這些碎片離子也被稱為特征碎片。根據(jù)特征碎片可以判斷與甘油骨架酯化的脂肪酸殘基和極性頭部,從而確認(rèn)磷脂的分子結(jié)構(gòu)。

    分別將PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(collision-induced dissociation,CID),使其中的化學(xué)鍵進(jìn)行斷裂和重排,獲得其特征碎片,進(jìn)而解釋其裂解規(guī)律。由于磷脂分子結(jié)構(gòu)的不同,不同種類的磷脂會(huì)分別在正離子模式或負(fù)離子模式下有更好地響應(yīng),在本實(shí)驗(yàn)中PC、LPC、LPE、LPS在正離子模式下響應(yīng)更高,而PA、PG在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高。

    圖2 正離子模式下的PC(A)、LPC(B)、LPE(C)、LPS(D)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 Tandem mass spectra of PC (A), LPC (B), LPE (C), and LPS (D) in the positive ion mode

    如圖2A所示,母離子為[M+H]+,m/z 678,磷酸酯鍵被打斷后產(chǎn)生PC([C5H14O4NP+H]+)特征離子,m/z 184,該碎片離子為PC和溶血PC類分子的特征離子。其他的離子碎片m/z 495.4對(duì)應(yīng)[M+H-183]+,m/z 211.2對(duì)應(yīng)脫水肉豆蔻酸殘基離子;m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M+H-183-211]+。在二級(jí)質(zhì)譜圖中無其他脂肪酸殘基碎片,表明在甘油骨架sn-1和sn-2上都與肉豆蔻酸殘基相連。

    如圖2B所示,LPC(C14:0)的二級(jí)質(zhì)譜圖與PC的裂解規(guī)律類似。m/z 468為母離子,對(duì)應(yīng)[M+H]+,在CID模式下,磷酸酯鍵被打斷,產(chǎn)生PC[C5H14O4NP+H]+和[C5H12N+H]+,對(duì)應(yīng)m/z 184和m/z 86。m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M+H-183-211]+。

    如圖2C所示,母離子為[M+H]+,m/z 426,磷酸酯鍵被打斷后出現(xiàn)PE的特征碎片[C2H7O4NP+H]+,m/z 141(未顯示),離子碎片m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M+H-140]+。m/z 211.2為脫水肉豆蔻酸殘基離子。在丟失肉豆蔻酸殘基后,PE再繼續(xù)裂解,中性丟失乙醇胺部分后的碎片對(duì)應(yīng)為m/z 155.01。

    如圖2D所示,m/z 498為母離子[M+H]+,m/z 313.2對(duì)應(yīng)LPS(C16:0)甘油骨架上sn-3位上磷酸酯鍵斷裂后產(chǎn)生的碎片,即[M+H-C3H7O6NP]+;m/z 239.2對(duì)應(yīng)脫水棕櫚酸殘基;m/z 155.01對(duì)應(yīng)[M+H-C16H29O-C3H7O3N]+,即LPS(C16:0)丟失脫水肉豆蔻酸殘基后中性丟失絲氨酸殘基后的碎片。

    圖3 負(fù)離子模式下的PA(C28:0)(A)、PG(C28:0)(B)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 Tandem mass spectra of PA (C28:0) (A) and PG (C28:0) (B)in the negative ion mode

    如圖3A所示,m/z 591為PA(C28:0)的母離子[MH]-,m/z 363.2為磷脂酸sn-1位丟失肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片;m/z 381為sn-1位丟失脫水肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片;m/z 363.2碎片繼續(xù)裂解,丟失sn-2位脫水肉豆蔻酸殘基后得到m/z 153.0離子。圖3A中響應(yīng)值最高的m/z 227.2碎片為脫水肉豆蔻酸殘基。

    如圖3B所示,m/z 665.4為PG(C28:0)的母離子[MH]-,m/z 455.2為PG分子丟失sn-1位脫水肉豆蔻酸殘基產(chǎn)生的碎片;m/z 363.2碎片對(duì)應(yīng)為m/z 455.2碎片上sn-3位甘油殘基繼續(xù)裂解丟失得到;然后該碎片上的sn-2位酯鍵繼續(xù)斷裂丟失脫水肉豆蔻酸殘基,得到m/z 153.0碎片。m/z 227.2對(duì)應(yīng)肉豆蔻酸殘基。

    通過對(duì)正、負(fù)離子模式下各類磷脂裂解規(guī)律的分析可以發(fā)現(xiàn),在受到外界能量輸入時(shí),甘油骨架sn-3位上的磷酸酯鍵以及sn-1和sn-2位上的酯鍵更容易斷裂,產(chǎn)生磷脂的極性頭部和脂肪酸相關(guān)殘基特征碎片,根據(jù)這些特征碎片可以為磷脂做定性分析。

    2.4 方法適應(yīng)性

    2.4.1 方法的線性范圍和靈敏度

    為了避免基質(zhì)效應(yīng),以圓椒樣品提取溶液作為溶劑,分別配制質(zhì)量濃度為10、50、100、500、1 000 ng/mL的PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)溶液質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算各磷脂的LOD和LOQ,結(jié)果見表4。

    表4 磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LOD及LOQTable 4 Standard curves, linear ranges, limits of detection and limits of quantification

    2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

    表5 3 個(gè)添加水平的磷脂回收率與RSD(n=8)Table 5 Recoveries of phospholipids at three spiked levels and relative standard deviation (RSD) (n= 8)

    由表5可知,6 種磷脂在3 個(gè)添加水平的平均回收率在68.06%~84.17%之間,RSD在3.40%~9.60%之間。參照農(nóng)殘分析實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)(LOQ在0.01~0.1 mg/kg時(shí),回收率在70%~120%之間,變異系數(shù)小于22%;LOQ在0.1~1.0 mg/kg時(shí),回收率在70%~110%之間,變異系數(shù)小于18%),該方法基本滿足要求。在各種磷脂中PC和LPC在各添加水平中回收率較高,RSD較小,可能是因?yàn)镻C和LPC在質(zhì)譜中的響應(yīng)更高。

    2.5 方法的應(yīng)用

    由于極性頭部的不同和甘油骨架上酯化的脂肪酸殘基種類眾多,導(dǎo)致磷脂種類數(shù)量十分巨大,市場(chǎng)上的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品種類十分有限且價(jià)格高昂,采用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法鑒別磷脂分子顯然不現(xiàn)實(shí),因此在定性過程中,根據(jù)磷脂的保留時(shí)間和流出順序以及得到的二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行定性分析;同時(shí),雖然不同磷脂在質(zhì)譜中的響應(yīng)不同,定量時(shí)也只能采用相對(duì)定量法進(jìn)行。在HILIC體系中,各磷脂的分離主要依靠極性頭部,定量時(shí),向樣品中分別加入一定量的PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)標(biāo)準(zhǔn)溶液,將其作為對(duì)照為具有相同極性頭部的磷脂定量。同時(shí)將相同類別磷脂做歸一化處理,用以表明各磷脂在同類磷脂中的比例。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)圓椒樣品進(jìn)行測(cè)定,如表6所示。

    表6 圓椒中磷脂種類及其相對(duì)含量Table 6 Types and relative contents of phospholipids in bell pepper determined by the developed method

    由表6可知,圓椒樣品中含有PC、PG、LPS、LPI、LPC、LPE。其中,共發(fā)現(xiàn)7 種PC、6 種LPE、7 種LPC、6 種LPS、6 種PG、6 種PA,共38 種磷脂。各磷脂的含量在0.95~18.49 μg/kg之間。在各種磷脂種類中,PC(C34:2)在PC中占比最高,達(dá)到31.18%;LPE(C16:0)和LPE(C18:1)在LPE中占比最高,分別達(dá)到28.91%和28.75%;LPC(C16:1)在LPC中占比最高,達(dá)到25.37%;在LPS中LPS(C16:3)占比35.55%,含量最高,是最主要的LPS;在PG中PG(C32:0)占比最高,達(dá)到23.89%;在PA中PA(C34:2)的含量最高,為29.83%。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)建立一種針對(duì)圓椒中磷脂含量測(cè)定的方法。分別對(duì)采用甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑,使用液液萃取或固相萃取為凈化方法的前處理過程進(jìn)行討論,最終確定異丙醇-氯仿-水法抽提得到的磷脂種類最多、含量最高。方法以PC(C28:0)、LPE(C14:0)、LPC(C14:0)、PG(C28:0)、PA(C28:0)、LPS(C16:0)為對(duì)照,探討了方法的適應(yīng)性。結(jié)果表明,該方法能夠滿足對(duì)圓椒磷脂含量測(cè)定的要求。

    猜你喜歡
    異丙醇殘基磷脂
    基于各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究δ阿片受體的動(dòng)力學(xué)與關(guān)鍵殘基*
    異丙醇生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展
    云南化工(2021年7期)2021-12-21 07:27:24
    六氟異丙醇-水溶液中紅外光譜研究
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應(yīng)用
    大黃酸磷脂復(fù)合物及其固體分散體的制備和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:02:24
    柚皮素磷脂復(fù)合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    辣椒堿磷脂復(fù)合凝膠的制備及其藥動(dòng)學(xué)行為
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:31
    白楊素磷脂復(fù)合物的制備及其藥動(dòng)學(xué)行為
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    β分子篩的改性及其在甲苯與異丙醇烷基化反應(yīng)中的應(yīng)用
    蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    久久精品国产a三级三级三级| 欧美日本中文国产一区发布| 丝袜美腿诱惑在线| 操出白浆在线播放| av国产精品久久久久影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成年人免费黄色播放视频| 99riav亚洲国产免费| 国产男女内射视频| 黄色成人免费大全| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 免费在线观看日本一区| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av成人av| 操出白浆在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久中文看片网| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩欧美在线二视频 | 亚洲人成电影观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品免费视频内射| 精品乱码久久久久久99久播| tocl精华| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲欧美激情综合另类| 日韩免费高清中文字幕av| 99久久人妻综合| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线观看免费高清a一片| 国产一区二区三区视频了| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 女人被狂操c到高潮| 色播在线永久视频| 午夜福利视频在线观看免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产激情久久老熟女| 99国产精品一区二区三区| videos熟女内射| 老司机影院毛片| 久久这里只有精品19| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品九九99| 一区在线观看完整版| 久久久久久久久免费视频了| 日韩免费av在线播放| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美丝袜亚洲另类 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 久久亚洲真实| www.熟女人妻精品国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人影院久久av| 国产精品永久免费网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 我的亚洲天堂| 亚洲 国产 在线| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| a级毛片黄视频| 99re在线观看精品视频| 国产成人影院久久av| 久久人妻av系列| 久久香蕉精品热| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩有码中文字幕| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲成人免费av在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线免费观看的www视频| 一区二区三区精品91| 国产精品一区二区免费欧美| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av一本久久久久| 麻豆成人av在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 视频在线观看一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 嫩草影视91久久| 亚洲av电影在线进入| 99热网站在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜福利,免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 大型av网站在线播放| 国产精品欧美亚洲77777| 一级毛片精品| 精品一区二区三区av网在线观看| www日本在线高清视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 搡老岳熟女国产| 大香蕉久久网| 69av精品久久久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕av电影在线播放| 午夜激情av网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| tube8黄色片| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜亚洲福利在线播放| 一进一出抽搐动态| 成人18禁在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 三级毛片av免费| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品一二三| 麻豆国产av国片精品| 99国产精品99久久久久| 精品视频人人做人人爽| 欧美日韩一级在线毛片| 曰老女人黄片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久国产成人精品二区 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产男靠女视频免费网站| 满18在线观看网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产男靠女视频免费网站| 欧美在线一区亚洲| 看片在线看免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久精品91无色码中文字幕| 看免费av毛片| 欧美在线黄色| av福利片在线| 9191精品国产免费久久| 悠悠久久av| 精品人妻在线不人妻| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美精品一区二区免费开放| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲av成人一区二区三| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 嫩草影视91久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久人妻av系列| 国产免费男女视频| 日韩免费av在线播放| 高清视频免费观看一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| av天堂久久9| 自线自在国产av| 男女之事视频高清在线观看| 国产激情欧美一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产片内射在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 在线看a的网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜福利欧美成人| 99久久国产精品久久久| 麻豆乱淫一区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人影院久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 又大又爽又粗| 高清欧美精品videossex| 亚洲视频免费观看视频| 国产区一区二久久| 国产高清视频在线播放一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天影视国产精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久香蕉国产精品| av一本久久久久| 嫩草影视91久久| a级毛片在线看网站| 国产激情欧美一区二区| 亚洲视频免费观看视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 麻豆av在线久日| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产av一区二区精品久久| 三级毛片av免费| 亚洲专区国产一区二区| 国产伦人伦偷精品视频| 精品高清国产在线一区| 免费在线观看完整版高清| 操美女的视频在线观看| 悠悠久久av| 99国产精品一区二区蜜桃av | 黄色视频,在线免费观看| www.熟女人妻精品国产| 天天影视国产精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 性少妇av在线| 成人av一区二区三区在线看| a在线观看视频网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品国产美女av久久久久小说| 日本wwww免费看| av免费在线观看网站| 女人久久www免费人成看片| 校园春色视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 一区二区三区精品91| 高清欧美精品videossex| 一二三四社区在线视频社区8| 操美女的视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 一区二区三区精品91| 亚洲在线自拍视频| 韩国精品一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产有黄有色有爽视频| 美女福利国产在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产片内射在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 大香蕉久久成人网| 国产精品1区2区在线观看. | 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产不卡av网站在线观看| e午夜精品久久久久久久| 国产99白浆流出| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲午夜理论影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲av美国av| 国产精品永久免费网站| videos熟女内射| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美精品亚洲一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 91九色精品人成在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日韩视频精品一区| 一区二区三区激情视频| 69av精品久久久久久| 亚洲av成人一区二区三| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 青草久久国产| 欧美大码av| 亚洲三区欧美一区| 性色av乱码一区二区三区2| 人人澡人人妻人| 自线自在国产av| 69av精品久久久久久| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 亚洲免费av在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美日韩视频精品一区| 激情视频va一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 悠悠久久av| 最新的欧美精品一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| а√天堂www在线а√下载 | 99riav亚洲国产免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产av精品麻豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美激情高清一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产91精品成人一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 国产不卡一卡二| 色婷婷av一区二区三区视频| av线在线观看网站| 精品无人区乱码1区二区| 丝袜在线中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av日韩在线播放| 黄片播放在线免费| 国产一卡二卡三卡精品| 久久午夜综合久久蜜桃| a级片在线免费高清观看视频| 高清av免费在线| 午夜福利视频在线观看免费| 成人国语在线视频| av线在线观看网站| 亚洲欧美激情综合另类| av线在线观看网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 悠悠久久av| 一区二区三区精品91| 一二三四在线观看免费中文在| а√天堂www在线а√下载 | 欧美日韩视频精品一区| 国产精品久久久久久精品古装| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品国产高清国产av | 久热爱精品视频在线9| 69av精品久久久久久| 不卡av一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜福利,免费看| 久久ye,这里只有精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 国产xxxxx性猛交| 狂野欧美激情性xxxx| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 视频区图区小说| 中文字幕制服av| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩黄片免| 最新的欧美精品一区二区| 久热爱精品视频在线9| 久久亚洲真实| 久久国产精品影院| 99riav亚洲国产免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜制服| 色综合婷婷激情| 午夜福利免费观看在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久国产精品人妻蜜桃| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕高清在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人影院久久| 国产精品二区激情视频| 窝窝影院91人妻| 欧美日本中文国产一区发布| 99国产精品99久久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| netflix在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 9191精品国产免费久久| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美精品啪啪一区二区三区| cao死你这个sao货| 久热爱精品视频在线9| 亚洲黑人精品在线| 热re99久久国产66热| 一进一出好大好爽视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91在线观看av| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看舔阴道视频| 天堂动漫精品| 国产精品久久电影中文字幕 | 99精国产麻豆久久婷婷| 一级毛片女人18水好多| 在线视频色国产色| 亚洲精品自拍成人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产91精品成人一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品中文字幕在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 国产1区2区3区精品| 精品久久久久久,| 好男人电影高清在线观看| 电影成人av| 成人永久免费在线观看视频| 高清视频免费观看一区二区| 久久精品国产清高在天天线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| videos熟女内射| 一区二区三区精品91| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美色视频一区免费| 在线观看66精品国产| 91成年电影在线观看| 免费不卡黄色视频| 婷婷成人精品国产| 一级片免费观看大全| 国产免费男女视频| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲,欧美精品.| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品国产区一区二| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美乱色亚洲激情| 国产男女超爽视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 深夜精品福利| av天堂久久9| 国产高清激情床上av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| videos熟女内射| 久久这里只有精品19| 国产一区二区三区视频了| 视频在线观看一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 日本欧美视频一区| 国产成人免费观看mmmm| 韩国精品一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品久久久久久久久久免费视频 | 村上凉子中文字幕在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲成人免费av在线播放| 三级毛片av免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 两性夫妻黄色片| 午夜两性在线视频| 18在线观看网站| 国产乱人伦免费视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久国产精品麻豆| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线观看一区二区三区激情| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 999久久久国产精品视频| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲色图av天堂| 天天操日日干夜夜撸| av不卡在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品国产综合久久久| 国产精品.久久久| 欧美最黄视频在线播放免费 | 黄色成人免费大全| 电影成人av| 欧美日韩av久久| 久久亚洲真实| 下体分泌物呈黄色| 国产精品 国内视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| cao死你这个sao货| 欧美激情久久久久久爽电影 | av天堂在线播放| 很黄的视频免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产午夜精品久久久久久| 欧美大码av| 久久中文看片网| 9色porny在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品久久久久久,| 久久草成人影院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产在线观看jvid| 中出人妻视频一区二区| 丁香欧美五月| 中文字幕色久视频| 国产野战对白在线观看| 日本wwww免费看| 午夜免费成人在线视频| 精品国产一区二区久久| 亚洲伊人色综图| 女人精品久久久久毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费在线观看亚洲国产| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 一区二区三区激情视频| 丝袜人妻中文字幕| 少妇 在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲一区二区三区不卡视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 最近最新中文字幕大全电影3 | 成人国产一区最新在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 不卡一级毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品1区2区在线观看. | 精品国产一区二区久久| 999久久久国产精品视频| 波多野结衣一区麻豆| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 俄罗斯特黄特色一大片| 色综合婷婷激情| 国产精品av久久久久免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲av电影在线进入| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 午夜福利影视在线免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成+人综合+亚洲专区| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美日韩av久久| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲美女黄片视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜福利视频在线观看免费| 狂野欧美激情性xxxx| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品免费大片| 日韩免费av在线播放| 制服诱惑二区| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久久国产电影| 视频区图区小说| 动漫黄色视频在线观看| 麻豆av在线久日| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 他把我摸到了高潮在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 人妻久久中文字幕网| av视频免费观看在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲精品av麻豆狂野| 大香蕉久久网| 国产精品电影一区二区三区 | xxx96com| 宅男免费午夜| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久国产精品麻豆| 美国免费a级毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩人妻精品一区2区三区| 一级黄色大片毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 飞空精品影院首页| 99精品久久久久人妻精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99久久国产精品久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 免费在线观看亚洲国产| 搡老岳熟女国产| 久久影院123| 黄色视频不卡| 欧美乱色亚洲激情| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品在线美女| 国产国语露脸激情在线看| 波多野结衣av一区二区av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄片小视频在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 国产欧美亚洲国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女免费视频国产| 女同久久另类99精品国产91| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| www.自偷自拍.com| 欧美黄色淫秽网站| 在线永久观看黄色视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 90打野战视频偷拍视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看|