SPME-GC-MS 結(jié)合電子鼻技術(shù)分析不同品種獼猴桃酒香氣物質(zhì)

趙 寧，魏新元，樊明濤*，張 杰，戚一曼，徐俊南，張 利

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch），又稱羊桃、奇異果、長壽果等[1]，是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）的漿果類果實(shí)[2]，其營養(yǎng)豐富，利用價(jià)值高[3-5]。成熟果實(shí)柔軟多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨(dú)特；除鮮食外，可制成果酒、果汁及果脯等產(chǎn)品[6]。獼猴桃酒營養(yǎng)豐富，清亮透明，酸度適宜，有較強(qiáng)抗氧化活性等保健功能[7]，深受消費(fèi)者喜愛。除營養(yǎng)物質(zhì)外，香氣特性也是評價(jià)獼猴桃酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，其可影響消費(fèi)者的接受度和整體評價(jià)。但是，目前關(guān)于獼猴桃酒的研究主要集中在釀造工藝優(yōu)化、抗氧化性及原酒后處理等方面[8]，對不同獼猴桃酒間香氣特性比較的報(bào)道較少。

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（s o l i d p h a s e microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用和電子鼻技術(shù)是研究食品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的常用有效手段。GC-MS技術(shù)有檢測靈敏度高、操作快速、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，而且有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫可供檢索，是定性和定量的優(yōu)良工具[9]。電子鼻技術(shù)是基于氣體傳感陣列響應(yīng)圖譜識別氣味的電子系統(tǒng)，是一種用途廣泛、實(shí)時(shí)快速無損的風(fēng)味物質(zhì)分析檢測方法[10-11]；該技術(shù)已用于乳制品[12]、肉制品[13]、食用油[14]、酒[15]、水果[16]、果汁[17]及茶[18]等食品的風(fēng)味分析中。然而，目前鮮見利用電子鼻技術(shù)分析獼猴桃酒香氣特性的相關(guān)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以中華獼猴桃（黃金果）、美味獼猴桃（徐香和海沃德）為原料釀造獼猴桃酒，采用SPMEGC-MS和電子鼻技術(shù)相結(jié)合的方法檢測其揮發(fā)性風(fēng)味成分，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）探索3 種獼猴桃酒香氣特性的差異，從而為適宜釀酒獼猴桃品種選擇、獼猴桃酒整體品質(zhì)評價(jià)及其香氣控制和提升提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃原料購于陜西省楊凌農(nóng)貿(mào)市場（徐香、海沃德和黃金果）；釀酒酵母WLP775為西北農(nóng)林科技大學(xué)釀酒與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；2-辛醇（內(nèi)標(biāo)）、正構(gòu)烷烴混合標(biāo)品（C6～C25） 美國Sigma公司；果膠酶上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ISQ GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司；手動SPME進(jìn)樣器、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）手動萃取頭、HP-INNOWAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國Supelco公司；PEN3型便攜式電子鼻 德國Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃酒的釀造[19]

本實(shí)驗(yàn)以3 個(gè)不同品種獼猴桃為原料，采用與生產(chǎn)相類似的工藝釀造獼猴桃酒。

1.3.1.1 釀造工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

選擇成熟度好，無腐爛變質(zhì)的獼猴桃；裝罐前用SO2熏罐，并加入60 mg/L SO2；在果汁中添加60 mg/L果膠酶，室溫酶解8 h，提高出汁率；按5%的量接入酵母種子液進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度22 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d，當(dāng)可溶性固形物含量基本不變、還原糖含量低于4 g/L時(shí)終止發(fā)酵；倒罐時(shí)添加SO2以抑制發(fā)酵的進(jìn)行和使原酒盡快澄清；陳釀在低溫下進(jìn)行。

1.3.2 SPME-GC-MS測定香氣成分

1.3.2.1 SPME條件

取15 mL樣品裝入40 mL的萃取瓶中，加入5 g NaCl和40 μL內(nèi)標(biāo)2-辛醇（溶于乙醇，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL），用聚四氟乙烯-硅膠隔墊加蓋密封，40 ℃平衡15 min，然后將已老化（270 ℃，1 h）的萃取頭插入樣品瓶，頂空萃取30 min，攪拌速率300 r/min。

1.3.2.2 GC條件

HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；不分流進(jìn)樣；載氣（He）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230 ℃。

1.3.2.3 MS條件

電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度240 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 45～450。

1.3.2.4 定性和定量

定性：未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的同時(shí)與NIST Library和Wiley Library相匹配，選擇匹配度較高的檢索結(jié)果，并與文獻(xiàn)中相關(guān)化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）比對分析確定；定量：以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.3.3 特征香氣成分的確定

特征香氣由氣味活性值（odor activity value，OAV）確定，當(dāng)OAV不小于1時(shí)即可被確定為特征香氣物質(zhì)。OAV是香氣物質(zhì)的濃度與其感覺閾值之比。

1.3.4 電子鼻檢測

表1 PEN3電子鼻傳感器陣列及其主要特性Table 1 Sensors used in PEN3 electronic nose and their main properties

PEN3型電子鼻傳感器由10 種金屬氧化物傳導(dǎo)陣列構(gòu)成，不同傳感器性能描述如表1所示。準(zhǔn)確量取10 mL獼猴桃酒樣置于30 mL樣品瓶中，密封室溫平衡15 min，插入電子鼻探頭吸取頂端空氣，測定揮發(fā)性物質(zhì)。電子鼻參數(shù)設(shè)置：檢測時(shí)間60 s，預(yù)進(jìn)樣5 s，清洗時(shí)間300 s，進(jìn)樣流量300 mL/min，載氣流速300 mL/min。測定時(shí)傳感器響應(yīng)值逐漸增大，第50秒后趨于平緩，取第51秒處信號作為傳感器信號分析的時(shí)間點(diǎn)。每種酒樣重復(fù)測定10 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析，采用GraphPad Prism 6.0繪圖。電子鼻所測數(shù)據(jù)用其自帶的Winmuster軟件進(jìn)行PCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS測定不同獼猴桃酒中香氣物質(zhì)

表2 獼猴桃酒中香氣物質(zhì)的GC-MS鑒定結(jié)果Table 2 Aroma compounds in kiwifruit wines identi fied by GC-MS

續(xù)表2

如表2所示，獼猴桃酒中共檢出63 種香氣物質(zhì)，包括醇類13 種、酯類28 種、酸類7 種、萜烯類7 種、醛酮類3 種、酚類4 種、呋喃類1 種，3 種酒中共有物質(zhì)35 種。徐香酒、海沃德酒和黃金果酒中分別檢出52、45 種和46 種，總質(zhì)量濃度分別為81.56、43.92 mg/L和15.07 mg/L。

圖1 獼猴桃酒中各類香氣物質(zhì)總量比較Fig. 1 Comparison of total contents of various volatile classes in kiwifruit wines

如圖1所示，3 種獼猴桃酒中含量最高的前三類香氣物質(zhì)均依次為醇類、酯類和酸類，含量最低的均為醛酮類，這種香氣特性與市售的同類商品基本一致。3 種酒中醇類和酯類總量差異顯著，且均為徐香酒中最高，黃金果酒中最低；徐香酒和黃金果酒中酸類總量差異不顯著，且海沃德酒中酸類總量顯著高于這2 種酒。此外，海沃德酒和黃金果酒中酚類總量高于萜烯類總量，而徐香酒中萜烯類物質(zhì)總量較高。

2.1.1 獼猴桃酒中醇類化合物分析

醇類化合物是酵母通過糖分解代謝或脫羧反應(yīng)和氨基酸的脫氨基作用形成的代謝產(chǎn)物[23]，適宜濃度該類物質(zhì)可襯托酯香，促進(jìn)香氣的協(xié)調(diào)性，是果酒中重要的香氣物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，徐香酒所含醇類化合物質(zhì)量濃度最高（56.58 mg/L），其次是海沃德酒（21.23 mg/L），黃金果酒中最低（6.77 mg/L）。3 種獼猴桃酒中共檢出13 種醇類物質(zhì)，共有的8 種，分別為1-戊醇、正己醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇和癸醇。3-甲硫基丙醇又稱菠蘿醇，存在于水果、啤酒、白酒、果酒和醬油中，濃度較低時(shí)有洋蔥和肉湯的氣味，3 種獼猴桃酒中該物質(zhì)質(zhì)量濃度在17.79 μg/L～1.40 mg/L間，均在報(bào)道果酒中的含量范圍內(nèi)（10.1 μg/L～1.47 mg/L）[24]。徐香酒中檢出10 種醇類物質(zhì)，海沃德檢出11 種，黃金果酒檢出10 種；此外，3 種酒中含量最高的均為苯乙醇。苯乙醇是莽草酸衍生物，有玫瑰花香和薔薇香；異戊醇是雜醇油或高級醇的主要成分，有蘋果白蘭地香氣和辛辣味[25]。3-辛醇和1-戊烯-3-醇僅在海沃德酒中檢出，說明該獼猴桃酒玫瑰香味和橙似水果香氣更加濃郁。

2.1.2 獼猴桃酒中酯類化合物分析

酯類主要來源于果實(shí)和乙醇發(fā)酵，具有水果香氣，是對酒香氣有很大影響的一類呈發(fā)酵香化合物[26]。在本研究中，徐香酒中酯類質(zhì)量濃度（19.11 mg/L）顯著高于海沃德酒（14.64 mg/L）和黃金果酒（3.95 mg/L），這與醇類含量趨勢相一致。3 個(gè)獼猴桃酒樣中共檢出酯類28 種，共有的17 種，其中脂肪酸乙酯占50%，乙酸高級醇酯占25%，芳香酯和脂肪酸甲酯各占12.5%。徐香酒中共檢出22 種酯類化合物，其中乙酸乙酯質(zhì)量濃度最高（6.37 mg/L）；黃金果酒和海沃德酒中分別檢出24 種和19 種，且質(zhì)量濃度最高的均為乙酸異戊酯（0.77、5.93 mg/L）。徐香酒中4 種芳香酯（甲酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯）的質(zhì)量濃度均顯著高于黃金果酒和海沃德酒，說明該酒樣有更加濃郁的玫瑰花香、蘋果香和蜂蜜樣香氣。

2.1.3 獼猴桃酒中酸類化合物分析

脂肪酸類物質(zhì)在濃度較低時(shí)呈奶油和奶酪香，濃度太高則會產(chǎn)生酸澀味和腐臭味[27]；其可與醇類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成酯類，使酒體香氣更加協(xié)調(diào)、平衡[28]。徐香酒、黃金果酒、海沃德酒中分別檢出5、4 種和6 種酸類物質(zhì)，共有的3 種，分別為己酸、辛酸和癸酸；此外，這3 種酒中含量最高的均為辛酸。辛酸通常呈油性霉味和腐臭味，但當(dāng)其濃度較低時(shí)，具有令人愉悅的奶酪香和水果香。

2.1.4 獼猴桃酒中萜烯類化合物分析

萜烯類化合物一般以糖苷形式存在于果實(shí)中，果酒釀造過程中，在酸或酶水解作用下形成游離態(tài)具有揮發(fā)性的物質(zhì)，從而賦予果酒水果香和花香，是果酒中重要的品種香氣；此外，該類物質(zhì)香氣閾值較低，即使在較低濃度下對果酒香氣也有較大貢獻(xiàn)[20]。3 種獼猴桃酒中共檢出7 種萜烯類物質(zhì)，共有的2 種，分別為香茅醇和桉葉油醇。香茅醇可賦予果酒濃郁的玫瑰花香，而桉葉油醇具有薄荷香氣和熱帶水果的甜香。徐香酒中檢出7 種萜烯類物質(zhì)，總量為1.01 mg/L，其中含量最高的為(-)-4-萜品醇；黃金果酒和海沃德酒中均檢出3 種，含量最高的分別為桉葉油醇和4-萜烯醇。蘇合香烯、α-松油醇和胡椒酮僅存在于徐香酒中。

2.1.5 獼猴桃酒中醛酮類化合物分析

醛酮類物質(zhì)可通過醇氧化形成，可為果酒提供水果香，但這類化合物不穩(wěn)定，會進(jìn)一步氧化成羧酸，使其含量降低[29]。本實(shí)驗(yàn)酒樣中僅檢出苯甲醛一種醛類物質(zhì)，該物質(zhì)可賦予獼猴桃酒苦杏仁氣味，且在徐香酒中含量最高。此外，檢出2 種酮類物質(zhì)，具體為甲基庚烯酮和仲辛酮，其中前者在3 個(gè)酒樣中均有檢出，而后者僅存在于徐香酒中。

2.1.6 獼猴桃酒中酚類和呋喃類化合物分析

苯酚類化合物濃度較高時(shí)可賦予果酒類似藥的香氣[30]。3 種獼猴桃酒中共檢出4 種酚類物質(zhì)，共有的3 種，分別為丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚；且對乙烯基愈創(chuàng)木酚為3 個(gè)酒樣中含量最高的酚類物質(zhì)。丁香酚在徐香酒中含量最高，因此該酒樣具有濃郁的丁香花香；此外，呈康乃馨和焦糖香的異丁香酚僅存在于徐香酒中。僅檢出2,3-二氫苯并呋喃一種呋喃類化合物。

2.2 獼猴桃酒特征香氣物質(zhì)比較分析

表3 獼猴桃酒特征香氣成分OAV分析Table 3 OAV analysis of aroma characteristics of kiwifruit wines

OAV是評價(jià)揮發(fā)性物質(zhì)對酒整體香氣感官貢獻(xiàn)率的常用方法。當(dāng)OAV大于1時(shí)，該香氣物質(zhì)能被人感知；但OAV小于1的揮發(fā)性物質(zhì)也不應(yīng)被忽視，其對酒整體香氣也起一定的促進(jìn)和協(xié)調(diào)作用[31]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道香氣物質(zhì)的感覺閾值及其特征描述，結(jié)合GC-MS檢測結(jié)果，共得到16 種特征香氣物質(zhì)。由表3可知，徐香酒、海沃德酒和黃金果酒中分別有14、12 種和8 種特征香氣物質(zhì)，3 種酒中共有的7 種，包括丁酸甲酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸、桉葉油醇、丁香酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚。陳紅梅等[32]發(fā)現(xiàn)丁酸甲酯、乙酸異戊酯及正己酸乙酯也是野生獼猴桃酒的特征香氣物質(zhì)。3-甲硫基丙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯和癸酸僅在徐香酒中OAV大于1，說明這4 種物質(zhì)是徐香酒區(qū)別于其他2 種酒的特征香氣物質(zhì)；這與戚一曼等[33]的研究結(jié)果一致。苯乙醇、丁酸乙酯和癸酸乙酯在徐香和海沃德酒中的OAV大于1，即這2 種酒和黃金果酒相比較具有更濃郁的玫瑰香、蜂蜜香、水果香及脂肪味。4-萜烯醇僅在海沃德酒中OAV大于1，說明該酒有更濃郁的青草香和甜香。由此可知，3 種酒香氣物質(zhì)的獨(dú)特性與辨識度從高到底依次為徐香酒、海沃德酒和黃金果酒。

2.3 電子鼻分析不同獼猴桃酒中香氣物質(zhì)

2.3.1 獼猴桃酒電子鼻傳感器響應(yīng)值的對比分析

圖2 3 種獼猴桃酒的電子鼻雷達(dá)圖Fig. 2 Electronic nose radar profiles of three kiwifruit wines

將徐香酒、海沃德酒和黃金果酒的電子鼻數(shù)據(jù)作雷達(dá)圖，對比結(jié)果如圖2所示。電子鼻每個(gè)傳感器對3 種獼猴桃酒均有明顯的響應(yīng)，且響應(yīng)值均不相同，其中傳感器W5S、W1W、W2S和W1S的響應(yīng)值顯著高于其他傳感器的，這與馬婷等[34]對亞特獼猴桃果實(shí)香氣特性的研究結(jié)論相一致；此外，秦美獼猴桃低溫貯藏過程中，W5S和W1W的響應(yīng)值也顯著高于其他傳感器的[35]。

徐香酒在W1W和W2S傳感器上的響應(yīng)值均顯著高于海沃德酒和黃金果酒的，這2 個(gè)傳感器分別對萜烯類和醇類物質(zhì)敏感。W1C、W3C和W5C均對芳香類物質(zhì)敏感，與其他7 個(gè)傳感器相比，獼猴桃在這3 個(gè)傳感器上的響應(yīng)值均較?。磺尹S金果酒在W1C和W5C上的響應(yīng)值高于其他2 種酒的。海沃德酒在W5S上的響應(yīng)值低于徐香酒和黃金果酒的，但是在W2W上的響應(yīng)值高于其他2 種酒。3 種獼猴桃酒在W1S、W3S和W6S傳感器上的響應(yīng)值均為徐香酒最高，海沃德酒次之，黃金果酒最低。由上述分析可知，3 種獼猴桃酒的香氣特性有較大差異，且徐香酒中香氣物質(zhì)最豐富，特別是萜烯類和醇類，這與GC-MS檢測結(jié)果基本一致。

2.3.2 電子鼻結(jié)合PCA區(qū)分不同獼猴桃酒

如圖3A所示，PC1貢獻(xiàn)率為72.53%，PC2貢獻(xiàn)率為16.92%，總貢獻(xiàn)率為89.45%，大于85%，說明不同獼猴桃酒之間風(fēng)味相互獨(dú)立，且這2 個(gè)主成分可代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。每組樣品測定數(shù)據(jù)均能成團(tuán)，說明電子鼻數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。3 種不同獼猴桃酒樣的香氣成分區(qū)域無交叉，從PC1角度看，徐香酒和黃金果酒位于正向端，而海沃德酒位于負(fù)向端；從PC2角度看，海沃德酒和黃金果酒位于正向端，而徐香酒位于負(fù)向端。由上述分析可得，PCA法可將3 種不同獼猴桃酒的香氣物質(zhì)完全區(qū)分，且徐香酒和海沃德酒風(fēng)味差別最明顯。

圖3 獼猴桃酒電子鼻PCA（A）和載荷分析（B）圖Fig. 3 PCA (A) and loading analysis (B) of electronic nose sensor data of kiwifruit wines

由圖3B可知，W1S和W2S對PC1貢獻(xiàn)率最大，W5C對PC2貢獻(xiàn)率最大；結(jié)合圖3A可知，海沃德酒香氣特性和其他2 種酒的差異主要體現(xiàn)在有機(jī)硫化物上，黃金果酒與其他2 種酒香氣物質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在芳香類物質(zhì)上，而徐香酒與其他2 種酒差異主要體現(xiàn)在醇類、萜烯類、氮氧化物和甲基類物質(zhì)上。因此，通過對電子鼻數(shù)據(jù)的PCA，進(jìn)一步驗(yàn)證了GC-MS分析的3 種獼猴桃酒香氣特性的差異；此外可采用電子鼻技術(shù)對不同品種獼猴桃所釀造的獼猴桃酒進(jìn)行區(qū)分。

3 結(jié) 論

結(jié)果表明獼猴桃酒具有較豐富的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，且不同品種獼猴桃所釀造果酒香氣特性有較大差異。采用SPME-GC-MS法對不同獼猴桃酒中香氣物質(zhì)進(jìn)行全面檢測分析，3 種獼猴桃酒中共檢出63 種香氣物質(zhì)，其中醇類13 種、酯類28 種、酸類7 種、萜烯類7 種、醛酮類3 種、酚類4 種、呋喃類1 種。香氣物質(zhì)總量從高到低依次為徐香酒、海沃德酒和黃金果酒，且徐香酒中香氣物質(zhì)種類數(shù)最多。OAV法鑒定出丁酸甲酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸、桉葉油醇、丁香酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚為3 種獼猴桃酒共有特征香氣物質(zhì)。此外，電子鼻對獼猴桃酒香氣物質(zhì)有明顯響應(yīng)，利用PCA法可完全將徐香酒、黃金果酒和海沃德酒區(qū)分，且電子鼻與GC-MS測定結(jié)果基本一致，均表明徐香酒與海沃德酒風(fēng)味差異最明顯。因此，可利用GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)對不同獼猴桃酒香氣特性進(jìn)行綜合評價(jià)和區(qū)別，這將為獼猴桃酒釀造原料的選擇及其香氣品質(zhì)的調(diào)控和提升提供理論依據(jù)。