浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化與有機(jī)酸形成相關(guān)性分析

方冠宇，穆曉靜，蔣予箭*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

浙江玫瑰醋是江浙一帶的傳統(tǒng)調(diào)味品，有悠久的生產(chǎn)歷史。浙江玫瑰醋在發(fā)酵過(guò)程中，沒有人工添加菌種，米飯經(jīng)“發(fā)花”后“沖缸放水”，由于微生物的優(yōu)勝劣汰，在微生物達(dá)到平衡的同時(shí)，不斷使原料進(jìn)行糖化、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵以及產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)。玫瑰醋在發(fā)酵過(guò)程中，風(fēng)味物質(zhì)的生成與發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的代謝活動(dòng)密切相關(guān)。有機(jī)酸是玫瑰醋中的重要風(fēng)味物質(zhì)，乙酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等[1-3]不揮發(fā)性有機(jī)酸能夠調(diào)和酸味，優(yōu)質(zhì)食醋中含有較高的不揮發(fā)酸，能夠賦予食醋輕柔的口感[4]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[5-11]和高通量測(cè)序[12-13]等技術(shù)被應(yīng)用于發(fā)酵食品中。發(fā)酵食品中的微生物群落的組成、發(fā)酵過(guò)程中的變化[14-17]以及功能[18-20]越來(lái)越多地被研究。何同杰[21]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了酸面團(tuán)中微生物的多樣性及其風(fēng)味物質(zhì)代謝，發(fā)現(xiàn)酸面團(tuán)中的細(xì)菌主要為乳酸桿菌屬且其多樣性比較豐富，酸面團(tuán)中有機(jī)酸主要由乳酸桿菌屬產(chǎn)生，通過(guò)添加舊金山乳酸桿菌，酸面團(tuán)中的有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可以顯著提高。牟穰[22]對(duì)清爽型黃酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)及其與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在黃酒發(fā)酵過(guò)程中醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬與草酸、酒石酸具有較高的相關(guān)性，這與浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中乳酸桿菌屬與草酸、酒石酸具有負(fù)相關(guān)性不同。許偉[23]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術(shù)和克隆文庫(kù)分析方法研究了鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)，除獲得幾種常見的醋酸菌之外，還得到了較多種類的乳酸菌。王宗敏[24]對(duì)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)變化與風(fēng)味物質(zhì)組成之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌屬與乳酸桿菌屬在鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中起著主要作用，并且隨著發(fā)酵進(jìn)行醋酸桿菌屬相對(duì)豐度上升，乳酸桿菌屬相對(duì)豐度下降，這與浙江玫瑰醋發(fā)酵主發(fā)酵過(guò)程情況一致。

浙江玫瑰醋以秈米為原料，進(jìn)行浸泡、蒸煮后，在陶缸內(nèi)搭窩，依靠空氣中的霉菌掉落在米飯表面，對(duì)淀粉進(jìn)行糖化，這個(gè)過(guò)程稱為“發(fā)花”。糖化結(jié)束之后，在陶缸內(nèi)加水進(jìn)行乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵稱為“沖缸放水”。當(dāng)發(fā)酵液的總酸含量不再上升時(shí)，加入發(fā)酵液質(zhì)量3%的NaCl終止發(fā)酵。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)“沖缸放水”后的玫瑰醋細(xì)菌群落變化進(jìn)行分析，并用高效液相色譜對(duì)發(fā)酵過(guò)程中玫瑰醋有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定。采用雙向正交偏最小二乘（bidirectiona orthogonal partial least squares，O2PLS）法對(duì)細(xì)菌群落數(shù)據(jù)集和有機(jī)酸含量數(shù)據(jù)集之間的相關(guān)性進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和挖掘，找到與有機(jī)酸變化高度相關(guān)的細(xì)菌種類，為找尋玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中的功能微生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中晚秈米為安徽滁州產(chǎn)。

磷酸二氫銨、磷酸均為分析純；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：乳酸、丙酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、草酸（純度＞99%）；土壤DNA提取試劑盒 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGW16臺(tái)式高速微量離心機(jī) 上海中科生物醫(yī)學(xué)高科技開發(fā)有限公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀日本島津公司；無(wú)菌注射器 新蘇醫(yī)療器械有限公司；UPWS-1-60D超純水設(shè)備 杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浙江玫瑰醋釀造工藝

秈米100 kg浸泡7 d（每2 d換1 次水）。常壓蒸飯30 min，將蒸熟的米飯自然冷卻，放入500 kg的陶缸中，將米飯搭成窩狀?？諝庵械奈⑸镞M(jìn)入米飯中，使米飯?zhí)腔?。?dāng)飯窩內(nèi)出現(xiàn)糖液時(shí)，每天將糖液回澆在米飯表面1 次。當(dāng)飯窩里的糖液高度達(dá)到米飯高度的4/5時(shí)（米飯放入陶缸后15 d左右），向陶缸內(nèi)加入300 kg水進(jìn)行發(fā)酵。在此過(guò)程中需要定期對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行攪動(dòng)，散發(fā)發(fā)酵產(chǎn)生的熱量、通入氧氣以及使物料混合均勻。當(dāng)發(fā)酵液的酸度不再升高時(shí)（加水后4 個(gè)月左右），向發(fā)酵液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的NaCl終止發(fā)酵。再在缸口用塑料膜密封，陳釀1 個(gè)月。

1.3.2 取樣

玫瑰醋“沖缸放水”后，分別在第0（“沖缸放水”當(dāng)天）、10、20天……第90天分別取樣，取樣時(shí)先將發(fā)酵液混合均勻。

1.3.3 高通量測(cè)序

按照土壤DNA提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)醋樣中微生物DNA進(jìn)行提取。將提取合格的DNA送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行個(gè)通量測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)：MiSeq；測(cè)序區(qū)域：細(xì)菌V4區(qū)。

1.3.4 有機(jī)酸測(cè)定

高效液相色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：5%甲醇-95%磷酸二氫銨（6 g/L；pH 2.60）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

主要利用O2PLS法[25]對(duì)玫瑰醋“沖缸放水”后發(fā)酵過(guò)程中的微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。該方法是傳統(tǒng)偏最小二乘法的延伸，是一種采用潛變量技術(shù)進(jìn)行回歸的分析方法[26]。O2PLS的基本原理如圖1所示，O2PLS將X和Y變量總共分為3 個(gè)部分：i）X和Y彼此相關(guān)的變量；ii）X與Y不相關(guān)的變量；iii）Y與X不相關(guān)的變量。第ii部分和第iii部分變量分別可以再分為兩個(gè)部分：ii-1）相當(dāng)于正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法的成分（orthogonal in X（OPLS），orthogonal in Y（OPLS）），該部分會(huì)對(duì)O2PLS模型的預(yù)測(cè)和解釋有貢獻(xiàn)；ii-2）相當(dāng)于主成分分析（principal components analysis，PCA）的成分（orthogonal in X（PCA），orthogonal in Y（PCA）），該部分不會(huì)影響O2PLS模型的預(yù)測(cè)功能，但是可以改善模型的解釋能力。

圖1 O2PLS的基本原理Fig. 1 Schematic demonstration of O2PLS model

通過(guò)上面對(duì)O2PLS方法的模型分解，可以用下面的公式表達(dá)O2PLS：

式中：lX′和lY′分別表示X與Y不相關(guān)變量、Y與X不相關(guān)變量，l表示得分值；TP’和UQ’表示X與Y相關(guān)部分的變量，T和U表示得分值，P’和Q’表示載荷值，得分值與載荷值都通過(guò)交叉檢驗(yàn)確定；ToPo’和UoQo’表示X與Y不相關(guān)部分的變量，To和Uo表示得分值，Po’和Qo’表示載荷值；E和F分別表示X和Y的殘差。

用軟件Simca-p的分析步驟如下：1）輸入數(shù)據(jù)集，定義變量性質(zhì)：玫瑰醋發(fā)酵時(shí)間為觀測(cè)變量共10 個(gè)；細(xì)菌相對(duì)豐度數(shù)據(jù)集為自變量（X）共100 個(gè)（相對(duì)豐度前100 個(gè)屬）；有機(jī)酸數(shù)據(jù)為因變量Y共有10 個(gè)，定義結(jié)束后建立模型。2）指定O2PLS模型，進(jìn)行擬合。3）分析擬合結(jié)果，評(píng)價(jià)模型效果，Simca-p提供了豐富的圖示功能，可以繪制各類圖形，根據(jù)圖表結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異點(diǎn)，確定模型的精度要求。4）通過(guò)相關(guān)性矩陣以及各個(gè)統(tǒng)計(jì)量尋找分析每個(gè)有機(jī)酸與細(xì)菌之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群變化

2.1.1 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌門水平變化

圖2 0 d醋樣門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 2 Relative abundances of major bacterial phyla in vinegar sample on day 0

圖3 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中門水平細(xì)菌相對(duì)豐度變化Fig. 3 Changes in relative abundances of major bacterial phyla during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

由于第0天為玫瑰醋剛“沖缸放水”后的樣品，因此0 d樣品中的微生物全部來(lái)自于玫瑰醋“發(fā)花”過(guò)程，其門水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖2。第0天的樣品中總共檢測(cè)出5 個(gè)門。分別為變形菌門（Proteobacteria，40.65%）、厚壁菌門（Firmicutes，55.09%）、放線菌門（Actinobacteria，4.04%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.21%）、梭桿菌門（Fusobacteria，0.011%）。這些細(xì)菌與欒同青[27]研究的黃酒中細(xì)菌種類一致，也與浙江玫瑰醋在“沖缸放水”后主要先進(jìn)行乙醇發(fā)酵的實(shí)際情況相符。

玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中，總共檢測(cè)到25 個(gè)門。對(duì)浙江玫瑰醋發(fā)酵不同時(shí)間發(fā)酵液中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖3所示，變形菌門和厚壁菌門在整個(gè)玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度之和大于95%。在發(fā)酵過(guò)程中，除早期發(fā)酵（0～10 d）變形菌門相對(duì)豐度略微降低，厚壁菌門的豐度略微增加外。其他發(fā)酵階段，變形菌門相對(duì)豐度持續(xù)升高，而厚壁菌門相對(duì)豐度持續(xù)降低。這是由于玫瑰醋的前期發(fā)酵為乙醇發(fā)酵，到發(fā)酵第7天左右，發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，后面的發(fā)酵以醋酸發(fā)酵為主導(dǎo)。直到80～90 d，厚壁菌門的相對(duì)豐都接近0，變形菌門的相對(duì)豐度達(dá)到最高，兩者趨于穩(wěn)定。說(shuō)明玫瑰醋在發(fā)酵過(guò)程中變形菌門起主導(dǎo)作用。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中放線菌門和擬桿菌門一直存在，但是相對(duì)豐度很低。

2.1.2 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌屬水平變化

由于在提取基因組時(shí)，人體、空氣等外界環(huán)境也會(huì)因人員操作而帶入微生物，在擴(kuò)增及測(cè)序環(huán)節(jié)使外界環(huán)境微生物與樣品微生物一起被測(cè)出。為排除人為操作以及測(cè)序時(shí)機(jī)器讀取誤差，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究?jī)H對(duì)相對(duì)豐度不小于1%的細(xì)菌屬進(jìn)行分析。

圖4 玫瑰醋釀造過(guò)程中主要細(xì)菌屬相對(duì)豐度變化Fig. 4 Changes in relative abundances of major bacterial genera during the fermentation of rosy vinegar

浙江玫瑰醋是對(duì)傳統(tǒng)工藝特色保留比較完整的一種調(diào)味品，其純粹依靠空氣中多種微生物在煮熟的米飯中生長(zhǎng)、繁殖，通過(guò)菌群的優(yōu)勝劣汰，在達(dá)到微生物平衡的同時(shí)，使淀粉物質(zhì)不斷液化、糖化、酒化、醋化等過(guò)程。由圖4可以看出，玫瑰醋在“沖缸放水”后，醋醪中的細(xì)菌的演替過(guò)程。除去第0天的樣品，醋醪中的醋酸桿菌屬（Acetobacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的豐度達(dá)到80%以上。說(shuō)明玫瑰醋在發(fā)酵過(guò)程中醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬起主導(dǎo)作用。在“沖缸放水”后的1 周時(shí)間里，玫瑰醋主要進(jìn)行乙醇發(fā)酵，在第7天左右，醋醪的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值，而后主要進(jìn)行醋酸發(fā)酵，因此在10 d以后醋酸桿菌的相對(duì)豐度呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，在第60天其豐度達(dá)到最高，60 d后醋酸桿菌屬的相對(duì)豐度出現(xiàn)波動(dòng)，說(shuō)明醋酸桿菌屬的豐度達(dá)到平衡。在發(fā)酵過(guò)程中乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，這是由于玫瑰醋在發(fā)酵過(guò)程中，不斷對(duì)發(fā)酵液中的糖分進(jìn)行消耗，發(fā)酵液的pH值也不斷降低，對(duì)醋酸桿菌屬產(chǎn)生了抑制作用。玫瑰醋的發(fā)酵過(guò)程無(wú)人工添加菌種，由于米飯表面很適宜霉菌生長(zhǎng)，因此“發(fā)花”過(guò)程中，大量霉菌在米飯表面生長(zhǎng)繁殖使米飯充分糖化?！皼_缸放水”后，隨著糖分濃度的降低，細(xì)菌會(huì)迅速繁殖，但由于適宜的糖濃度乙醇發(fā)酵很迅速，在發(fā)酵第7天時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了最高值7%左右（圖5）。因此隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高不耐乙醇的細(xì)菌消失，醋酸桿菌屬等細(xì)菌迅速繁殖進(jìn)行醋酸發(fā)酵。玫瑰醋為靜態(tài)表面發(fā)酵，其主要的發(fā)酵過(guò)程集中在發(fā)酵液表面，由于發(fā)酵產(chǎn)熱，發(fā)酵液表面的溫度最高可達(dá)40 ℃左右，這種高溫使不耐熱的細(xì)菌不易生長(zhǎng)。玫瑰醋發(fā)酵只有液面接觸氧氣，液面以下的發(fā)酵液隔絕氧氣，適合一些厭氧或兼性厭氧菌的生長(zhǎng)，因此醋醪中乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度較高。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分消耗以及pH值持續(xù)下降，許多不耐酸細(xì)菌就會(huì)消失。經(jīng)過(guò)醋醪環(huán)境的多重選擇，醋醪中的微生物趨于穩(wěn)定，這種現(xiàn)象可以看做微生物的“自我凈化”。

圖5 浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中乙醇體積分?jǐn)?shù)變化Fig. 5 Change in alcohol content during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

經(jīng)過(guò)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)與平衡，醋醪中的微生物趨于穩(wěn)定。除相對(duì)豐度較高的醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬外，還有一些相對(duì)豐度較低的細(xì)菌能夠適應(yīng)醋醪環(huán)境一直存在與整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，如腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。這與固態(tài)發(fā)酵醋的細(xì)菌種類有所差異，固態(tài)發(fā)酵醋發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌除醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬外，其他細(xì)菌為乳球菌屬、葡糖醋酸桿菌屬、腸球菌屬、黃單胞桿菌屬和芽孢桿菌屬[24]。除醋酸桿菌和乳酸桿菌屬外，腸球菌屬和芽孢桿菌屬在兩種醋的發(fā)酵過(guò)程中都存在。其中，芽孢桿菌屬雖然豐度很低，但它們對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成起著重要的作用[28]。有研究表明[29]，假單胞菌可以川芎嗪以及其合成前體2,3-丁二酮、3-羥基丁酮。假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬在黃酒發(fā)酵過(guò)程中有檢出[22]，這兩種菌在玫瑰醋中檢出可能是由于玫瑰醋前期發(fā)酵主要為乙醇發(fā)酵，類似于黃酒發(fā)酵過(guò)程。

2.2 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸組成

2.2.1 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化

圖6 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化Fig. 6 Changes in organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵過(guò)程中玫瑰醋樣品的9 種有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖6。在整個(gè)玫瑰醋的發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，在80～90 d，有機(jī)酸含量略微下降，說(shuō)明玫瑰醋發(fā)酵基本結(jié)束。在第0天時(shí)，有機(jī)酸質(zhì)量濃度高達(dá)37.60 g/L，乳酸質(zhì)量濃度高達(dá)22.44 g/L，說(shuō)明在玫瑰醋的“發(fā)花”階段積累了大量有機(jī)酸。乳酸含量除在前期發(fā)酵（0～10 d）略微上升外，在發(fā)酵過(guò)程中一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。乳酸主要在3 個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生：1）大米在浸泡過(guò)程；2）“發(fā)花”過(guò)程；3）早期發(fā)酵過(guò)程。大米在浸泡的過(guò)程中由于乳酸菌等微生物的作用，產(chǎn)生大量乳酸?！鞍l(fā)花”過(guò)程中自然培養(yǎng)生成的紅曲霉、根霉和毛霉等是玫瑰醋中生成乳酸的主要原料來(lái)源，其余是由乙醇發(fā)酵環(huán)節(jié)的密閉發(fā)酵期或醋酸發(fā)酵環(huán)節(jié)后期的米醋發(fā)酵醪中乳酸桿菌和鏈球菌作用而生成，除此之外，有些種類的乳酸菌能將丙酮酸作為受氫體而生成乳酸[30]。乙酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行，一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。乙酸和乳酸含量占有機(jī)酸總量的比例最高，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，乙酸和乳酸含量達(dá)到有機(jī)酸總量的90%左右，說(shuō)明乙酸和乳酸為玫瑰醋的主要有機(jī)酸。蘋果酸、α-酮戊二酸和草酸基本上都是在“發(fā)花”過(guò)程產(chǎn)生，在發(fā)酵過(guò)程中含量變化不大。酒石酸、焦谷氨酸和丙酮酸在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)。除乙酸、乳酸外的7 種有機(jī)酸（丙酮酸、草酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸）含量在總有機(jī)酸含量中占比很低，但大部分還是由“發(fā)花”過(guò)程產(chǎn)生。這些有機(jī)酸大部分是三羧酸循環(huán)途徑的中間代謝物，在生成的同時(shí)也被作為其他代謝途徑的前體進(jìn)入更為復(fù)雜的代謝途徑，所以其在醋酸發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)有大量的積累。

2.2.2 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量PCA和聚類分析

圖7 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量PCAFig. 7 PCA of organic acid contents during rosy vinegar fermentation

根據(jù)PCA得分值和載荷值，可以得到每個(gè)發(fā)酵階段對(duì)應(yīng)的物質(zhì)種類。由圖7可以看出，有機(jī)酸含量基本呈現(xiàn)向第1主成分正向變化。在發(fā)酵初期，玫瑰醋中主要的呈味有機(jī)酸為乳酸。發(fā)酵后期呈味有機(jī)酸比較豐富，主要的呈味有機(jī)酸有乙酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、焦谷氨酸、酒石酸。這與玫瑰醋有機(jī)酸變化含量變化規(guī)律相符，在發(fā)酵后期，有機(jī)酸含量基本達(dá)到最高，呈味有機(jī)酸比較更豐富。由圖8可以看出，玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的聚類分析結(jié)果與PCA結(jié)果相似。聚類分析主要將玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量分為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3大類。在發(fā)酵中期，20 d和30 d的玫瑰醋樣品有機(jī)酸含量可以聚為一個(gè)小類，50 d和60 d的玫瑰醋樣品有機(jī)酸含量可以聚為一個(gè)小類。這與玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的PCA結(jié)果相符。

圖8 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量聚類分析Fig. 8 HCA analysis of organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

2.3 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程與有機(jī)酸相關(guān)細(xì)菌分析

2.3.1 與有機(jī)酸相關(guān)的細(xì)菌重要性指標(biāo)（variable importance for the projection，VIP）分析

圖9 與有機(jī)酸相關(guān)的VIP分析Fig. 9 VIP plot of the important bacteria correlated with organic acids

利用O2PLS模型對(duì)細(xì)菌相對(duì)豐度與有機(jī)酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，可以得出X變量（細(xì)菌的相對(duì)豐度）與Y變量（有機(jī)酸含量）相關(guān)性的自變量重要性指標(biāo)（VIP（pred））。由圖9可以看出，細(xì)菌的VIP（pred）在0.15～1.50之間。VIP（pred）大于1.4的有6 個(gè)屬，VIP（pred）值在1.3～1.4之間有5 個(gè)屬，VIP（pred）值在1.2～1.3之間有4 個(gè)屬，VIP（pred）值在1.1～1.2之間有3 個(gè)屬，VIP（pred）值在1.0～1.1之間有5 個(gè)屬。其中醋桿菌屬、乳桿菌屬與有機(jī)酸相關(guān)重要性最高。選取VIP（pred）大于1的23 個(gè)細(xì)菌屬進(jìn)行與有機(jī)酸相關(guān)性分析。

2.3.2 玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中與有機(jī)酸相關(guān)的細(xì)菌分析

選取VIP（pred）大于1的細(xì)菌（屬）與有機(jī)酸進(jìn)行相關(guān)性分析，將有機(jī)酸與細(xì)菌的相關(guān)性系數(shù)做成Heatmap圖。由圖10可知，與乙酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有7 個(gè)屬，負(fù)相關(guān)16 個(gè)屬，與乙酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)性的細(xì)菌有醋酸桿菌屬；與乳酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有16 個(gè)屬，負(fù)相關(guān)細(xì)菌7 個(gè)屬，與乳酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)性的細(xì)菌為乳酸桿菌屬；與蘋果酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有13 個(gè)屬，負(fù)相關(guān)細(xì)菌10 個(gè)屬，與蘋果酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)的細(xì)菌為梭桿菌屬；與琥珀酸呈現(xiàn)正相關(guān)性的細(xì)菌有9 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)細(xì)菌14 個(gè)屬，與琥珀酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)的細(xì)菌為醋酸桿菌屬；與酒石酸呈現(xiàn)正相關(guān)性的細(xì)菌有7 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性細(xì)菌16 個(gè)屬，與酒石酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)細(xì)菌為醋酸桿菌屬；與α-酮戊二酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有12 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性細(xì)菌11 個(gè)屬，與α-酮戊二酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)性細(xì)菌為[Eubacterium]_rectale_group；與草酸呈現(xiàn)正相關(guān)細(xì)菌有9 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性細(xì)菌有14 個(gè)屬，與草酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)性細(xì)菌為醋酸桿菌屬；與丙酮酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有6 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)細(xì)菌有17 個(gè)屬，呈現(xiàn)最高正相關(guān)的細(xì)菌為醋酸桿菌屬；與焦谷氨酸呈現(xiàn)正相關(guān)的細(xì)菌有6 個(gè)屬，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的細(xì)菌有17 個(gè)屬，與焦谷氨酸呈現(xiàn)最高正相關(guān)細(xì)菌為醋酸桿菌屬。

圖10 細(xì)菌與有機(jī)酸相關(guān)性系數(shù)HeatmapFig. 10 Heatmap for correlation coefficients between bacteria and organic acids

表1 與有機(jī)酸相關(guān)性系數(shù)|ρ|大于0.6的細(xì)菌Table 1 Bacteria showing correlation coef ficients with organic acids greater than 0.6

表1為與有機(jī)酸的相關(guān)性系數(shù)|ρ|大于0.6的細(xì)菌屬，這些細(xì)菌與有機(jī)酸具有較好的相關(guān)性?？梢钥闯觯姿釛U菌屬除與蘋果酸和α-酮戊二酸的相關(guān)性（|ρ|）小于0.6外，與其他有機(jī)酸的相關(guān)性均大于0.6。醋酸桿菌屬與乙酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸、焦谷氨酸均具有較好的正相關(guān)性，與乳酸具有較高的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明醋酸桿菌屬在玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中對(duì)有機(jī)酸的產(chǎn)生具有重要作用。在浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中，醋酸菌中的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶能夠?qū)⒁掖佳趸梢宜?，因此醋酸菌與乙酸具有很高的相關(guān)性。有研究表明醋酸菌可以利用碳源產(chǎn)生酒石酸、琥珀酸等有機(jī)酸，因此醋酸桿菌屬與這些有機(jī)酸也具有較高的相關(guān)性。由于發(fā)酵初期，發(fā)酵液中積累了大量“發(fā)花”過(guò)程產(chǎn)生的糖類物質(zhì)，而玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中只有液面表面與空氣接觸，乳酸菌可以利用糖類進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，在發(fā)酵初期積累了大量乳酸，因此乳酸桿菌屬、乳球菌屬等細(xì)菌與乳酸高度正相關(guān)。但隨著發(fā)酵進(jìn)行，由于乙醇發(fā)酵以及pH值下降等原因，會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，而醋酸菌會(huì)迅速繁殖，乳酸可以作為碳源被醋酸菌利用，因此醋酸菌與乳酸負(fù)相關(guān)。除乙酸和乳酸外的其他有機(jī)酸（蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、α-酮戊二酸、草酸、丙酮酸和焦谷氨酸）大部分為微生物的丙酮酸或三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物，在生成的同時(shí)也被作為其他代謝途徑的前體進(jìn)入更為復(fù)雜的代謝途徑，所以其在醋酸發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)有大量的積累。因此從圖3～8可以看出，這些有機(jī)酸與細(xì)菌的相關(guān)性低于乙酸和乳酸與細(xì)菌的相關(guān)性。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群相對(duì)豐度以及有機(jī)酸含量的測(cè)定，并用O2PLS對(duì)細(xì)菌與有機(jī)酸進(jìn)行相關(guān)性分析，得出了浙江玫瑰醋在“沖缸放水”后的發(fā)酵過(guò)程中與有機(jī)酸相關(guān)性較強(qiáng)的功能細(xì)菌。利用O2PLS模型對(duì)細(xì)菌相對(duì)豐度與有機(jī)酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，可以得出X變量（細(xì)菌相對(duì)豐度）與Y變量（有機(jī)酸含量）相關(guān)性的自變量重要性指標(biāo)（VIP（pred））大于1的細(xì)菌有醋酸桿菌屬、乳桿菌屬、甲基桿菌屬等；選取VIP（pred）大于1的細(xì)菌與有機(jī)酸進(jìn)行相關(guān)性分析，得到了細(xì)菌與有機(jī)酸的相關(guān)性Heatmap，并得出了與各種有機(jī)酸相關(guān)性系數(shù)|ρ|大于0.6的細(xì)菌屬，以及與有機(jī)酸具有較強(qiáng)正、負(fù)相關(guān)性的細(xì)菌屬。例如醋酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、海洋桿菌屬與乙酸具有較好的正相關(guān)性；乳桿菌屬、乳球菌屬、另枝菌屬、不動(dòng)桿菌屬、水小桿菌屬等細(xì)菌與乳酸具有較好的正相關(guān)性。結(jié)果為找尋玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中的功能微生物，提升玫瑰醋品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。