土壤環(huán)境對(duì)傳統(tǒng)豆醬制醬過(guò)程中細(xì)菌群落演替的影響

安飛宇，武俊瑞，劉一鳴，孫雪婷，祝新媛，魏麗麗，烏日娜,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)教學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

我國(guó)醬的起源非常早，最早甚至可以追溯到商周時(shí)期，而關(guān)于豆醬的起源，最初的記載始見(jiàn)于西漢[1]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬是以大豆為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動(dòng)狀態(tài)的發(fā)酵食品[2]。自然發(fā)酵豆醬作為日常的調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。豆醬不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有抗氧化性、抑制血清膽固醇上升、抗癌、抗誘變性、降血壓等保健功能[3-5]，因此近年來(lái)自然發(fā)酵豆醬引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

目前，工業(yè)上大多通過(guò)添加菌種來(lái)制作豆醬。但是菌種的單一性使得工業(yè)豆醬的風(fēng)味及適口性遠(yuǎn)不如自然發(fā)酵豆醬[6]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬所具有的獨(dú)特色、香、味、體是在復(fù)雜的微生物的共同作用下，通過(guò)許多的生化反應(yīng)形成的，其中有蛋白質(zhì)的水解、乙醇的發(fā)酵、淀粉的糖化、有機(jī)酸的形成、脂肪的水解等[7]。民間素來(lái)就有“百家醬來(lái)百家味”的說(shuō)法，這說(shuō)明傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬的風(fēng)味多變。其原因是由于豆醬的生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝及環(huán)境等因素不同，造成了自然發(fā)酵豆醬的菌群結(jié)構(gòu)具有多樣性，從而導(dǎo)致其風(fēng)味的不同。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬的制作主要分為兩個(gè)階段，醬醅階段和制醬階段[8]。與醬醅階段不同，在制醬階段的發(fā)酵過(guò)程處于室外開(kāi)放式環(huán)境中。由于傳統(tǒng)農(nóng)家自然發(fā)酵豆醬的醬缸都要放置在陽(yáng)光充足、能保證其發(fā)酵溫度的田地上，因此推斷醬缸周?chē)耐寥拉h(huán)境可能會(huì)對(duì)發(fā)酵豆醬的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。近年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)自然發(fā)酵豆醬的群落組成做了大量的研究工作[2,9-11]，但鮮見(jiàn)關(guān)于土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。目前，有關(guān)于土壤環(huán)境對(duì)發(fā)酵食品菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道大多都集中于白酒窖泥及酒廠土壤的研究，已有報(bào)道稱(chēng)土壤環(huán)境會(huì)對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物的數(shù)量和優(yōu)勢(shì)菌群產(chǎn)生影響，從而影響酒質(zhì)的優(yōu)劣[12-13]。因此，探究土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響具有重要意義。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的科研人員利用該技術(shù)對(duì)復(fù)雜環(huán)境微生物進(jìn)行分析。孫衛(wèi)寧等[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同季節(jié)釀造的濃香型白酒的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。沈馨等[15]利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序系統(tǒng)對(duì)辣椒醬中核心菌群的群落特征進(jìn)行了研究，為辣椒醬中細(xì)菌的研究提供了更準(zhǔn)確、更科學(xué)的數(shù)據(jù)資源。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了在發(fā)酵過(guò)程中傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，及其周?chē)寥拉h(huán)境和醬醅的細(xì)菌群落組成。揭示土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響，為提高豆醬風(fēng)味及品質(zhì)研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：采集自?xún)杉覗|北地區(qū)農(nóng)家（遼寧四平S家、遼中L家）采用東北傳統(tǒng)方法制作的成熟期醬醅（編號(hào)為SK、LK），發(fā)酵醬缸周?chē)寥罉悠罚ň幪?hào)為ST、LT），以及各不同發(fā)酵階段的豆醬樣品各6 份，分別在發(fā)酵0、7、14、21、28、35 d（成熟）進(jìn)行取樣（分別編號(hào)為S1～S6、L1～L6），樣品采集方式為3 個(gè)不同位點(diǎn)混合采樣。樣品采集后，放置于冰盒中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱低溫凍藏。

E.Z.N.A.? Soil試劑盒 美國(guó)Omega公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海美吉公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國(guó)Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI GeneAmp? 9700型PCR儀 美國(guó)ABI公司；QuantiFluorTM-ST 美國(guó)Promega公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

根據(jù)Sun等[11]的方法提取各樣品的總DNA，利用NanoDrop 2000對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。將濃度和純度均合格的DNA在-20 ℃條件下保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：在95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300文庫(kù)[16]。最后利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[17]。運(yùn)用MiSeq工具中的MiSeq Control Software（MCS）進(jìn)行堿基識(shí)別和圖像分析，數(shù)據(jù)下機(jī)后在Illumina basespace云端計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行初始分類(lèi)分析?；诜诸?lèi)學(xué)信息，在各分類(lèi)學(xué)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

稀釋曲線主要利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，可用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖1所示，當(dāng)測(cè)序深度＜10 000時(shí)，多樣性指數(shù)隨著測(cè)序深度的增加而迅速增加；當(dāng)測(cè)序深度在10 000～30 000之間時(shí)，多樣性指數(shù)隨著測(cè)序深度的增加而緩慢增加；測(cè)序深度＞30 000時(shí)，稀釋度曲線趨于平臺(tái)期，表明測(cè)序準(zhǔn)確有效，可以充分反映樣品的多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves for samples

2.2 樣品復(fù)雜度分析

樣品的復(fù)雜度即α多樣性反映微生物的多樣性和群落的物種豐富度，包括OTUs數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等結(jié)果[8]。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)都是用來(lái)計(jì)算菌群豐度，ACE指數(shù)或Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。如表1、2所示，與醬醅和豆醬樣品相比，土壤樣品的物種最為豐富，菌群結(jié)構(gòu)明顯復(fù)雜。兩家醬醅的群落豐富度比較相似，進(jìn)入液態(tài)醬階段后，物種豐度都有所上升，隨著發(fā)酵的進(jìn)行有所下降，隨后豐度上下波動(dòng)。特別是，兩家豆醬的細(xì)菌豐度指數(shù)都在第4個(gè)發(fā)酵階段（S4、L4）出現(xiàn)峰值，說(shuō)明該階段可能為傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬發(fā)酵最為活躍的時(shí)期。

通過(guò)Shannon指數(shù)對(duì)樣品多樣性的比較，發(fā)現(xiàn)兩家醬醅中菌群的多樣性指數(shù)均低于下醬當(dāng)天的樣品，可能的原因?yàn)椋涸谙箩u的過(guò)程中，醬缸周?chē)寥拉h(huán)境中的微生物擴(kuò)散進(jìn)入醬缸，從而影響了豆醬發(fā)酵初期的細(xì)菌多樣性。同時(shí)，與下醬當(dāng)天的樣品相比，各發(fā)酵階段豆醬的菌群多樣性整體呈下降趨勢(shì)。此前，雖有學(xué)者研究表明窖泥和糟醅具有較高相似度的細(xì)菌區(qū)系，其間存在較大規(guī)模的細(xì)菌相互擴(kuò)散[18-19]，但鮮有有關(guān)環(huán)境土壤對(duì)發(fā)酵豆醬菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。另外，所有土壤，醬醅及豆醬樣品的Coverage值都接近于1，說(shuō)明覆蓋率較高，測(cè)序結(jié)果體現(xiàn)了樣本中微生物的真實(shí)情況。

表1 四平樣品α多樣性分析Table 1 α Diversity in samples collected from Siping

表2 遼中樣品α多樣性分析Table 2 α Diversity in samples collected from Liaozhong

2.3 物種組成比較分析

2.3.1 物種Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種（如OTU）數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種組成相似性及重疊情況[20]。圖2A為四平發(fā)酵前3 個(gè)階段的豆醬與醬醅及土壤的Venn圖，樣品S1、S2、S3與土壤單獨(dú)共有（排除與醬醅共有）的OTU數(shù)分別為27（36.49%）、15（26.79%）、7（16.67%）。到了發(fā)酵后3 個(gè)階段，如圖2B所示，單獨(dú)共有OTU數(shù)減少為24（34.78%）、7（19.44%）、10（23.26%）。圖3A為遼中豆醬發(fā)酵前3 個(gè)階段與醬醅及土壤的Venn圖，樣品L1、L2、L3與土壤單獨(dú)共有的OTU數(shù)分別為47（40.51%）、9（21.95%）、13（25%）。到了發(fā)酵后3 個(gè)階段，如圖3B所示，單獨(dú)共有的OTU數(shù)減少為11（23.40%）、5（11.90%）、18（28.13%），變化趨勢(shì)與四平樣品結(jié)果相似。

結(jié)果表明，兩家豆醬在發(fā)酵的第1個(gè)階段（S1、T1），豆醬與土壤單獨(dú)共有OTU數(shù)目及占比均達(dá)到峰值，說(shuō)明此階段土壤環(huán)境對(duì)發(fā)酵豆醬的OTU影響最大。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響逐漸減弱并上下波動(dòng)，且與多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致?？赡艿脑?yàn)椋涸诎l(fā)酵的第1個(gè)階段，也就是下醬時(shí)期，土壤環(huán)境與豆醬直接接觸的機(jī)會(huì)最多，存在較大規(guī)模的細(xì)菌相互擴(kuò)散，從而對(duì)豆醬初期的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。后期隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌群結(jié)構(gòu)會(huì)趨于相對(duì)穩(wěn)定[6,21]，同時(shí)土壤環(huán)境與豆醬接觸的機(jī)會(huì)減少，因此土壤環(huán)境對(duì)后期豆醬菌群結(jié)構(gòu)影響較小。

圖2 四平樣品Venn圖Fig. 2 Venn diagrams for Siping samples

圖3 遼中樣品Venn圖Fig. 3 Venn diagrams for Liaozhong samples

2.3.2 門(mén)水平下樣品菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同樣本在各分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。四平樣品在門(mén)水平上的群落組分如圖4所示，土壤中微生物菌群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，其主要的細(xì)菌門(mén)包括：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）。發(fā)酵醬醅和豆醬的菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上較為相似，其主要的細(xì)菌門(mén)包括：厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)。發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)（占總數(shù)86.72%～99.50%），同時(shí)在醬醅階段及發(fā)酵前期，變形菌門(mén)（占總數(shù)10.84%～12.87%）也被大量檢出。值得一提的是，在豆醬發(fā)酵的各個(gè)階段均檢測(cè)到一定數(shù)量的放線菌門(mén)（0.35%～12.87%），并在發(fā)酵前兩個(gè)階段最為豐富，且放線菌門(mén)并未在醬醅樣品中大量發(fā)現(xiàn)。

圖4 門(mén)水平下四平樣品群落組分圖Fig. 4 Microbial community composition at the phylum level in Siping samples

遼中樣品也出現(xiàn)了相似結(jié)果，如圖5所示，遼中樣品主要的細(xì)菌門(mén)包括：厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、擬桿菌門(mén)，其中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度低于四平樣品。發(fā)酵醬醅和豆醬的菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上也較為相似，其主要的細(xì)菌門(mén)包括：厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)。發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)（占總數(shù)84.46%～99.86%），同時(shí)在發(fā)酵的首個(gè)階段，變形菌門(mén)（14.10%）和放線菌門(mén)（1.40%）也被大量檢出，但在醬醅樣品中放線菌門(mén)并未大量出現(xiàn)。因此，推測(cè)土壤環(huán)境的確會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散菌門(mén)為放線菌門(mén)。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響會(huì)逐漸減弱，并維持在一定水平，該結(jié)果與之前的Venn圖分析結(jié)果一致。另外由圖4、5可知，遼中土壤對(duì)其豆醬的菌群結(jié)構(gòu)影響較小，可能是由于遼中土壤樣品中的放線菌門(mén)的相對(duì)豐度（23.90%）要低于四平樣品（33.91%）導(dǎo)致。

圖5 門(mén)水平下遼中樣品群落組分圖Fig. 5 Microbial community composition at the phylum level in Liaozhong samples

2.3.3 屬水平下樣品菌群結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)一步分析了屬水平下各樣品的菌群結(jié)構(gòu)，動(dòng)態(tài)跟蹤了整個(gè)豆醬發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌變化過(guò)程。如圖6所示，四平樣品主要的細(xì)菌菌屬為：芽孢桿菌屬（Bacillus）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobaillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、考克氏菌屬（Kocuria）等。

在醬醅階段，優(yōu)勢(shì)菌屬為：芽孢桿菌屬（87.08%）和假單胞菌屬（12.86%）。加入鹽水后，進(jìn)入豆醬階段，其優(yōu)勢(shì)菌屬為：芽孢桿菌屬（12.56%～68.62%）、四聯(lián)球菌屬（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌屬（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌屬（0.09%～7.26%）、乳桿菌屬（0.65%～5.94%）。醬塊加入鹽水后，前3 個(gè)階段芽孢桿菌逐漸減少，由S1階段的68.62%減少到S3的12.56%。在豆醬中，具有代表性的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[22]，減少的原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系內(nèi)的乳酸菌產(chǎn)乳酸使總酸升高，pH值下降，由于較低的pH值對(duì)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[23]，所以芽孢桿菌的含量逐漸減少。原本在醬醅中大量存在的假單胞菌屬在豆醬發(fā)酵階段逐漸減少，在S3階段僅占0.06%，假單胞菌屬為導(dǎo)致食品腐敗的重要腐敗細(xì)菌，由于其為嚴(yán)格需氧型細(xì)菌[24]，豆醬發(fā)酵過(guò)程中的無(wú)氧環(huán)境不利于假單胞菌屬的生長(zhǎng)。四聯(lián)球菌在S2階段迅速增加，到S3階段成為豆醬中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。四聯(lián)球菌屬是促進(jìn)健康的益生菌，它廣泛存在于豆醬、醬油、魚(yú)醬等發(fā)酵食品中。酵母菌參加代謝反應(yīng)的產(chǎn)物主要為醇類(lèi)和醛類(lèi)，而四聯(lián)球菌屬代謝的產(chǎn)物則主要是以乳酸為主要酸的多種有機(jī)酸類(lèi)，兩者結(jié)合，可以顯著提高產(chǎn)品中酯類(lèi)物質(zhì)含量，所以四聯(lián)球菌屬在改善豆醬風(fēng)味方面具有重要作用[25]。

相較于發(fā)酵豆醬而言，土壤中的細(xì)菌菌屬過(guò)于復(fù)雜，單從群落組分圖上無(wú)法準(zhǔn)確得知其對(duì)豆醬菌群的具體影響。因此運(yùn)用Heatmap圖進(jìn)行深入分析，Heatmap圖是以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成信息。可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色變化與相似程度反映不同樣本在各分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性[26]，如圖7所示，放線菌門(mén)中的考克氏菌屬[27]（0.28%～1.57%）僅在土壤及豆醬樣品中（尤其是發(fā)酵前期）有較高豐度，而在醬醅樣品中并未大量發(fā)現(xiàn)。有報(bào)道稱(chēng)，考克氏菌屬是自然發(fā)酵腐乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，其菌株胞外蛋白酶可以水解大豆蛋白產(chǎn)生氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)[28-29]。同時(shí)這也再次印證了，土壤環(huán)境的確會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散菌門(mén)為放菌門(mén)的這一觀點(diǎn)。

圖6 屬水平下四平樣品群落組分圖Fig. 6 Microbial community composition at the genus level in Siping samples

如圖8所示，遼中樣品主要的細(xì)菌菌屬為四聯(lián)球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬等。在醬醅階段，優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（88.16%），明串珠菌屬（8.59%）。加入鹽水后，進(jìn)入豆醬階段，其優(yōu)勢(shì)菌屬為四聯(lián)球菌屬（0.29%～96.58%）、乳桿菌屬（1.96%～51.85%）、腸球菌屬（0.26%～12.63%）、明串珠菌屬（0.5 5%～1 1.0 6%）、假單胞菌屬（0.04%～7.90%）。兩家豆醬中都存在乳桿菌屬和明串珠菌屬，豆醬中的乳桿菌主要是植物乳桿菌[30]，其不僅有利于食品的發(fā)酵，還可以改善食物的風(fēng)味，還具有一定益生特性，包括維持腸道內(nèi)菌群平衡、抑制腫瘤細(xì)胞的形成、降低血清膽固醇等[31-32]。明串珠菌是革蘭氏陽(yáng)性、耐氧的一種乳酸菌，腸膜明串珠菌產(chǎn)乳酸，可以在高鹽和高糖環(huán)境中生長(zhǎng)，因此在豆醬中廣泛存在[33]。此外，腸球菌屬僅為遼中豆醬的優(yōu)勢(shì)菌屬，而在四平豆醬中并未檢出，其可能的原因?yàn)椋篔eong等[34]發(fā)現(xiàn)在醬塊發(fā)酵過(guò)程中，隨著芽孢桿菌數(shù)量增多腸球菌數(shù)量降低，兩種菌種可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，而四平豆醬中芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，因此導(dǎo)致其腸球菌屬豐度降低。

圖7 屬水平下四平樣品Heatmap圖Fig. 7 Heatmap diagram at the genus level for Siping samples

圖8 屬水平下遼中樣品群落組分圖Fig. 8 Microbial community composition at the genus level in Liaozhong samples

圖9 為遼中樣品Heatmap圖，在豐度前20的菌屬中并未找到土壤與豆醬有明顯相關(guān)性的菌屬，其原因可能為：1）下醬過(guò)程中操作手法的不同，使土壤環(huán)境與豆醬接觸少；2）遼中土壤樣品中的放線菌門(mén)的相對(duì)豐度較低，無(wú)法深入影響發(fā)酵豆醬菌群結(jié)構(gòu)或是所影響的菌屬豐度較低，無(wú)法在圖中體現(xiàn)。該結(jié)果也與之前門(mén)水平的研究結(jié)果一致。兩家豆醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異，表明傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成與原料、制作手法、地區(qū)差異均有密切聯(lián)系，因此還需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)積累，并結(jié)合如轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)共同研究，以期進(jìn)一步了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬風(fēng)味和微生物組成差異的原因。

圖9 屬水平下遼中樣品Heatmap圖Fig. 9 Heatmap diagram at the genus level for Liaozhong samples

3 結(jié) 論

利用高通量測(cè)序技術(shù)，分別鑒定了采集自四平，遼中兩家傳統(tǒng)自然發(fā)酵的成熟醬醅、豆醬以及醬缸周?chē)寥拉h(huán)境的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，四平樣品醬醅階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為芽孢桿菌屬（87.08%）和假單胞菌屬（12.86%）。豆醬階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為芽孢桿菌屬（12.56%～68.62%）、四聯(lián)球菌屬（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌屬（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌屬（0.09%～7.26%）、乳桿菌屬（0.65%～5.94%）。遼中樣品醬醅階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為乳桿菌屬（88.16%），明串珠菌屬（8.59%）。豆醬階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為四聯(lián)球菌屬（0.29%～96.58%）、乳桿菌屬（1.96%～51.85%）、腸球菌屬（0.2 6%～1 2.6 3%）、明串珠菌屬（0.55%～11.06%）、假單胞菌屬（0.04%～7.90%）。在揭示自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群的動(dòng)態(tài)變化的同時(shí)，比較分析土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)：土壤環(huán)境會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散細(xì)菌為放線菌門(mén)中的考克氏菌屬，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響會(huì)逐漸減弱，并維持在一定水平。

4 討 論

高通量測(cè)序結(jié)果表明，兩家豆醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，其可能是除原料及釀造工藝外造成豆醬風(fēng)味不同的另一主要原因。土壤環(huán)境對(duì)豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豆醬菌群結(jié)構(gòu)會(huì)趨于相對(duì)穩(wěn)定，土壤環(huán)境與豆醬接觸的機(jī)會(huì)減少，從而使得土壤環(huán)境對(duì)豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響減小。同時(shí)，下醬過(guò)程中的操作手法，土壤樣品中的放線菌門(mén)的相對(duì)豐度也可能對(duì)菌群結(jié)構(gòu)變化造成影響。此外，土壤環(huán)境中的霉菌對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)是否存在影響還有待探討，同時(shí)還需結(jié)合如轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)共同研究，以期進(jìn)一步了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬風(fēng)味和微生物組成差異的原因及其代謝機(jī)理。