嗜熱甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌的表達(dá)及該酶在果汁澄清中的應(yīng)用

陳 偉，谷新晰，黃 蕾，李 晨，田洪濤，盧海強(qiáng)*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，簡(jiǎn)稱甘露聚糖酶[1]。依據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的差異，目前甘露聚糖酶可分為4 個(gè)家族，分別是GH5家族、GH26家族、GH113家族和GH134家族[2]。甘露聚糖酶廣泛地分布于軟體動(dòng)物、植物和微生物之中，其中微生物是生產(chǎn)用甘露聚糖酶的主要來(lái)源[3]。甘露聚糖酶在寡糖的制備、飲料的澄清及濃縮加工過(guò)程中存在著巨大的應(yīng)用潛力[4]。然而隨著甘露聚糖酶在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，逐步暴露出一些亟待解決的問(wèn)題，如較低的酶活力以及較差的耐受性。

嗜熱酶具有較高的酶促反應(yīng)溫度和較好的耐受性，已經(jīng)成為酶制劑研發(fā)的重要領(lǐng)域[5]。迄今為止，人們已經(jīng)從不同環(huán)境中成功獲得了30 個(gè)嗜熱甘露聚糖酶[6]，其中來(lái)源于Talaromyces leycettanus JCM12802菌株的Man5A（AJF11663）的酶促反應(yīng)溫度最高（90 ℃），且在70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性[7]。Yang Hong等[8]從嗜熱真菌Neosartorya sp. P1中獲得了嗜熱甘露聚糖酶Man5P1，并在豆乳加工過(guò)程取得了較好的應(yīng)用效果。因此，積極挖掘甘露聚糖酶資源，已成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

近年來(lái)，果汁飲料在我國(guó)發(fā)展?jié)摿薮?，而加工過(guò)程中出現(xiàn)的果汁渾濁制約著果汁產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[9]。果汁中除含維生素、單寧和果糖等物質(zhì)外，還含有淀粉、果膠、纖維素和半纖維素等非水溶性物質(zhì)，而這些非水溶性物質(zhì)極易造成果汁的渾濁。當(dāng)前，研究人員已將果膠酶、阿拉伯聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶等酶類用來(lái)進(jìn)行果汁澄清處理并取得了一定的效果[10]。甘露聚糖作為一種重要的半纖維素廣泛地分布在水果中，而利用甘露聚糖酶提高果汁澄清相關(guān)報(bào)道較少，探究嗜熱甘露聚糖酶作為果汁澄清用酶的潛力具有較強(qiáng)的理論和應(yīng)用價(jià)值。

本研究擬對(duì)嗜熱真菌Neosartorya sp. HBFH9中GH5家族甘露聚糖酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究，并探究其在果汁澄清中的應(yīng)用潛力，這對(duì)豐富食品酶類資源及提高果汁加工質(zhì)量具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真菌HBFH9（Neosartorya sp. HBFH9），巴斯德畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9k由本實(shí)驗(yàn)保存；Trans 1-T1北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMDTM19-T、Fast pfu DNA聚合酶、T4 DNA酶、EcoR I、Not I和Bgl II等酶大連寶生物公司；PDA培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司。

參照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)制備MD瓊脂板、生長(zhǎng)培養(yǎng)基（BMGY）和誘導(dǎo)培養(yǎng)基（BMMY）；引物合成和核酸測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。發(fā)酵培養(yǎng)基：角豆膠（0.3%），NH4NO3（0.5%），KCl（0.05%），MgSO4·7H2O（0.05%），MnSO4·4H2O（0.03%），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.03%），pH 6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

立式高速低溫離心機(jī) 日本Hitachi公司；Biometra Tprofessional聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Biometra公司；TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；1652100電穿孔儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 甘露聚糖酶基因的克隆

菌株Neosartorya sp. HBFH9在PDB培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)72 h后，離心收集菌體。采用CTAB法對(duì)真菌HBFH9提取基因組，-20 ℃保藏備用。采用兼并引物（MP1和MP2）擴(kuò)增保守序列[11]，通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合大小的片段和pEASY-T3載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

將真菌HBFH9接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，45 ℃搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，收集菌體。使用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取菌株HBFH9總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA的第一條鏈。參考Aspergillus fischeri NRRL 181中的XP_001262238.1基因序列設(shè)計(jì)引物（PF和PR），PF（CGGAATTCCAGGTTGG TCCTTGGGGCCAGTGTGG）和PR（GAATGCGGCCGC CTAGATTCGGCTGACATGATC），進(jìn)行PCR測(cè)定，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收后連接T載體，構(gòu)建pMDTM19T-nsMan5B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Trans1-T1宿主，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 序列信息分析

使用Vector NTI 11.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。使用FGENESH（http://linux1.softberry.com/）軟件對(duì)基因的內(nèi)含子和外顯子位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在線工具預(yù)測(cè)酶蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。使用SignalP 4.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進(jìn)行酶蛋白信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)。使用NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在線工具預(yù)測(cè)酶蛋白分子的N-糖基化位點(diǎn)。利用Swiss-Mode服務(wù)器（https://www.swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)酶蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)，并利用Pymol軟件進(jìn)行分析。

1.3.3 重組菌株的構(gòu)建

將pMDTM19T-nsMan5B質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，并與質(zhì)粒pPIC-9k進(jìn)行連接反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-nsMan5B，并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

提取陽(yáng)性pPIC9k-nsMan5B質(zhì)粒，使用限制性酶Bgl II酶切pPIC9k-nsMan5B質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)，利用酶活性篩選方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

挑取單陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至50mL YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（30 ℃，250 r/min）12 h后，將其以1%的接種量接種于200 mL BMGY中，在搖床中30 ℃培養(yǎng)48 h。參照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)方法，收集菌體并轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基搖床繼續(xù)培養(yǎng)72 h，維持甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%。離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進(jìn)行活力測(cè)定及SDS-PAGE分析。

1.3.5 甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

甘露聚糖酶酶活測(cè)定參考Miller[12]的DNS方法。取100 μL適當(dāng)稀釋酶液和900 μL角豆膠（0.5%），在pH 5.0，50 mmol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，60 ℃反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)。對(duì)照則在加入1.5 mL DNS后，再補(bǔ)加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min并冷卻至室溫后在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度。參照Sakai等[13]的方法，以甘露糖的量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活單位：以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.5.1 pH值對(duì)重組酶NsMan5B的影響

在pH 2.0～12.0范圍條件下，測(cè)定重組酶NsMan5B的酶活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算，分析該酶的pH值反應(yīng)范圍。將重組酶NsMan5B在pH 2.0～12.0的條件下，37 ℃處理1 h，對(duì)照為未進(jìn)行處理的酶，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定方法測(cè)定酶活力，分析其pH耐受性。

1.3.5.2 溫度對(duì)重組酶NsMan5B的影響

將重組酶NsMan5B在最適pH值下，分別在溫度為30～70 ℃范圍內(nèi)，測(cè)定重組酶NsMan5B的酶活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算，分析其反應(yīng)溫度范圍。將重組酶在50、60、70 ℃條件下，分別孵育0、5、10、20、30 min和60 min后，測(cè)定酶活力，以0 min處理的酶活力值為100%計(jì)算，分析該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酶NsMan5B活性的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，分別測(cè)定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子酶活力，探究金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響，為重組酶的貯藏、純化及應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

1.3.5.4 重組酶NsMan5B動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

重組酶NsMan5B在最適反應(yīng)條件下，以不同濃度（1.0～10.0 mg/mL）的角豆膠溶液為底物測(cè)定酶活力，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

1.3.6 重組酶NsMan5B在果汁澄清中的應(yīng)用

果汁澄清度的測(cè)定[14]：蘋果、杏、柿子、葡萄、梨和橘子，按照柿子與水質(zhì)量比1∶4壓榨，經(jīng)膠體磨進(jìn)一步處理，獲得柿子汁樣品。將蘋果、梨、桃子、葡萄、柿子和橘子水果清洗干凈、晾干水分，參照Hayrunnisa等[14]方法進(jìn)行榨汁處理，并保存4 ℃?zhèn)溆?。? mL酶液添加到10 g果汁中，在pH 5.0、60 ℃反應(yīng)1 h后，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以透光率作為果汁澄清度指標(biāo)參數(shù)，以添加等量滅活酶的果汁反應(yīng)液作為空白對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，利用Excel和SPSS19.0軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 nsMan5B基因序列分析

經(jīng)對(duì)菌株Neosartorya sp. HBFH9的GH5家族甘露聚糖酶保守序列擴(kuò)增，共獲得2 個(gè)180 bp左右的片段。經(jīng)分析均屬于GH5家族甘露聚糖酶，分別命名為nsMan5A和nsMan5B，基因nsMan5A序列與已報(bào)道的Man5P1一致性最高（99%），基因nsMan5B序列與Aspergillus fischeri NRRL 181中的XP_001262238.1一致性為99%，而到目前為止，并無(wú)該基因相關(guān)功能報(bào)道。經(jīng)分析，nsMan5B基因由1 491 bp核苷酸組成，2 個(gè)內(nèi)含子（I內(nèi)含子950～1 009 bp，II內(nèi)含子1 140～1 199 bp），cDNA全長(zhǎng)1 371 bp核苷酸，編碼456 個(gè)氨基酸和1 個(gè)終止密碼子。理論分子質(zhì)量約為49.5 kDa，等電點(diǎn)為5.0，該蛋白含有1 個(gè)信號(hào)肽序列（1-18AA），不存在N-糖基化位點(diǎn)。經(jīng)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，成熟NsMan5B酶蛋白分子由3 部分組成：碳水化合物結(jié)合區(qū)（CBM1，1～30）、linker區(qū)（31～103）和催化區(qū)（104～423）。經(jīng)序列比對(duì)分析（圖1），nsMan5B基因序列與已報(bào)道的嗜熱甘露聚糖酶ManBK基因序列（PDB：3wh9）一致性為46.7%,，與C.antarcticus中的甘露聚糖酶（PDB：4oou）基因序列一致性為12.7%，與Trichoderma reesei中甘露聚糖酶（PDB：1QNR）基因序列一致性為43.4%。經(jīng)三維結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，NsMan5B具有典型的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，兩個(gè)催化位點(diǎn)分別是281E和390E，屬于GH5家族。

圖1 甘露聚糖酶NsMan5B序列比對(duì)分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of NsMan5B using the ClustalW program

2.2 重組菌nsMan5B基因誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后，對(duì)細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行酶活檢測(cè)，發(fā)酵液中酶活為7.8 U/mL。進(jìn)一步對(duì)重組菌發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見圖2。發(fā)酵產(chǎn)物在約49 kDa處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶，這與NsMan5B酶蛋白分子理論分子質(zhì)量基本上一致，不存在糖基化修飾。

圖2 甘露聚糖酶NsMan5B的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant NsMan5B

2.3 重組酶NsMan5B酶學(xué)特性分析

圖3 甘露糖酶NsMan5B的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 3 Effects of pH and temperature on the β-mannanase activity of recombinant NsMan5B

由圖3A、C可知重組酶NsMan5B的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，屬于嗜熱酶。在70 ℃反應(yīng)下具有90%以上的酶活性，即使在90 ℃時(shí)依然能夠維持50%以上活性，該酶的反應(yīng)溫度范圍較廣，30～90 ℃都能夠檢測(cè)到該酶的活性。在50 ℃條件下，重組酶NsMan5B酶基本穩(wěn)定，在處理1 h后，能夠維持80%以上的酶活性；60 ℃處理1 h后，酶活損失約50%；而70 ℃條件處理1 h后能夠維持原活性的40%。

由圖3B、D可知，重組酶NsMan5B具有較廣的pH值作用范圍，在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)都表現(xiàn)出一定的酶活性，該酶的最適反應(yīng)pH值為4.0，在酸性范圍內(nèi)（3.0＜pH＜7.0）酶活性較高，能夠維持80%以上的酶活性。隨著pH值的逐漸升高，酶活性也隨之降低，直至pH 11.0，該酶活性完全喪失。

經(jīng)對(duì)重組酶NsMan5B的酸堿耐受性分析發(fā)現(xiàn)，該酶在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)處理1 h后酶活力基本維持穩(wěn)定，即使在堿性條件下（7.0＜pH＜11.0）依然能夠維持75%以上的酶活力，而在pH 12.0條件下處理后酶活力喪失較明顯，只能維持原酶活性的20%左右。經(jīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)測(cè)定該酶的Vmax為76.3 μmol/（min·mg），Km為1.26 mg/mL。

2.4 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酶活力的影響及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

金屬離子對(duì)重組甘露聚糖酶活性的影響差異較大，且不同離子濃度會(huì)對(duì)酶活性造成不同影響。由表1可知，在低離子濃度（1 mmol/L）條件下，Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋顯著促進(jìn)了重組酶NsMan5B的活性，使其活性分別提升了66%、32%和23%。除了Ca2＋和K＋對(duì)重組酶NsMan5B起到了較明顯抑制外，其他金屬離子都未對(duì)重組酶的活性表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制。而在高離子濃度條件下，除了Mn2＋外，其他金屬離子都極顯著的促進(jìn)了重組酶NsMan5B的活性，其提升幅度從19%～244%不等。其中K＋和Cu2＋促進(jìn)作用最為明顯，分別使重組酶活性增加了2.4 倍和1.2 倍。不論是在高濃度還是低濃度，化學(xué)試劑并未同金屬離子一樣表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。醇類物質(zhì)已被廣泛用來(lái)進(jìn)行酶液的初步濃縮[15]，經(jīng)對(duì)幾種醇類物質(zhì)影響分析發(fā)現(xiàn)，大體隨著醇分子主鏈的延長(zhǎng)，醇對(duì)重組酶NsMan5B活性的抑制作用越來(lái)越顯著，醇體積分?jǐn)?shù)越大，抑制越明顯，如：在體積分?jǐn)?shù)2.5%正丁醇溶液條件下，重組酶只能維持原活性的14%左右。表面活性劑吐溫80和變性劑尿素都對(duì)重組酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

表1 不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)NsMan5B酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on β-mannanase activity of recombinant NsMan5B

2.5 重組甘露聚酶NsMan5B對(duì)5 種果汁澄清品質(zhì)的影響

采用酶制劑處理果汁原料提升果汁澄清度已被行業(yè)所認(rèn)可并廣泛應(yīng)用，如果膠酶、纖維素、淀粉酶及蛋白酶等。甘露聚糖作為一種重要的半纖維素成分，廣泛存在于植物的果實(shí)中[16]。因此，利用甘露聚糖酶降解果汁中的甘露聚糖，繼而提高果汁的澄清度是一條可行策略，并已被Nadaroglu等[17]的研究證實(shí)。本研究用重組甘露聚糖酶NsMan5B分別處理柿子汁、蘋果汁、桃子汁、葡萄汁和橘子汁。表2顯示，重組酶除對(duì)橘子汁外，對(duì)其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁最為明顯，提高了31.8%，其他3 種果汁分別提高了7%、4%和4%。

表2 甘露聚酶對(duì)果汁澄清效果Table 2 Clarification efficiency of fruit juice by using recombinant NsMan5B %

3 討 論

嗜熱甘露聚糖酶具有能夠提高催化反應(yīng)速率，降低雜菌污染，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝等優(yōu)點(diǎn)，使得該類酶在食品工業(yè)領(lǐng)域具有較廣的應(yīng)用前景[18-19]。菌株Neosartoryasp.HBFH9為本課題組從中高溫大曲中篩選獲得，并初步確認(rèn)為嗜熱真菌（＞45 ℃）。通過(guò)對(duì)該菌基因組DNA中的GH5家族甘露聚糖酶保守序列的擴(kuò)增，共獲得2 條GH5家族的甘露聚糖酶基因的保守序列，分別命名為nsMan5A和nsMan5B基因。迄今為止并無(wú)nsMan5B基因功能的相關(guān)報(bào)道。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，NsMan5B酶蛋白分子的功能結(jié)構(gòu)單元較完整，除具有催化功能的催化區(qū)外，還具有底物識(shí)別的碳水化合物結(jié)合區(qū)（CBM）和連接兩功能結(jié)構(gòu)單元的Linker區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)，Linker區(qū)域?qū)γ阜肿拥姆€(wěn)定性有較大相關(guān)性[20]，該區(qū)域的序列改造是后續(xù)提升重組NsMan5B穩(wěn)定的重要靶點(diǎn)。

大部分真菌來(lái)源的甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度為40～70 ℃[21-23]，重組甘露聚糖酶NsMan5B的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在70 ℃反應(yīng)下具有90%以上的酶活性，即使在90 ℃時(shí)依然能夠維持50%以上活性，屬于嗜熱酶。當(dāng)前，已報(bào)道的甘露聚糖酶Man5A（AJF11663）的酶促反應(yīng)溫度最高（90 ℃），但該酶的pH值范圍較窄，當(dāng)pH＞7.0時(shí)，酶活力完全消失，而重組酶NsMan5B卻表現(xiàn)出較出色的pH值反應(yīng)范圍及較強(qiáng)的酸堿耐受特性。

甘露聚糖酶N s M a n 5 B的最適p H值為4.0，這與T.terrestris來(lái)源的甘露聚糖酶（pH 4.5），P. chrysosporium來(lái)源的甘露聚糖酶（pH 4.0）及A. nigerBK01來(lái)源的甘露聚糖酶（pH 4.5）較一致[24-25]。在pH 8.0條件下，重組酶NsMan5B能夠維持60%的酶活性；即使在pH 9.0條件下，依然能保持30%以上的酶活性。真菌來(lái)源的甘露聚糖酶在酸性和中性條件下穩(wěn)定，只有很少的一些酶能夠在pH 8.0及以上的堿性條件下穩(wěn)定[26-27]，甘露聚糖酶NsMan5B是一個(gè)為數(shù)不多在堿性條件下穩(wěn)定的甘露聚糖酶，即使在pH 10.0堿性條件下處理1 h，酶活力基本能夠維持80%以上，表明該酶較其他嗜熱甘露聚糖酶具有較好的pH值穩(wěn)定性，因此具有更加寬廣的應(yīng)用范圍。金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酶NsMan5B活性表現(xiàn)出不同的影響，這與該酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有直接關(guān)系。乙醇在低體積分?jǐn)?shù)條件下對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用，在高濃度下受到的抑制作用較小，可以用來(lái)作為發(fā)酵酶液的初步濃縮。

酶制劑在果汁加工生產(chǎn)中的應(yīng)用顯著提高了果汁的出汁率和澄清效果，如果膠酶、纖維素和淀粉酶等酶制劑在果汁加工中的廣泛應(yīng)用[28]。Nadarouglu等[17]對(duì)甘露聚糖酶在果汁中的應(yīng)用進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶在果汁的澄清中發(fā)揮著重要作用，其中對(duì)杏汁的作用最為明顯，使澄清度從34%提高到47%。本研究發(fā)現(xiàn)重組甘露聚糖酶NsMan5B同樣對(duì)果汁的澄清有提升作用，而對(duì)不同品種果汁的澄清效果存在較大的差異，其中對(duì)柿子汁的效果最為明顯，這很可能與果汁中的物質(zhì)組成有很大關(guān)系[29]。柿子是我國(guó)北方山區(qū)重要的一種水果，目前，柿子深加工還存在較多困難因素，而可應(yīng)用于柿子汁加工的酶制劑相關(guān)研究較少。重組酶NsMan5B在柿子汁加工的應(yīng)用潛力還需進(jìn)一步挖掘，相關(guān)的技術(shù)參數(shù)還需進(jìn)一步完善。

4 結(jié) 論

本研究成功從嗜熱真菌Neosartorya sp. HBFH9獲得嗜熱甘露聚糖酶nsMan5B基因并進(jìn)行了表達(dá)及相關(guān)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明重組甘露聚糖酶NsMan5B屬于嗜熱酶，具有較好的pH耐受性，在果汁的澄清中具有較好的應(yīng)用效果。本研究不僅豐富了甘露聚糖酶資源，同時(shí)也為甘露聚糖酶在果汁加工中的應(yīng)用提供了一定的理論指導(dǎo)。