電子舌聯(lián)合微生物測序技術(shù)分析貯運溫度對巴氏殺菌乳品質(zhì)的影響

丁瑞雪，耿麗娟，劉麗云，洛 雪，史海粟，武俊瑞,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽市食品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；3.蒙牛乳業(yè)（沈陽）有限責任公司，遼寧 沈陽 110100）

巴氏殺菌乳是通過低溫殺菌的一種乳品，這種殺菌方法最大限度的保留了原料乳中固有的營養(yǎng)成分及風味[1-2]。因此在國內(nèi)外迅速地發(fā)展起來，得到了消費者的認可[3-6]。巴氏殺菌乳的氣味和味道是評價其品質(zhì)的重要手段。電子舌是近年來研究的熱門話題，與傳統(tǒng)的化學分析方法相比，區(qū)別在于傳感器輸出不是樣品成分的分析結(jié)果，而是與樣品某些特征相關(guān)的信號模式，這些信號可以通過具有模式識別能力的計算機分析獲得，然后整體評估樣品的味道特征[7-10]。電子舌的應用避免了人為感官鑒評中產(chǎn)生客觀因素的影響，利用不同的滋味傳感器能更加準確地評估乳制品不同滋味的感官評分。Toko等[11]將電子舌技術(shù)應用于牛奶分析，利用主成分分析、偏最小二乘回歸模型等分析方法驗證了電子舌可以很好地區(qū)別不同熱處理工藝、不同貯藏時間、溫度下的牛乳[12-14]。現(xiàn)如今，已經(jīng)有很多實驗嘗試使用電子舌分析乳制品，包括味道、風味、新鮮度、微生物生長監(jiān)測等評估[15-17]。這為現(xiàn)代乳品企業(yè)和相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)提供了新的研究思路和有效手段[18-20]。

由于巴氏殺菌乳殺菌溫度較低，冷鏈溫度并不總是保持在推薦范圍內(nèi)，由此增加了食品在儲存過程中變質(zhì)和潛在致病性微生物生長的風險[21-22]。因而不能殺死鮮乳中全部的微生物和酶，依然存在致病菌等未消滅的菌株[23]。?awniczaka等[24]在巴氏殺菌乳門店冰箱冷藏貯存售賣期間的溫度及品質(zhì)變化的研究中一般都采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方式探究貯藏條件下巴氏殺菌乳微生物的變化情況。然而，隨著高通量測序技術(shù)在乳品生態(tài)位中的大量應用，特別是那些基于16S rRNA細菌種類分類和培養(yǎng)獨立技術(shù)的工具，使得對整個微生物生態(tài)系統(tǒng)的評估更加精確[25-26]，這為探索乳制品中復雜的微生物世界提供了條件。本實驗采用高通量測序技術(shù)測定了不同貯藏條件下巴氏殺菌乳微生物多樣性的變化，同時結(jié)合電子舌味感指標更精準分析、評價微生物的物種變化情況，以期為今后的研究提供更加系統(tǒng)的評價依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集GZ、CG、HS三家乳業(yè)正常工藝當天生產(chǎn)的巴氏殺菌乳制品樣品，置于冰盒中，運回實驗室。將采集的3 家巴氏殺菌乳混合均勻，分別置于0、4、10、15、25 ℃恒溫箱中進行貯藏，并分別于0、3、6、9、12、15 d進行取樣，備用進行后續(xù)實驗。

1.2 儀器與設(shè)備

InsentSA402B電子舌 日本Insent公司；YCDEL259醫(yī)用冷藏冷凍箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；HN-50S電熱恒溫培養(yǎng)箱 邦西儀器科技（上海）有限公司；MIR-254-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本松下健康醫(yī)療器械公司；Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒AXYGEN公司；TGL-168高速臺式離心機、超低溫冰箱、微量紫外-分光光度計聚合酶鏈式反應擴增儀德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳業(yè)的工藝條件

GZ乳業(yè)的工藝條件：原奶驗收→凈乳→預巴殺→冷藏→定容檢驗→預熱均質(zhì)→巴氏殺菌→冷藏罐裝→成品。

CG乳業(yè)的工藝條件：原奶驗收→凈乳→均質(zhì)→巴氏殺菌→降溫罐裝→成品。

HS乳業(yè)的工藝條件：原料乳的驗收→過濾與凈化→標準化→均質(zhì)→巴氏殺菌→冷卻灌裝→成品。

1.3.2 感官評價

根據(jù)RHB 101—2004《巴氏殺菌乳感官質(zhì)量評鑒細則》[27]中巴氏殺菌乳的感官質(zhì)量評鑒細則，選用20 位以乳制品專業(yè)為基礎(chǔ)，經(jīng)過感官分析培訓的女性評審員（29～59 歲）[28]進行對于巴氏殺菌乳的滋氣味、組織狀態(tài)和色澤進行感官評鑒。用于感官評鑒的牛奶樣品在環(huán)境溫度20 ℃統(tǒng)一呈送[28]，每種樣品的各個參數(shù)重復品評2 次，結(jié)果取平均值，作為判定結(jié)果。

1.3.3 電子舌檢測及味感測定方法

電子舌的檢測參數(shù)為：最大電位1.00 V、最小電位-1.00 V、點位步進0.2 V、電極靈敏度0.000 1。取適量體積的巴氏殺菌乳于專用小杯中，電子舌的傳感器在各個樣品中的采集測量30 s，清潔330 s。每種樣品測量5 次。電子舌利用電化學傳感器通過測定液體樣本的綜合味覺信息，從而對被測試樣進行定量和定性分析。

1.3.4 巴氏殺菌乳中細菌種類的測定方法

取不同貯藏條件下的樣品10 mL放入離心管中，離心后去除乳脂層，再次離心后收集沉淀按照DNA試劑盒要求進行提取并利用16S rRNA聚合酶鏈式反應擴增，本實驗中的每個樣本擴增3 份，按物質(zhì)的量比例混合后在MiSeq測序平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 感官評價的數(shù)據(jù)分析方法

繪制雷達圖，分析比較巴氏殺菌乳在不同貯藏條件下的感官特性。評價特性及指標見表1。

表1 巴氏殺菌乳感官評分[27]Table 1 Criteria for sensory evaluation of pasteurized milk

1.4.2 電子鼻和電子舌的數(shù)據(jù)分析方法

利用電子舌對不同貯藏條件下的各樣品進行酸、苦、澀、甜、咸和鮮6 個值的測試，并且各樣品平行測定3 次，繪制雷達圖用于主成分分析。

1.4.3 巴氏殺菌乳中細菌種類的分析方法

在97%的相似性水平上歸類和確定分類單位數(shù)量，同時結(jié)合電子舌檢測結(jié)果確定巴氏殺菌乳在不同貯藏條件下的細菌種類變化情況。使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）軟件去除低質(zhì)量序列，做成熱圖，再進行生物信息學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價分析

圖1為巴氏殺菌乳樣品感官特性的描述性檢驗得分雷達圖。分析不同貯藏條件下巴氏殺菌乳滋氣味、組織狀態(tài)、色澤評分的變化。

圖1 不同貯藏條件下巴氏殺菌乳感官特性雷達圖Fig. 1 Radar diagram of sensory characteristics of pasteurized milk under different storage conditions

由圖1可知，隨著貯藏溫度升高、時間延長，巴氏殺菌乳滋氣味的評分呈趨勢性的下降。巴氏殺菌乳在0、4、10 ℃貯藏時其滋氣味評分下降緩慢，在3 d內(nèi)都能保持有乳香味。而巴氏殺菌乳的組織狀態(tài)同樣在0、4、10 ℃貯藏下時無明顯下降趨勢，證明此溫度下無沉淀和脂肪分離的情況。而從15 ℃開始，隨著貯藏時間的延長，下降趨勢愈加顯著。相同的，巴氏殺菌乳在低溫貯藏條件下普遍呈現(xiàn)乳白色，隨著溫度的升高，逐步達到黃褐色，此變化或許與其出現(xiàn)黏稠的組織狀態(tài)有關(guān)。

2.2 電子舌評價分析

由圖2可知，不同貯藏溫度、時間下的巴氏殺菌乳的各個味感值有明顯的變化。0 ℃貯藏不同時間各味感變化最為明顯。而巴氏殺菌乳在其他貯藏溫度條件下，隨著貯藏溫度升高和、時間的延長，鮮味及苦味值發(fā)生略微的下降，而其澀味值則有輕微的上升現(xiàn)象。巴氏殺菌乳在貯藏過程中其特有的香甜味是主要變化指標，因此，巴氏殺菌乳在15、25 ℃條件貯藏后都會導致甜味的顯著下降。而隨著貯藏溫度及時間的增加，可能微生物的生長也導致了巴氏殺菌乳的發(fā)酵腐敗，使其酸味值顯著上升。

圖2 貯藏在0（A）、4（B）、10（C）、15（D）、25 ℃（E）巴氏殺菌乳電子舌雷達圖Fig. 2 Radar maps of electronic tongue responses to pasteurized milk samples stored at 0 (A), 4 (B), 10 (C), 15 (D) and 25 ℃ (E)

2.3 巴氏殺菌乳電子舌味感與細菌多樣性主成分分析

圖3 巴氏殺菌乳電子舌味感與其屬水平上細菌多樣性主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of electronic tongue taste and bacterial diversity of pasteurized milk

如圖3可知，圖中主成分1、主成分2保留了78.73%的原始數(shù)據(jù)信息。以上不同顏色標記是基于不同溫度劃分的5 組組分，兩樣本點越接近，表明兩樣本物種組成越相似。不同樣品之間微生物多樣性的差異可以通過圖中各樣本點的距離表征，兩樣本點相聚越近證明其微生物多樣性越相似。同時，電子舌味感的數(shù)量型會被顯示成向量，樣本點到數(shù)量型電子舌味感向量的投影距離表示樣本受該環(huán)境因子影響大小。研究發(fā)現(xiàn)，屬水平上的各樣品到向量1酸味、向量2澀味味感投影距離接近于0或為負值。這表明巴氏殺菌乳樣品中的微生物組成與酸、澀兩種味感的相關(guān)性較小。而其他樣品到向量3苦味、向量4咸味、向量5鮮味、向量6甜味味感的投影距離大多為正值，因此猜測其與乳中細菌多樣性密切相關(guān)。相關(guān)研究也表明，某些微生物屬水平物種皆對苦味呈現(xiàn)著顯著的正相關(guān)性[29]。同時，Wei Zhenbo等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，在貯藏過程中，牛奶樣品的理化性質(zhì)在主成分分析圖中也表現(xiàn)出類似的規(guī)律性。

2.4 巴氏殺菌乳電子舌味感與細菌多樣性相關(guān)性熱圖分析

如圖4所示，巴氏殺菌乳電子舌味感與細菌多樣性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，各細菌菌屬對鮮味味感的影響最小，氣單胞菌屬（Aeromonas）、阪崎腸桿菌（Cronobacter）、沙雷氏菌（Serratia）、梭狀芽孢桿菌（Costridium）甚至與其呈現(xiàn)負相關(guān)性。同樣的，上述物種菌屬也都對巴氏殺菌乳的苦味、咸味、甜味有著負相關(guān)性。有研究表明，某些孢子形成細菌在冷藏條件下生長，會導致蛋白水解酶對牛奶種的主要成分進行分解，從而影響其感官質(zhì)量[29]。并且，除氣單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌、沙雷氏菌、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）外，其他屬水平物種皆對苦味呈現(xiàn)著顯著的正相關(guān)性，這些菌屬可能會是致使乳品發(fā)生腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究也證實了，即使這種能力只存在于某些屬/種，包括類芽孢桿菌、綠芽孢桿菌屬（Viridibacillus spp.）[31]，但這些菌株依然是牛奶在冷藏條件下變質(zhì)的主要原因。

圖4 巴氏殺菌乳電子舌味感與細菌多樣性相關(guān)性熱圖分析Fig. 4 Heatmap analysis of the relationship between electronic tongue taste and bacterial diversity in pasteurized milk

3 討 論

使用電子舌技術(shù)對乳制品樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)與人類味覺相比，味覺傳感器具有更高的靈敏度。三點檢驗法品評出來的正確區(qū)分人數(shù)作為食品整體品質(zhì)指標，結(jié)合Arrhenius動力學方程確定了鮮牛奶、豆奶的貨架期預測模型并進行貨架期預測。發(fā)現(xiàn)基于電子舌差別度方法預測的豆奶感官貨架期偏差較大，比實際值高，但預測出的微生物貨架期卻比微生物方法的預測結(jié)果更為精確[32]。Yoshida等[33]利用味覺傳感器客觀地測定了24 位健康母親和14 位乳腺炎母親的乳汁的4 種基本味道——酸味、咸味、苦味和鮮味。研究發(fā)現(xiàn)，初乳向成熟牛奶的轉(zhuǎn)變伴隨著牛奶味道的變化，如咸味和鮮味降低，苦味和酸味增加。在這種情況下，由于鈉、谷氨酸鹽和磷酸鳥苷的含量增加，牛奶中鮮味和咸味增加最終導致炎癥的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，不同貯藏溫度、時間下的巴氏殺菌乳均具有苦、咸、甜味及鮮味，酸味、澀味微弱，通過對測量數(shù)據(jù)進行檢驗發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏溫度升高和時間增加，巴氏殺菌乳的咸、鮮、澀及苦味有明顯的變化。

同時，Mizota等[34]也對牛奶的味道進行了研究，發(fā)現(xiàn)在牛奶均質(zhì)過程中能夠檢測到細微的微生物變化[35]。在牛奶儲存過程中，除了微生物的生長以外，使用偏最小二乘法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預測牛奶樣品中的細菌生長過程也提供了令人滿意的實驗結(jié)果[36]。在貯藏過程中，對牛奶樣品的細菌總數(shù)、酸度和黏度進行了測定，其理化性質(zhì)在主成分分析圖中表現(xiàn)出規(guī)律性。結(jié)果表明，該方法可用于監(jiān)測未密封巴氏滅菌奶的質(zhì)量儲存時間[30]。相關(guān)研究結(jié)果表明，未封口的巴氏殺菌奶樣品在-4 ℃存儲后，利用電子舌法能夠準確預測牛奶樣品種的細菌總數(shù)和黏度[37]。例如，一些腐敗微生物（如假單胞菌屬、不動桿菌屬等）能夠破壞乳品的品質(zhì)條件，從而對乳品企業(yè)的售賣帶來明顯的經(jīng)濟損失[38]。同時，研究發(fā)現(xiàn)，與乳制品行業(yè)相關(guān)的孢子形成菌（蠟樣芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌）[39]，是作為奶粉質(zhì)量檢測的重要指標（嗜熱菌）[40]，其可能會限制液態(tài)奶的保質(zhì)期[30]。因此，微生物群落的組成取決于乳制品中存在的微生物及其儲存條件所帶來的影響[41-42]。本實驗采用電子舌對于不同貯藏條件下的巴氏殺菌乳進行感官評價，研究分析鮮、咸、澀味下降的原因，這可能與巴氏殺菌乳中微生物的大量繁殖造成其品質(zhì)腐敗有關(guān)，高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯藏期間含有氣單胞菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、類芽孢桿菌、假單胞菌等菌屬的存在，它們直接或間接影響著巴氏殺菌乳的味感及品質(zhì)。同時，由大量數(shù)據(jù)分析結(jié)果也驗證了電子舌儀器的穩(wěn)定性及各傳感器的分辨能力。將電子舌技術(shù)應用于檢測不同新鮮度、不同熱處理來源的乳制品，再通過微生物、理化等方面結(jié)合能夠更好地探究乳制品中更為復雜的微生物世界提供了條件。