QuEChERS-高效液相色譜法測定飼料中牛至香酚新方法的研究

賀習(xí)文 李 宏 趙彩會 高勤葉 黃姣姣 李易軒 王 珊 石 巍

（1.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測有限公司，陜西渭南714000；2.河北省霸州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北霸州065700）

牛至香酚是從牛至中提取的一類揮發(fā)性油，是一種抗菌、抗氧化和防腐功能的新型綠色添加劑。牛至香酚對畜禽動物腸道細菌引起的腹瀉能起到有效的抑制作用，能夠增強動物免疫力，促進動物生長，提高動物生產(chǎn)性能，具有防腐、驅(qū)蟲、殺菌的作用[1-3]。且在動物體內(nèi)無殘留，可長期在日糧中添加使用[4-5]。

牛至香酚是由多種物質(zhì)混合而成的添加劑，其主要成分為香芹酚和百里香酚，香芹酚和百里香酚屬于同分異構(gòu)體，香芹酚中的-OH 基團在甲基鄰位，而百里香酚的-OH 在甲基的間位，兩者的化學(xué)性質(zhì)相似。圖1、圖2為香芹酚和百里香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》中把牛至香酚歸位其他類，適用范圍為豬和家禽，規(guī)定了食用香料在養(yǎng)殖業(yè)的使用，其中香芹酚和百里香酚是應(yīng)用最為廣泛的兩種香料，在配合飼料中添加量為5～10 mg/kg。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布關(guān)于2018～2021年開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作的通知，明確了養(yǎng)殖業(yè)減抗和限抗的時間表。香芹酚等綠色添加劑在飼料行業(yè)優(yōu)勢逐漸明顯，應(yīng)用也越來越廣泛，本文可滿足飼料中香芹酚和百里香酚組分的監(jiān)控需要[6-7]。

圖1 香芹酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 百里香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前有關(guān)測定香芹酚和百里香酚含量的報道較少，其中較為典型的有董茂峰等[6]利用氣相色譜法測定飼料中香芹酚和百里香酚的含量，任玉琴等[8]利用高效液相色譜法測定飼料中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，但未對全部飼料品種進行試驗，且樣品沒有凈化；竇茂鑫等[9]發(fā)表利用高效液相色譜法測定了牛至油添加劑中的香芹酚和百里香酚的含量的檢測方法。

有關(guān)文獻及資料表明，檢測香芹酚和牛至香酚含量的主要方法有氣相色譜法[10-12]等，高效液相色譜法比較少見。本文建立了QuEChERS-高效液相色譜法測定飼料中香芹酚和百里香酚的含量，是一種新型實用的檢測方法。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀：UltiMate 3000；十萬分之一天平：MS205DU；萬分之一天平：CP224C；離心機：H1850；渦輪混合器：XW-80A；超聲波提取儀：KQ-100DB。

1.2 試劑

香芹酚標準品含量99.10%；百里香酚標準品含量99.23%；乙腈：色譜純；無水乙醇：優(yōu)級純；冰乙酸：優(yōu)級純；C18吸附材料；硅酸鎂吸附材料；中性氧化鋁吸附材料；一級水。

1.3 標準貯備液的配制

香芹酚標準貯備液：準確稱取香芹酚標準品0.010 03 g 于10 ml 容量瓶中，用無水乙醇溶解至刻度，濃度為993.97 μg/ml。

百里香酚標準貯備液：準確稱取百里香酚標準品0.012 59 g 于10 ml 容量瓶中，用無水乙醇溶解至刻度，濃度為1 249.3 μg/ml。

混合標準中間液：準確移取上述香芹酚標準貯備1.0 ml和百里香酚標準貯備液0.8 ml于10 ml棕色容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻，濃度為100 μg/ml。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備取飼料樣品按四分法縮分，直至混合均勻，取其中約100 g樣品，用粉碎機粉碎，全部通過60目篩。

1.4.2 樣品前處理

稱取粉碎后的配合飼料、濃縮飼料、精料補充料10 g，復(fù)合預(yù)混料、維生素預(yù)混料樣品5 g（精確至0.000 1 g），置于100 ml棕色容量瓶中，加入50%乙腈水溶液70 ml，在超聲波提取儀上超聲提取20 min，取出放置冷卻至室溫，用50%乙腈水溶液定容至刻度，混勻。

1.4.3 提取液的凈化

維生素預(yù)混料的提取液通過0.45 μm 有機濾膜后直接上機測定，配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和復(fù)合預(yù)混料樣品提取液在4 000 r/min 離心5 min，取上清液5.0 ml 于10 ml 離心管中，加入0.1 g C18 吸附材料和0.1 g 硅酸鎂吸附材料，渦輪混合1 min，靜置片刻，取上清液過0.45 μm 有機濾膜后直接上機測定。

1.4.4 色譜條件

流動相：吸取10 ml冰乙酸于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，取此溶液500 ml 與500 ml乙腈混勻；色譜柱：Hypersil GOLDTMC18(250×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的繪制

準確吸取1.3 中的混合標準中間液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml于100 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml，以標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)（r2）達到0.999 9，證明標準曲線線性良好。

2.2 流動相的優(yōu)化

香芹酚和百里香酚易溶于醇類等有機試劑，不溶于水，因此選擇流動相時優(yōu)先考慮有機試劑，使用甲醇作為有機相時，由于甲醇在低波長有較大吸收，出現(xiàn)溶劑峰干擾，峰型較差且干擾目標峰，當有機相使用乙腈時，溶劑峰消失，因此有機相選擇乙腈，在有機相和水相比例上，優(yōu)先考慮較大的有機相比例，將乙腈的比例從90%逐漸降低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當乙腈比例為50%時，目標峰出峰時間和分離效果均達到要求，因此比例確定為50%乙腈+50%水相（v+v），水相使用純水時，目標峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，向水相中加入少量冰乙酸，拖尾峰有改善。測試不同比例的酸，結(jié)果表明，酸濃度為1%時效果最佳。

2.3 檢測波長的確定

使用二極管陣列檢測器（DAD）對香芹酚和百里香酚標準溶液進行紫外光譜掃描，掃描結(jié)果如圖3、圖4。

圖3 香芹酚紫外光譜圖

從圖3 和圖4 可以看出，香芹酚的最大吸收波長為194.02、214.66 nm 和274.67 nm，百里香酚的最大吸收波長為193.97、215.56 nm 和275.59 nm，使用194、215 nm 和275 nm 進行測定時，發(fā)現(xiàn)194 nm 和215 nm溶劑峰很多，基線漂移程度較大，而275 nm處沒有溶劑峰干擾，且基線穩(wěn)定。因此確定檢測波長為275 nm。

2.4 柱溫的確定

圖4 百里香酚紫外光譜圖

試驗選取了25～45 ℃一共5 個溫度點的測試（每隔5 ℃測試一次），25 ℃時色譜峰的分離效果最佳，但目標峰峰寬較大，且百里香酚峰型有拖尾現(xiàn)象；30 ℃時兩峰完全分離，峰寬合理，百里香酚沒有拖尾現(xiàn)象，35 ℃及以上峰型窄，目標峰尖銳，但兩種化合物無法達到完全分離，最終確定柱溫為30 ℃。最終條件下的標準圖譜和樣品加標圖譜見圖5、圖6。

2.5 加標回收及精密度

試驗選取了五種不同類型的飼料產(chǎn)品，分別進行加標回收試驗和精密度測定，所得結(jié)果見表1。

從表1可以看出，五種不同類型的樣品加標回收率均大于92%，回收率良好，相對標準偏差RSD 小于5%，滿足試驗要求。

2.6 檢出限及定量限

試驗以3 倍S/N 值為檢出限，10 倍S/N 值為定量限，在五種不同類型的飼料中進行加標試驗，通過逐漸降低加標濃度，當添加濃度為0.08 mg/kg 時，峰值基本為3倍S/N值，為了減小試驗誤差，將檢出限定為0.1 mg/kg，定量限定為0.3 mg/kg。通過對最小檢出限進行加標試驗，五種不同類型的飼料中添加回收率均在92%以上，結(jié)果可滿足要求。

2.7 凈化材料的選擇

試驗過程中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品雜峰較多，因此考慮使用凈化材料進行凈化吸附，以此來達到更加穩(wěn)定的試驗效果，試驗以同組加標樣品進行對比，空白組為加標樣品未經(jīng)凈化直接測定，對照組分別為加入0.1 g C18、0.1 g C18+0.1 g 硅酸鎂、0.1 g C18+0.1 g 硅酸鎂+0.1 g 中性氧化鋁，所得的試驗結(jié)果見圖7。

圖5 標準溶液譜圖

圖6 加標樣品譜圖

表1 加標回收率及精密度RSD（%，n=6）

圖7 樣品溶液凈化結(jié)果比較

從圖7 可以看出，只加入C18 作為凈化材料的樣品凈化效果不明顯，只去除掉了小部分雜質(zhì)，而加入了C18和硅酸鎂的樣品則凈化效果比較明顯，前面的雜峰明顯減少，且目標峰處的基線穩(wěn)定，而添加了C18、硅酸鎂和中性氧化鋁的樣品凈化效果和第二組無太大變化，而且在百里香酚目標峰后出現(xiàn)了基線上浮，綜合考慮，選擇C18 和硅酸鎂作為凈化材料效果最好。

3 結(jié)論

試驗證明，QuEChERS-高效液相色譜法測定飼料中香芹酚和百里香酚的含量數(shù)據(jù)可靠，回收率高且穩(wěn)定，檢出限和定量限低，能夠滿足大部分飼料產(chǎn)品的檢測，同時通過QuEChERS 技術(shù)的凈化[13]，使得樣品溶液更加純凈，在檢測過程中減少了雜峰的干擾，且不影響目標物的定性和定量，是一種新的思路，此方法操作簡單，結(jié)果準確，可以為飼料中香芹酚和百里香酚的測定提供數(shù)據(jù)參考。