基于海藻酸鈉的復(fù)合壁材包被嗜酸乳桿菌及其效果評估

楊新建 朱建晨 田 璐 王偉青 李凌燕

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

乳酸菌作為一種益生菌，其在維持動物消化道菌群平衡[1]、促進動物生長生產(chǎn)性能[2]、增強動物免疫功能[3]、改善動物機體體質(zhì)[4]以及緩解不良應(yīng)激[5]等方面的益生功能，已被多項研究所證實。但是乳酸菌多為厭氧菌或兼性厭氧菌，耐受胃酸、膽汁酸的能力差，抵抗外界溫度、濕度、O2和壓力等不良條件的能力不足，同時非同源乳酸菌還存在不易定植等缺點，致使到達腸道的乳酸菌很難達到發(fā)揮其益生作用的數(shù)量要求（107cfu/ml）[6]。

針對上述問題，將乳酸菌微膠囊化是保護其活性和數(shù)量，發(fā)揮其益生作用的較為有效的方式。而海藻酸鈉由于其便宜、易于處理、無毒、溫和的溶膠凝膠過程、良好的生物相容性、易于在腸道破裂、形成的微囊直徑?。?～3 μm）等優(yōu)點[7]，適于作為包被藥物、蛋白或細胞的微膠囊壁材。但是，在低酸環(huán)境下，由于海藻酸鈉對酸敏感，其完整性易受離子和螯合劑的影響，并且形成的膠囊多孔，使其對包被的益生菌的保護作用受到嚴重制約。因此，研究人員利各種強化手段來提高海藻酸鈉微膠囊的保護效果。

將海藻酸鈉和其它多聚物混合后對益生菌進行包埋是解決單獨海藻酸鈉包被所存在問題的首選方式[8]。這些多聚物多以多糖類的碳水化合物形式存在，與海藻酸鈉復(fù)合后，不但可通過填充海藻酸鈉微膠囊存在的孔徑提高對益生菌的保護作用，還可以幫助一些微量元素和代謝物進入微膠囊，促進微膠囊內(nèi)益生菌的存活[9]；另外，這些物質(zhì)還可作為益生元存在提高微膠囊內(nèi)的益生菌。

本研究通過前期試驗，確定成膜性能較佳的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，對目標菌嗜酸乳桿菌進行包被處理。通過檢測其包被效率、粒徑大小、耐酸性、耐膽鹽以及腸道釋放等特性，評估微膠囊對目標菌的保護性能，以期制備一種新型高效的微膠囊材料，為復(fù)合壁材微膠囊技術(shù)的應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；海藻酸鈉、瓜爾豆膠購至上海源葉生物科技有限公司；胰酶粉（4 活性單位/mg）、胃蛋白酶（≥250 活性單位/mg）購自Sigma（上海）。CaCl2（分析純）、NaCl（分析純）、NaOH（分析純）；KH2PO4（分析純）、磷酸緩沖液（PBS）、吐溫-80、豬膽鹽和鹽酸，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；魯花大豆油，購自山東魯花集團有限公司。

主要實驗設(shè)備見表1。

表1 主要儀器

1.2 方法

1.2.1 海藻酸鈉與瓜爾豆膠復(fù)合壁材對目標菌的包被

1.2.1.1 目標菌懸浮液的制備

嗜酸乳桿菌：凍存的甘油管室溫溶化后分區(qū)劃線接種于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落，接種于50 ml 三角瓶（裝液50 ml），37 ℃靜置培養(yǎng)12 h 左右，測定其OD600，再次接種于50 ml三角瓶（裝液50 ml MRS 肉湯，接種量根據(jù)“取樣體積×OD600=50×0.1”計算而得，也即是接種后使原液OD600為0.1），37 ℃靜止培養(yǎng)12 h（1×109CFU/ml 左右），然后8 500×g、4 ℃條件下離心10 min，菌泥重懸后終濃度為3×1010CFU/ml左右。

1.2.1.2 復(fù)合壁材與目標菌相容性

分別在MRS 肉湯培養(yǎng)基中加入2.5%海藻酸鈉、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠，然后取等量目標菌培養(yǎng)液接種到各混合液中，相應(yīng)條件下（37 ℃厭氧或靜置）培養(yǎng)24 h，涂布MRS 瓊脂平板進行活菌計數(shù)，以考察芯壁材的生物相容性。同時，在不含壁材的MRS肉湯培養(yǎng)基中接種相同數(shù)量菌液，同等條件下培養(yǎng)作對照。

1.2.1.3 組合壁材對目標菌的包被

采用2.5%海藻酸鈉、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠（w/v）分別作為壁材，100 ml，滅菌后，冷卻至38～40 ℃，與目標菌菌泥（2 ml）混合，攪拌均勻后，加入到300 ml大豆油中（含有0.5%吐溫-80 (w/v)），高速攪拌20～30 min（磁力攪拌器最高轉(zhuǎn)速），直到完全乳化（2 000 r/min，10 min不分層)，然后沿器壁快速(20 ml/s)加入100 ml 0.1 mol/l 的CaCl2溶液，低速攪拌至水油兩相分離（30 min），最后，在350×g、10 min 條件下離心收集微膠囊，并用0.1 mol/l 的CaCl2溶液漂洗3 次，然后將樣品用8層紗布濾去多余水分，備用。

1.2.2 微膠囊包被效果評估

1.2.2.1 微膠囊形態(tài)觀察及粒徑分布

采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察微膠囊形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用Beckman Coulter LS2000 激光粒度分析儀測定其粒徑分布。

1.2.2.2 微膠囊包被效率的測定[10]

式中：微膠囊中活菌數(shù)量為每克濕微膠囊的含菌量與微膠囊總重量的乘積；初始活菌數(shù)量為每毫升濃縮菌液的含菌量與濃縮菌液總體積的乘積。

計數(shù)方法：取1 ml 樣液或1 g 樣品加入到9 ml 0.2 mol/l、pH值8.0的磷酸緩沖液中，37 ℃溫育10 min，然后用旋渦振蕩器（或搖床）震蕩10 min，以徹底從微膠囊中釋放目標菌，然后用生理鹽水溶液進行梯度稀釋至合適濃度，涂布MRS 瓊脂平板，37 ℃、24 h 左右，計算活菌數(shù)。每個樣品重復(fù)三次。

1.2.2.3 微膠囊在胃腸液中對目標菌的保護效果評估[11]

胃液配制：取濃度為1 mol/ml 的稀鹽酸，加水稀釋，將pH 值調(diào)至1.5。每100 ml 液體中加入1 g 胃蛋白酶，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

腸液配制：取KH2PO46.8 g 加水500 ml 溶解，用0.4%（w/w)的NaOH 回調(diào)pH 值至6.8。每100 ml 液體中加入1 g 胰酶粉和2 g 的豬膽鹽，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

實驗處理：取1 g 各種微膠囊，接入含有15 ml 胃液（pH 值1.5）的滅菌三角瓶內(nèi)（帶橡膠塞），37 ℃、110 r/min、培養(yǎng)2 h。同時，胃液培養(yǎng)結(jié)束后，取1 g各種微膠囊，接入含有15 ml 腸液的滅菌三角瓶中（pH值6.8），37 ℃、110 r/min、培養(yǎng)4 h。分別在胃液和腸液培養(yǎng)結(jié)束時，按1.2.2.2 中方法進行活菌計數(shù)，按下式進行保護效果計算：

胃液中存活率(%)=

腸液中存活率(%)=

1.2.2.4 包衣微膠囊在胃腸液中釋放性能評估

取0.2 g各種處理微膠囊，接入含有3 ml胃液（pH值1.5）的10 ml 離心管中，37 ℃、110 r/min、厭氧培養(yǎng)2 h。胃液培養(yǎng)結(jié)束后，350×g 離心5 min，去除上清，加入3 ml 模擬腸液（pH 值6.8），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在胃液和腸液培養(yǎng)過程中，每隔30 min 取一個樣品管，測定微膠囊的溶脹性能。

方法：首先將樣品進行350×g離心5 min，后將離心后的沉淀，倒扣在8 層滅菌紗布上，去除多余水分后，稱重，并與微膠囊初始重量相比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010 進行整理，利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件中的one-way ANOVA 模塊進行單因素方差分析，處理間均值采用Duncan's多重比較法進行差異顯著性檢驗。試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”來表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 復(fù)合壁材與目標菌的相容性

嗜酸乳桿菌與2.5%海藻酸鈉及2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合壁材的相容性結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，無論是2.5%海藻酸鈉，還是2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠的組合，對目標菌的生長均無影響，并且在一定程度上促進了嗜酸乳桿菌的生長，尤其是2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠的組合，使嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)達到了(1.11±0.13)×109CFU/ml。但與對照（MRS肉湯）相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 嗜酸乳桿菌與復(fù)合壁材的相容性

2.2 復(fù)合壁材微膠囊形態(tài)觀察

2.5%海藻酸鈉微膠囊、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊在電鏡下的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)圖以及表面局部圖如圖2所示。結(jié)果顯示，2.5%海藻酸鈉微膠囊和2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊均具有較好的圓形度，并且在放大500倍（圖2A左、圖2B左）情況下，兩種微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)較為平滑和致密（表面為黏附的菌體），但2種微膠囊相比發(fā)現(xiàn)，2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的上述幾個方面均比2.5%海藻酸鈉微膠囊更優(yōu)。同時，微膠囊表面局部圖（圖2A右、圖2B右）結(jié)果也顯示，2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊表面的孔狀結(jié)構(gòu)和致密程度對比2.5%海藻酸鈉微膠囊均有不同程度的改善。

圖2 各種微膠囊整體形態(tài)(圖2A、B左，×500)及局部形態(tài)(圖2A、B右，×20K)

2.3 復(fù)合壁材微膠囊包被率及其粒徑大小(見表2)

表2 微膠囊包被率及粒徑大小

表2 展示了2.5%海藻酸鈉微膠囊、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的包被率和粒徑大小。根據(jù)1.2.2.2 中公式計算所得2.5%海藻酸鈉微膠囊的包被率為（35.08±1.52）%，活菌數(shù)（荷載量）為（1.43±0.30）×109CFU/g；2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的包被率為（47.49±1.91）%，活菌數(shù)（荷載量）為（1.78±0.44）×109CFU/g。二者相比，差異顯著（P＜0.05）。

粒徑大小方面，由于瓜爾豆膠的加入，復(fù)合壁材微膠囊的直徑平均值[(733.01±4.00) μm]顯著高于2.5%海藻酸鈉微膠囊[(434.71±9.54) μm]（P＜0.05）。

2.4 微膠囊包被目標菌在模擬胃腸液中的存活性能（見圖3、圖4）

根據(jù)圖3 所示，未包被嗜酸乳桿菌在模擬胃液（pH 值1.5）中作用2 h 后，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)已無法檢測到，存活率為0；而用2.5%海藻酸鈉作為壁材包被的目標菌經(jīng)模擬胃液作用2 h 后，存活率為（0.07±0.01）%，活菌數(shù)已不足106CFU/g，但與未包被組相比，差異極顯著（P＜0.01）；復(fù)合壁材包被的目標菌經(jīng)模擬胃液作用2 h后，存活率達到（0.47±0.02）%，活菌數(shù)達到8.32×106CFU/g，與2.5%海藻酸鈉組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 展示的是三種處理的目標菌在模擬腸液中作用4 h后的存活率。未包被嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)已無法檢測到，存活率為0；而用2.5%海藻酸鈉作為壁材包被的目標菌經(jīng)模擬腸液作用后，存活率為（0.16±0.03）%，活菌數(shù)為2.31×106CFU/g，與未包被組相比，差異極顯著（P＜0.01）；復(fù)合壁材包被的目標菌經(jīng)模擬腸液作用后，存活率達到（0.54±0.01）%，活菌數(shù)接近107CFU/g，與2.5%海藻酸鈉組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖3 不同處理的嗜酸乳桿菌在模擬胃液中2 h的存活率

圖4 不同處理的嗜酸乳桿菌在模擬腸液中4 h的存活率

2.5 復(fù)合壁材微膠囊在模擬胃腸液中的釋放性能（見圖5）

圖5 展示了兩種微膠囊在模擬胃腸液中溶脹性能的變化趨勢。結(jié)果顯示，2.5%海藻酸鈉微膠囊和復(fù)合壁材微膠囊進入胃液后，溶脹度快速提升，但最大溶脹點分別發(fā)生在進入腸液后的1 h 和2 h，隨后則快速下降。

3 分析討論

3.1 復(fù)合壁材對微膠囊物理狀態(tài)的影響

微膠囊技術(shù)是提高乳酸菌及其制劑抗逆能力、發(fā)揮其益生特性的有效措施。海藻酸鈉也因為其獨特的優(yōu)勢成為微膠囊的常用壁材，但有研究表明，因為海藻酸鈉微膠囊的多孔性和對酸性條件的敏感，使其對乳酸菌在酸性條件下的存活能力的提高產(chǎn)生阻礙[12]。

圖5 兩種微膠囊在模擬胃腸液中的溶脹性能

本研究利用具有良好溶解性、黏性、成凝膠特性以及低酸條件下（pH 值3.5 以下）的成膜特性的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，包被嗜酸乳桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是外部整體結(jié)構(gòu)還是局部形態(tài)，復(fù)合璧材微膠囊表面的孔狀結(jié)構(gòu)和致密程度比2.5%海藻酸鈉微膠囊均有不同程度的改善（圖2）。這其中原因主要是，瓜爾豆膠含有許多活性基團（羥基），能夠和很多物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)（醚化和酯化反應(yīng)），生成相應(yīng)的化合物并形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[13]，賦予瓜爾豆膠具有較好的成膜特性，再加上瓜爾豆膠的黏性，使其能夠有效填充海藻酸鈉形成的孔狀結(jié)構(gòu)，并使微膠囊表面有序致密[14]。一些與瓜爾豆膠具有類似性質(zhì)的物質(zhì)，如槐豆膠，也已被證實可以和海藻酸鈉復(fù)合形成微膠囊，提高對目標菌的保護作用[15]。

包被率和粒徑方面，根據(jù)表2結(jié)果可知，由于瓜爾豆膠的加入，復(fù)合壁材微膠囊包被率和平均粒徑均顯著提高(P＜0.05)。其原因可能與瓜爾豆膠的黏附性有關(guān)，因為瓜爾豆膠的主要成分是非離子型半乳甘露聚糖，具有較好水溶性，且在低質(zhì)量分數(shù)下呈現(xiàn)很高的黏度。由于黏度的增加，使壁材對目標菌的黏附能力增強，提高包被率；同樣也是因為黏度的增加，同樣的攪拌轉(zhuǎn)速對于凝膠分子的分散能力減弱，致使粒徑較大。類似的結(jié)果也被趙萌等(2015)[16]的研究結(jié)果所證實。

3.2 復(fù)合壁材對微膠囊包被目標菌生物活性的影響

微膠囊對目標菌的生物活性的影響主要包括兩方面，一是是否對包被目標菌抵抗胃酸和腸膽鹽的能力有促進作用，二是能否在目標菌發(fā)揮功能特性位點及時崩解，釋放目標菌。

圖3 和圖4 的結(jié)果表明，復(fù)合壁材微膠囊對嗜酸乳桿菌抵抗低酸、膽鹽等不利條件的能力具有明顯的促進作用，與另兩組結(jié)果相比差異極顯著（P＜0.01）。這說明，瓜爾豆膠的加入有效彌補了海藻酸鈉微膠囊多孔的缺陷，減少了胃酸、膽鹽等不利條件對嗜酸乳桿菌的活性的影響，進而提高了嗜酸乳桿菌通過胃腸不利環(huán)境，到達發(fā)揮功能位點的能力。同時，瓜爾豆膠作為一種水溶性膳食纖維，進入腸道后，可以進一步發(fā)揮相應(yīng)的生物活性，如促進體外、體內(nèi)（大腸）有益菌群的增加[17-18]，促進中短鏈脂肪酸產(chǎn)生[19]等，保護腸道健康。本研究也得到了類似的結(jié)果（圖1），但由于加入量較少（0.5%）的原因，對目標菌活性的促進效果組間差異不顯著（P＞0.05）。

溶脹性能是評估微膠囊的釋放性能的常用指標之一[20]。一般認為，微膠囊溶脹程度越高，崩解速度就越慢，包被的目標菌的釋放速度就越慢，微膠囊的釋放性能就越差。據(jù)圖5可知，2.5%海藻酸鈉微膠囊和復(fù)合壁材微膠囊分別在進入腸液后的1 h 和2 h達到最大溶脹點，也即是在此處達到最大釋放性能。二者相比，2.5%海藻酸鈉微膠囊比復(fù)合壁材微膠囊具有更佳的腸溶性能，這可能和瓜爾豆膠能夠與海藻酸鈉形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。但是，由于2.5%海藻酸鈉在胃液中對目標菌不能提供較好的保護作用，因此到達腸液后，也無法實現(xiàn)目標菌的益生功能；然而，復(fù)合壁材微膠囊雖然最大釋放點比2.5%海藻酸鈉微膠囊延遲1 h，根據(jù)Cook等（2012）[21]的觀點，食物在小腸中停留的時間大約為(3.2±1.6) h，因此進入腸道2 h達到最大釋放，并不影響目標菌功能特性的發(fā)揮。

4 結(jié)論

利用具有較好生物相容性的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，包被嗜酸乳桿菌，不但有效改善了微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)、包被率，更重要的是，在不影響嗜酸乳桿菌在腸道中及時釋放情況下，顯著促進了嗜酸乳桿菌抵抗胃液低酸環(huán)境、腸道膽鹽作用等不利條件的能力，增強了其耐受性和存活率，為嗜酸乳桿菌生物功能的發(fā)揮提供了保證，也為本研究成果的未來應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。