仔豬專用復(fù)合酶的開發(fā)及其對乳仔豬作用效果的研究

李 陽 張廣民 蔡輝益 嚴(yán) 峰 王海燕

(天津挑戰(zhàn)博德生物技術(shù)有限公司，天津301906)

在斷奶仔豬日糧中添加復(fù)合酶制劑是緩解斷奶應(yīng)激，避免生長阻滯和提高仔豬生長性能的有效措施。乳仔豬在斷奶初期由于消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚不成熟，消化道中內(nèi)源酶和胃酸等分泌不足[1]，胰腺、腸道內(nèi)各種消化酶的作用效果也有所下降[2-3]。在飼料中添加復(fù)合酶制劑，不但能補充動物內(nèi)源酶分泌不足，也能有效降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，提高飼料的營養(yǎng)價值，進而促進動物的健康生長。因此，適當(dāng)添加蛋白酶和淀粉酶會有助于改善仔豬在斷奶后的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)前飼用酶制劑的評價方法主要有酶活檢測、酶學(xué)性質(zhì)分析、體外三角瓶法以及動物試驗，然而酶制劑在實際生產(chǎn)中發(fā)揮作用受到多種因素影響，例如飼料原料的種類、加工工藝以及動物消化道內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境等。因此，除了動物試驗外，其他方法很難準(zhǔn)確反映酶制劑在動物體內(nèi)作用效果。動物試驗耗時費力，很難在短期內(nèi)有效評估。單胃動物仿生消化系統(tǒng)提供了穩(wěn)定的模擬消化液參數(shù)，達(dá)到了模擬消化液各項指標(biāo)的可重復(fù)與規(guī)范化的目標(biāo)，并成功實現(xiàn)了體外評估的“自動化、儀器化和操作規(guī)范化”[4]，可穩(wěn)定高效評價酶制劑的作用效果。通過體外篩選可大大節(jié)省復(fù)合酶制劑的開發(fā)時間和經(jīng)濟成本，目前已被行業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可。

本試驗旨在運用單胃動物仿生消化系統(tǒng)篩選出復(fù)合酶制劑酶譜組成，然后對該復(fù)合酶對乳仔豬的作用效果進行體內(nèi)評價，為飼用酶制劑的開發(fā)提供研究思路，為乳豬酶的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛋白酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶均來源于挑戰(zhàn)集團，酶活測定分別參照GB/T 28715—2012、GB/T 24401—2009、NY/T 911—2004、GB/T 23874—2009、GB/T 36861—2018、Q/HDTZW 0009—2012。

1.2 體外篩選試驗

采用單因素完全隨機設(shè)計，以玉米-豆粕型日糧（75%玉米+25%豆粕）為研究對象，按照500 g/t飼料的添加量，設(shè)計每種酶制劑在飼料中的添加水平如表1。

表1 酶制劑添加劑量的處理水平

將6 種酶制劑按照內(nèi)源酶（蛋白酶和淀粉酶）和非淀粉多糖酶（β-葡聚糖酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶）設(shè)計添加量水平。內(nèi)源酶選擇臥式模塊，以豬模擬消化液及流程進行篩選（試驗設(shè)計如表2），每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管；非淀粉多糖酶酶譜的篩選采用立式模塊進行飼料還原糖釋放量的測定（試驗設(shè)計如表3），每個處理4 個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。

表2 內(nèi)源酶酶譜篩選試驗設(shè)計

表3 非淀粉多糖酶酶譜篩選試驗設(shè)計

1.3 飼料原料及動物試驗日糧組成

采用四分法取樣后經(jīng)試驗用飼料粉碎機粉碎后過60 目篩，按照比例充分混勻后備用。體外篩選試驗所用飼料玉米和豆粕營養(yǎng)成分見表4，動物試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表5。

表4 飼料原料的營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)

1.4 試驗動物設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗各組試驗豬只每天定時喂料，自由采食，飲水器提供充足清潔飲水。其他免疫、消毒、衛(wèi)生等飼養(yǎng)管理按常規(guī)進行。選取仿生系統(tǒng)篩選的內(nèi)源酶及非淀粉多糖酶最佳酶譜組成，確定為乳豬復(fù)合酶配方。由生產(chǎn)部門負(fù)責(zé)生產(chǎn)配制動物試驗復(fù)合酶樣品，由化驗室確定復(fù)合酶合格后方可用于體內(nèi)試驗。動物試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，選用健康的(杜×長×大)三元雜交31 日齡斷奶仔豬432 頭，隨機分為3 個處理組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧、基礎(chǔ)日糧+500 g/t仔豬專用復(fù)合酶、基礎(chǔ)日糧+1 000 g/t仔豬專用復(fù)合酶，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)24頭豬。動物試驗分組如表6。

表5 日糧組成及營養(yǎng)水平

表6 動物試驗分組

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 仿生消化法測定干物質(zhì)消化率和還原糖釋放量

基于仿生消化系統(tǒng)的飼料干物質(zhì)消化率和還原糖釋放量的測定參考《單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊》。

1.5.2 生長性能檢測

預(yù)試期為7 d，正式試驗期設(shè)定為28 d，分別于正試期開始和結(jié)束時清晨空腹稱重，準(zhǔn)確記錄飼料消耗量，計算出平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

平均日增重(ADG，g)=(試驗?zāi)┢骄w重-初期平均體重)/試驗天數(shù)

平均日采食量(ADFI，g)=試驗期總耗料量/試驗天數(shù)

料重比(F/G)=平均日采食量/日增重

1.5.3 腹瀉率及發(fā)病率

試驗期間仔細(xì)觀察并記錄仔豬腹瀉情況。

腹瀉率(%)=試驗全期腹瀉頭次/（試驗頭數(shù)×試驗天數(shù)）×100

發(fā)病率(%)=觀察期間內(nèi)發(fā)生的新病例數(shù)/同期平均豬只頭數(shù)×100

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0軟件進行方差分析，如果差異顯著再進行Duncan's 法多重比較分析，其中P≤0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同酶譜對體外營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響

2.1.1 內(nèi)源酶不同添加水平對飼料體外干物質(zhì)消化率的影響

研究了不同添加水平的蛋白酶和淀粉酶對飼料干物質(zhì)消化率的影響，結(jié)果見表7。

表7 不同添加水平內(nèi)源酶對干物質(zhì)消化率的影響

由表7可知，不同內(nèi)源酶組成對體外干物質(zhì)消化率有影響。試驗表明，淀粉酶對干物質(zhì)消化率的影響較為直觀，且當(dāng)?shù)鞍酌负偷矸勖附M合添加量分別為5 000 U/kg 飼料原料和250 U/kg 飼料原料時，體外干物質(zhì)消化率最高，為79.31%。

2.1.2 不同非淀粉多糖酶添加水平對飼料還原糖釋放量的影響

研究了不同添加水平的非淀粉多糖酶對飼料還原糖釋放量的影響，結(jié)果見表8。

由表8可知，不同非淀粉多糖酶酶譜組成對還原糖釋放量有影響。α-半乳糖苷酶的添加水平對還原糖釋放量的提高具有很大作用，這可能與豆粕中半乳糖含量相對較高有關(guān)。結(jié)果表明，當(dāng)木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶添加量分別為150、7 500、1 000、75 U/kg飼料原料時，還原糖釋放量為527.38 mg/g干物質(zhì)，比對照組提高了4.57%。

因此，根據(jù)體外篩選結(jié)果，確定乳豬酶酶譜為蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶添加量分別為5 000、250、150、7 500、1 000、75 U/kg 飼料原料，根據(jù)公式[復(fù)合酶酶制劑中酶活(U/g)=飼料原料中酶制劑的添加量(U/kg)×1 000 kg/飼料中復(fù)合酶的添加量(g/t)]計算可得，即當(dāng)添加量為500 g/t 時，復(fù)合酶的酶譜組成為蛋白酶10 000 U/g、淀粉酶500 U/g、β-葡聚糖酶300 U/g、木聚糖酶15 000 U/g、β-甘露聚糖酶2 000 U/g、α-半乳糖苷酶150 U/g。

表8 不同水平非淀粉多糖酶對還原糖釋放量的影響

2.2 乳豬復(fù)合酶對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率和發(fā)病率的影響

2.2.1 乳豬復(fù)合酶及添加量對斷奶仔豬生長性能的影響

將體外仿生消化篩選出的乳豬復(fù)合酶進行了動物試驗驗證，添加量分別為500 g/t和1 000 g/t。結(jié)果見表9。由表9可知，B 組和C 組相對于對照組A，日增重有增加的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)；日采食量無明顯差異(P＞0.05)；B組料肉比相對于對照組A無顯著影響(P＞0.05)，而C 組相對于A 組料肉比降低了3.65%，且差異顯著(P＜0.05)，說明添加量的增加有利于料肉比的減小。

表9 仔豬專用復(fù)合酶及添加量對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2.2 乳豬復(fù)合酶及添加量對斷奶仔豬腹瀉率和發(fā)病率的影響（見表10）

表10 仔豬專用復(fù)合酶及添加量對斷奶仔豬腹瀉率和發(fā)病率的影響(%)

由表10 可知，仔豬專用復(fù)合酶對斷奶仔豬腹瀉率和發(fā)病率具有明顯效果，與對照組A相比，B組和C組的腹瀉率分別顯著降低了37.57%(P＜0.05)和87.03%(P＜0.05)；相對于對照組A，B 組的發(fā)病率未有顯著變化，而C 組的發(fā)病率顯著降低了79.17%(P＜0.05)。由此可見，仔豬專用復(fù)合酶對于仔豬抗病能力具有較好的作用效果。

3 討論

3.1 復(fù)合酶的體外篩選

我國乳仔豬日糧類型以玉米-豆粕型為主，玉米-豆粕型日糧的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子是非淀粉多糖，包括β-葡聚糖、木聚糖、果膠、甘露聚糖等。酶制劑作為一種功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，雖然不直接提供營養(yǎng)，但與飼料中營養(yǎng)成分的利用率息息相關(guān)[5]。飼料原料在酶制劑作用后的營養(yǎng)價值如何快速準(zhǔn)確有效的評定一直是行業(yè)內(nèi)關(guān)心的問題。用體外消化法模擬動物腸道消化吸收的生理作用，在體外通過測定加酶前后營養(yǎng)物質(zhì)消化率的變化，可對酶制劑的作用效果進行評估。Simbaya等[6]的研究表明，采用透析技術(shù)進行體外酶解，評價和比較了8種碳水化合物酶和13種蛋白酶對碳水化合物和蛋白質(zhì)體外酶解的效果，研究結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果一致性較好。廖睿等[7]的研究表明，當(dāng)仿生系統(tǒng)的上樣量在0.2～0.8 g范圍內(nèi)，還原糖釋放量與上樣量之間呈顯著相關(guān)，仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性可滿足定量分析要求。高慶濤等[8]的研究結(jié)果顯示，通過仿生消化法，檢測不同實驗室間玉米和豆粕原料酶水解物能值的總變異系數(shù)，結(jié)果表明該變異系數(shù)可控在1.64%以內(nèi)，再現(xiàn)性符合定量分析要求。本研究的結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)源酶譜不同時，體外干物質(zhì)消化率差異明顯，值得注意的是，淀粉酶的添加量越大，干物質(zhì)消化率越高，這是因為日糧中淀粉含量高。幼齡動物消化系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，淀粉酶分泌不足，添加淀粉酶有利于飼料原料的轉(zhuǎn)變成可消化的小分子化合物。當(dāng)非淀粉多糖酶組成及添加水平不同時，還原糖釋放量也有所不同。馮定遠(yuǎn)[9]提出組合酶和組合型復(fù)合酶的概念，為復(fù)合酶制劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。復(fù)合酶的酶譜組成與日糧中的非淀粉多糖成分和含量有關(guān)。酶制劑的使用效果與飼糧含抗?fàn)I養(yǎng)因子的種類和比例以及動物的種類和生長階段有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同非淀粉多糖酶酶譜組成對還原糖釋放量有明顯影響，其中α-半乳糖苷酶效果最好，這可能與豆粕中半乳糖含量相對較高有關(guān)。綜合內(nèi)源酶與外源酶的作用效果，當(dāng)酶譜為蛋白酶10 000 U/g、淀粉酶500 U/g、β-葡聚糖酶300 U/g、木聚糖酶15 000 U/g、β-甘露聚糖酶2 000 U/g、α-半乳糖苷酶150 U/g時，酶制劑的效果最優(yōu)。因此，酶制劑的酶譜組成中單酶含量并不是越多越好，添加量應(yīng)在一個適合范圍內(nèi)，合理的酶制劑的添加水平非常重要。這一點與廖睿[10]的研究結(jié)果一致。

3.2 乳豬復(fù)合酶對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率和發(fā)病率的影響

在仔豬日糧中添加復(fù)合酶，可以補充內(nèi)源酶不足，激活內(nèi)源酶分泌，提高仔豬對淀粉、蛋白質(zhì)及非淀粉多糖的消化利用，提高腸道健康狀態(tài)。高玉紅等[11]在斷奶仔豬日糧中添加由酸性蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、纖維素酶以及果膠酶等組成的復(fù)合酶，仔豬日增重高于對照組，料重比也有較大程度地改善(P＞0.05)，隨著酶量的增加，料重比比對照組分別降低8.33%、15.42%和17.08%。而李國旺等[12]的研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加0.05%、0.1%和0.15%的乳豬復(fù)合酶，平均日增重分別比對照組提高5.5%、10.7%、10.9%，腹瀉率分別下降24%、28%、28%。本研究結(jié)果表明，經(jīng)單胃動物仿生消化系統(tǒng)篩選的乳豬復(fù)合酶在體內(nèi)作用效果較好。與不加酶組相比，添加乳豬復(fù)合酶對于日增重有增加趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)，對日均采食量無明顯差異(P＞0.05)，這可能是因為非淀粉多糖酶將日糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解后提高飼料中能量和蛋白質(zhì)的營養(yǎng)利用率。每噸飼料添加量為500 g時，與對照組相比料肉比無顯著變化(P＜0.05)；每噸添加量為1 000 g時，料肉比顯著降低了3.65%，差異顯著(P＜0.05)，說明添加量的適當(dāng)增加有利于料肉比的減小。該仔豬專用復(fù)合酶對斷奶仔豬腹瀉率和發(fā)病率具有明顯效果，與不加酶組相比，每噸飼料添加500 g和1 000 g復(fù)合酶，仔豬的腹瀉率分別顯著降低了37.57%(P＜0.05)和87.03%(P＜0.05)；相對于對照組，添加500 g乳豬酶組的發(fā)病率沒有顯著變化，而添加1 000 g 組的發(fā)病率顯著降低了79.17%(P＜0.05)。仔豬專用復(fù)合酶對于提高仔豬抗病能力具有較好的作用效果，但是在合理范圍內(nèi)較大量添加可更好改善乳仔豬的腸道微生態(tài)健康，減少腹瀉和疾病的發(fā)生，該結(jié)果趨勢與李國旺[12]等的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

通過單胃動物仿生消化系統(tǒng)可科學(xué)、高效、穩(wěn)定地進行體外試驗篩選仔豬專用復(fù)合酶，動物試驗結(jié)果顯示，添加復(fù)合酶可有效改善料肉比，降低腹瀉率和發(fā)病率，該仔豬專用復(fù)合酶對于乳仔豬的生長性能和抗病能力具有較好的改善作用。