常壓室溫等離子體誘變選育乳酸乙酯酯化酶高產菌株

韓 經，張華東，許忠平，任 雪，魏曉慶，肖冬光*

（天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

酯酶也稱羧基酯酶，指能夠水解羧酯鍵的酶類，功能與脂肪酶類似，在酶學上并無酯化酶這一術語，由于該酶具有合成與分解酯類的催化作用，因此在白酒行業(yè)內通常稱之為酯化酶和酯分解酶[1-2]。

在自然界中能產生酯酶的微生物是非常豐富的，其中霉菌作為白酒中重要的產酯微生物[3-5]，其分泌的酯化酶能催化乳酸菌代謝產生的乳酸和酵母酒精發(fā)酵產生的乙醇酯化合成乳酸乙酯。乳酸乙酯是白酒中重要的呈香成分[6]，對白酒品質具有重要作用，乳酸乙酯含量高是我國白酒的顯著特征之一[7]，并且乳酸乙酯作為能與水和乙醇互溶的唯一的乙酯類，在水味重酒味淡薄的酒中，還能消除酒的水味，增加濃厚感[8]。當今研究發(fā)現在白酒生產中中乳酸乙酯的合成相較于酶催化，主要以化學合成為主[9-10]，并其合成速度非常緩慢。而近年來隨著清潔化生產的推進[11]，出現了基酒中乳酸乙酯含量不足的問題，因此需要迫切尋找一種白酒專用高產乳酸乙酯酯化酶菌株應用于白酒生產中，提高白酒的質量，降低生產成本。目前國內對于產乳酸乙酯酯化酶菌株的研究較少，大多數還是通過一些常用的工業(yè)菌株紅曲霉，根霉進行研究[12-14]，相反對于己酸乙酯酯化酶的研究很多[15]，并將其廣泛應用于濃香型白酒的增香與調味酒中[16]。

常壓室溫等離子體（atmospheric pressure room temperature plasma，ARTP）作為一種操作簡便，對人與環(huán)境均無害，突變率高的誘變技術[17]，已廣泛應用于細菌、霉菌、酵母、放線菌等微生物的誘變育種[18-20]，均取得較好成果。有文獻報道，ARTP誘變成功篩選出一株高產己酸乙酯酯化酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[21]，但國內外對于乳酸乙酯酯化酶菌株的篩選和誘變研究較少，并且酯化酶篩選存在對底物專一性不足的問題。因此，本研究通過對多株霉菌乳酸乙酯合成量的比較，通過常壓室溫等離子體誘變，并采用多級篩選體系，篩選出一株酶活明顯提高的突變株，應用于白酒的生產，旨在提升白酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學試劑

乳酸、乙醇（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；三丁酸甘油酯（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.1.2 菌種

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）M16、煙色紅曲霉（Aspergillus fumigatus）M6、根霉（Rhizopus）Q303、華根霉（Rhizopus chinensis）R3、米曲霉（Aspergillus oryzae）A12、黑曲霉（Aspergillus niger）T103：由天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

一級平板篩選培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL；乳化液：將19 mL 3%的聚乙烯醇溶液與1 mL三丁酸甘油酯充分混合；將PDA固體培養(yǎng)基和乳化液按4∶1的體積比混合，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。主要用于菌種活化和誘變前菌種萌發(fā)。

PDA固體斜面培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。主要用于突變株的保藏。

麩曲固體培養(yǎng)基：

①試管培養(yǎng)（一級種）：稱取一定量的麩皮，加水65%左右，拌勻后分裝試管，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。

②三角瓶培養(yǎng)（二級種）：稱取一定量的麩皮，加水80%，充分拌勻，裝入500 mL三角瓶內，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

EL20實驗室pH計：梅特勒儀器（上海）有限公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；BXW-360SD-G立式壓力滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；TS-2402CL恒溫搖床：上海捷呈實驗儀器有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；ARTP-IIS常壓室溫等離子誘變儀：北京思清源生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 純種麩曲的培養(yǎng)

將滅菌的一級麩曲試管接種煙色紅曲霉M6、紫色紅曲霉M16、Q303根霉、華根霉R3、米曲霉A12、黑曲霉T103孢子，置于30 ℃培養(yǎng)48 h，菌絲體遍布麩皮，置于37 ℃培養(yǎng)箱烘干，振蕩打散即為一級種子。待冷卻后將一級種子接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，充分搖勻，30 ℃培養(yǎng)40 h，待菌絲體布滿并將麩皮連成餅狀時進行扣瓶，使麩皮脫離底部繼續(xù)培養(yǎng)1 d，即可出瓶。出瓶后置于牛皮袋內，于37～40 ℃快速烘干（含水量＜12%），充分打散并保存。

1.3.2 乳酸乙酯酯合成量的測定

吸取1 mL乳酸和20 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻后轉入250 mL玻璃瓶中，加5 g烘干曲粉，于30 ℃保溫酯化7 d。然后加入50 mL 蒸餾水于1 000 mL 蒸餾燒瓶中加熱蒸餾，并接收餾出液100 mL。取酯化餾出液進行氣相色譜分析，其色譜檢測條件如下：Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為高純氮氣（N2）（純度＞99.999%）；柱流速為0.8 mL/min；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度200 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比為10∶1。

1.3.3 出發(fā)菌株的選擇

（1）不同菌種麩曲催化合成乳酸乙酯含量的比較

按照1.3.1的方法，實驗組將煙色紅曲霉M6、紫色紅曲霉M16、Q303根霉、華根霉R3、米曲霉A12、黑曲霉T103分別培養(yǎng)制成麩曲，并以不添加曲粉的反應體系為對照組，且將對照組的反應條件與實驗組調成一致。每組實驗做3次平行，按1.3.2的方法測定乳酸乙酯合成量，比較各菌株所產酯化酶對合成乳酸乙酯的能力，并初步挑選產乳酸乙酯酯化酶菌株以供后續(xù)實驗。

（2）pH對酯化酶催化合成乳酸乙酯含量的影響

在pH值2.5～5.0的范圍內，以pH值0.5為一個梯度，共設6個梯度，實驗組分別在各pH值下測定酯化酶對乳酸乙酯合成量的大小，并以不添加曲粉的反應體系為對照組，保持酯化力測定中的溫度和其他條件不變。每組實驗做3次平行，按1.3.2的方法測定乳酸乙酯合成量。以此來確定酯化酶的最適酯化pH值。

（3）溫度對酯化酶催化合成乳酸乙酯含量的影響

在溫度值20～45 ℃的范圍內，以溫度值5 ℃為一個梯度，共設6個梯度，實驗組分別在各溫度下測定酯化酶對乳酸乙酯合成量的大小，并以不添加曲粉的反應體系作為對照組，每組實驗做3次平行，按1.3.2的方法測定乳酸乙酯合成量。以此確定酯化酶的最適酯化溫度。

1.3.4 篩選方法的建立

（1）一級篩選

利用菌株產生的酯酶分解三丁酸甘油酯產生脂肪酸和甘油，從而形成透明圈的原理。將經過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變的孢子菌懸液稀釋涂布于一級篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d。挑選產透明圈大的單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基，4 ℃保藏，以產生的透明圈的大小來衡量菌株產酯酶能力的高低。

（2）二級篩選

為了篩選的便捷并且更加準確地衡量產乳酸乙酯酯化酶的能力，將一級篩選得到的透明圈直徑D與菌落直徑d的比值較大的菌株接種于裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在100 mL水相體系中，以80 mL土豆液體培養(yǎng)基為基質，添加2%玉米粉為碳源，1%的豆粕為氮源，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h制備酯化酶液[22]，為節(jié)約篩選時間并能測定突變株的最佳酶活，調pH為3.5，靜置酯化4 d，測定乳酸乙酯合成量。

（3）三級篩選

將二級篩選得到的產乳酸乙酯較高的菌株按1.3.1的方法制成麩曲，調pH為3.5，進行乳酸乙酯合成量測定。

1.3.5 ARTP菌種誘變

（1）孢子懸液的制備

將菌株接入PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，然后用5 mL滅菌的生理鹽水洗下孢子，置于裝有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中，充分打散，并在30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 h使菌株孢子萌發(fā)[23]，然后用無菌脫脂棉過濾即得孢子菌懸液。調整孢子懸液濃度為105～106個/mL。

（2）ARTP誘變過程

利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變儀對菌種進行誘變。誘變時的工作氣體為氦氣。按照處理功率100 W，氦氣流量12 L/min，樣品與等離子體發(fā)生器出口距離2 mm，操作溫度在25～35 ℃，每個金屬載片上均勻涂布10 μL的孢子菌懸液，分別按30、60、90、120、150、180、210、240、270 s不同的誘變照射時間來處理孢子懸浮液，誘變后將金屬載片置于裝有1 mL無菌生理鹽水的EP管中，振蕩懸浮，每個處理時間分別做10-1、10-2、10-3三個稀釋度進行涂板，每個稀釋度涂3個平板，30 ℃培養(yǎng)5 d后進行計數，通過菌落形成單位（colony-forming units，CFU）來計算致死率、正突變率，其計算公式如下：

式中：正突變菌落數為透明圈直徑大于出發(fā)菌株透明圈直徑的菌落數。

（3）最佳誘變時間的選擇

通過CFU平板菌落計數法繪制菌株誘變后的致死率、正突變率曲線。對曲線數據進行分析，以正突變率最高的時間點作為最佳誘變時間點進行后續(xù)誘變處理。

（4）遺傳穩(wěn)定性分析

連續(xù)傳代5代，按1.3.1的方法制成麩曲，對誘變篩選得到的突變株黑曲霉T206進行乳酸乙酯酯化能力的測定，考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 出發(fā)菌株的選擇

2.1.1 不同菌種麩曲乳酸乙酯合成量的比較

通過將實驗室篩選保存的煙色紅曲霉M6，紫色紅曲霉M16，根霉Q303，華根霉R3，米曲霉SQ12，黑曲霉T103固體培養(yǎng)分別制成麩曲，30 ℃靜置酯化7 d，蒸餾測定各霉菌麩曲催化合成乳酸乙酯的能力，結果見圖1。

圖1 不同菌株麩曲的乳酸乙酯酯化力比較Fig.1 Comparison of ethyl lactate esterification power of different Fuqu

由圖1可知，在催化合成乳酸乙酯的酯化能力上來看，米曲霉A12達到250.15 mg/L，煙色紅曲霉M6達到180.35 mg/L，Q303根霉達到85.75 mg/L，華根霉R3達到58.75 mg/L，紫色紅曲霉M16達到289.15 mg/L，均低于空白對照（化學合成）的315.28 mg/L，說明其對催化合成乳酸乙酯幾乎沒有作用，甚至起到了酯分解酶的作用，只有黑曲霉T103對乳酸乙酯的合成量最高，達到了601.75 mg/L。因此，初步選擇黑曲霉T103為出發(fā)菌株，并進一步探究其所產酯化酶最適酯化pH和最適酯化溫度。

2.1.2 pH對黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響

圖2 pH值對黑曲霉T103酯化酶合成乳酸乙酯的影響Fig.2 Effect of pH on the synthesis of ethyl lactate by esterase from Aspergillus niger T103

由圖2可知，pH值對黑曲酯化酶酯化乳酸乙酯有很大影響，隨著pH值的上升，化學作用合成乳酸乙酯的量逐漸減少，當pH值＜3.5時，酶作用合成乳酸乙酯的量隨著pH的升高而逐漸增加，當pH值達到3.5時，此時酶作用酯化乳酸乙酯的量最大，達到602.37 mg/L，當pH值大于3.5時，酶作用隨著pH的升高而下降，因此黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適pH值為3.5。

2.1.3 溫度對黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響

表1 溫度對黑曲霉T103酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 1 Effect of temperature on the synthesis of ethyl lactate by esterase from Aspergillus niger T103 mg/L

由表1可知，隨著溫度的上升，分子的熱運動速率加快，乳酸乙酯的化學合成量是一直增加的，當溫度在20～30 ℃時，黑曲霉作用酯合成量＞化學作用酯合成量，說明黑曲酶作用合成乳酸乙酯占有主導作用，在溫度20 ℃時，酶作用酯化能力最強，達到327.59 mg/L，隨著溫度的上升，酶酯化作用越來越弱，化學作用越來越強，當溫度高于40 ℃時，高溫使黑曲酯化酶變性失活，因而黑曲酯化酶對乳酸乙酯的酯化幾乎沒有作用。而當溫度為30 ℃時，此時綜合作用酯化乳酸乙酯的量最高，達到601.98 mg/L。因此，黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適溫度為30 ℃。

2.1.4 出發(fā)菌株的確定

通過對6株霉菌產酯化酶合成乳酸乙酯能力的比較，其中黑曲霉T103對乳酸乙酯具有合成作用，并進一步發(fā)現其最適酯化pH為3.5，最適酯化溫度為30 ℃，符合白酒發(fā)酵的基礎條件，因此確定黑曲霉T103為出發(fā)菌株以供后續(xù)實驗。

2.2 誘變菌株的篩選

2.2.1 ARTP誘變致死率和正突變率曲線的測定

對黑曲霉的孢子進行前培養(yǎng)萌發(fā)后，進行ARTP誘變處理，對黑曲霉T103誘變的致死率和正突變率進行計算，并繪制致死率和正突變率曲線，結果見圖3。

由圖3可知，在60 s前致死率上升緩慢，但在90 s時致死率急劇上升至92%，隨后在120 s下降至84%，210 s以后上升至96%左右，隨著誘變時間的增加，270 s后致死率接近100%。為了盡可能多的選育出好的突變株，選擇致死率為70%～80%誘變平板中誘變菌株，并在120 s時正突變率較高。因此，確定誘變時間為120 s，進行后續(xù)菌株選育。

圖3 誘變時間對黑曲霉T103致死率及正突變率的影響Fig.3 Effect of mutagenesis time on lethality and positive mutation rate of Aspergillus niger T103

2.2.2 菌株初篩

采用添加三丁酸甘油酯產透明圈的方法，通過對各突變株透明圈大小的比較，總共挑選100個透明圈有明顯的變化的菌株。

2.2.3 二級篩選

將初篩的100株菌進行液態(tài)培養(yǎng)產酯化酶，并按照二級篩選體系進行乳酸乙酯合成量的測定，結果見表2。

表2 誘變黑曲霉菌株二級篩選結果Table 2 Secondary screening results of mutant Aspergillus niger

由表2可知，二級篩選體系中，出發(fā)菌株黑曲霉T103對乳酸乙酯合成量為430.15 mg/L，與出發(fā)菌株相比，發(fā)現有6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）對乳酸乙酯合成量在500 mg/L以上，其中菌株H7對乳酸乙酯的合成能力最高，達到530.18 mg/L。因此，選擇這6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）進行三級篩選，確定其固態(tài)培養(yǎng)產酯化酶催化合成乳酸乙酯能力的大小。

2.2.4 三級篩選

將二級篩選出的產酶能力提高的誘變菌株進行麩曲固態(tài)培養(yǎng)，制成麩曲烘干并測定乳酸乙酯合成量，結果見圖4。

圖4 誘變黑曲霉菌株三級篩選結果Fig.4 Tertiary screening results of mutant Aspergillus niger

由圖4可知，6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）的乳酸乙酯合成量都有一定提高，其中菌株No.7（初步命名為黑曲霉T206）合成乳酸乙酯的量最高，達到892.15 mg/L，相較于出發(fā)菌株的727.88 mg/L提高了22.71%。

2.2.5 遺傳穩(wěn)定性研究

為了檢測誘變菌株產酯化酶能力的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代5代，按酯化力的測定方法，測定其對乳酸乙酯的酯化能力，結果表明乳酸乙酯的合成量穩(wěn)定在880.58 mg/L左右，總體突變菌株黑曲霉T206具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結論

通過對6株霉菌（煙色紅曲霉M6，紫色紅曲霉M16，Q303根霉，華根霉R3，米曲霉A12，黑曲霉T103）進行乳酸乙酯酯化能力的測定，發(fā)現只有黑曲霉T103對乳酸乙酯的合成具有催化作用，并探究了黑曲霉T103酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適pH值為3.5，最適溫度為30 ℃，符合白酒發(fā)酵的基礎條件，因此確定黑曲霉T103為出發(fā)菌株。進一步采用ARTP誘變技術對其進行誘變，結合透明圈法初篩、液體產酶的二級篩選及固態(tài)產酶的三級篩選，得到一株酶活較高的為突變株黑曲霉T206，其液態(tài)、固態(tài)產酶催化乳酸乙酯的合成量分別為530.18 mg/L、892.15 mg/L，相較于出發(fā)菌株黑曲霉T103分別提高了23.56%、22.71%。