混合型苦瓜保健酒的發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

那廣寧，徐銘悅，鄭詩(shī)綺，李云躍，汪 琢

（沈陽(yáng)工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122）

苦瓜（Momordica charantial）是葫蘆科苦瓜屬一年生攀援狀柔弱草本植物，又名涼瓜、癩瓜、君子菜、錦荔枝等，廣泛種植于熱帶亞熱帶國(guó)家，栽培歷史悠久?？伤幨臣嬗?、性味苦寒、清心明目，素有“藥用蔬菜之稱”[1-3]?？喙现谐撕胸S富蛋白質(zhì)，脂類和維生素外，還有特殊的化學(xué)成分，如凝集素，苦瓜素，苦瓜抑制劑，苦瓜皂苷等[4-5]。保健酒是指對(duì)人體具有保健作用的飲料酒，在中國(guó)有著悠久的歷史。隨著生活水平的提高，人們對(duì)健康越來(lái)越重視，保健酒兼具保健及酒類特點(diǎn)，其發(fā)展迎來(lái)了重大的機(jī)遇期，近年來(lái)成為了食品飲料行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

皂苷是存在于自然界中一種天然物質(zhì)，自然界許多植物里含有皂苷成分。如大豆、桔梗、人參、柴胡、三七、苦瓜、麥門(mén)冬、木通、茶葉等均含有皂苷?？喙显碥照伎喙细晌镔|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的4%，大部分屬于三萜類[6-7]?？喙现械娜圃碥罩饕êJ素烷型四環(huán)三萜和烏蘇酸型五環(huán)三萜[8]。現(xiàn)代研究證實(shí)，苦瓜皂苷具有降血糖、抗氧化、抗病毒、降低膽固醇、養(yǎng)血滋肝和抑菌的功效[9-15]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)微生物法轉(zhuǎn)化人參皂苷做了深入的研究。植物乳桿菌對(duì)皂苷有較高的轉(zhuǎn)化效率，可作為釀造功能性酒品的發(fā)酵菌種[16]。

該研究以苦瓜汁和果蔬汁為原料釀酒，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出感官評(píng)價(jià)最好、測(cè)定其皂苷含量及酒精度，并研究其抗氧化活性，旨在找出苦瓜酒的保健功能，為苦瓜的深加工及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

苦瓜、金冠蘋(píng)果、菠蘿、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：武漢欣欣佳麗生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀：上海展云化工有限公司；果膠酶（5萬(wàn)U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.85%）：撫順市食品藥品檢驗(yàn)所?？箟难?、硫酸亞鐵、三氯化鐵、香草醛、冰乙酸、高氯酸、無(wú)水乙醇、甲醇、三氯乙酸、鹽酸等均為分析純：廣州化學(xué)試劑廠。所有水均為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

MC型電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；SB25-12DTDN超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：上海盧湘儀宜儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FD-1E-50冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；UV-721型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；DL102電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；SJ03-250蘇泊爾多功能攪拌機(jī)：浙江蘇泊爾股份有限公司；FA1004電子分析天平：上海民橋精密科技儀器有限公司；0-40度酒精計(jì)：康華儀器儀表廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦瓜保健酒釀造工藝流程

新鮮水果→去皮去核→切塊榨汁→加偏重亞硫酸鉀→加果膠酶→靜置24 h→取上清液→與苦瓜汁混合→活化菌種→加菌種→加糖→主發(fā)酵→倒灌→后發(fā)酵→下膠→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料挑選：選取成熟度適宜、表皮完好的新鮮水果及肉質(zhì)厚、成熟度適中、外皮青綠色、無(wú)病斑、無(wú)機(jī)械傷的苦瓜，剔除質(zhì)量不佳的原料。

破碎榨汁：蘋(píng)果去核，菠蘿去皮，切成小塊分別用榨汁機(jī)榨碎后果汁以1∶1混勻。

添加試劑：為防止蘋(píng)果氧化應(yīng)迅速灌裝或在榨汁過(guò)程中按100 L加入12～20 g偏重亞硫酸鉀，再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的果膠酶以保證出汁率與澄清度，靜置24 h使果膠酶充分作用于原液。加糖時(shí)，用果汁溶解后再將其均勻撒入發(fā)酵液中，以保證發(fā)酵體系中糖濃度的均衡。

苦瓜汁的制作：將苦瓜清洗，剖分去籽，再將苦瓜破碎成1 cm3左右的瓜丁，于沸水中漂燙2 min，立即冷卻，瀝干，打漿。漿液中添加0.02‰的Na2SO3，冷藏備用。

菌種活化：酵母菌用37 ℃果汁活化30 min；植物乳桿菌活化：用無(wú)菌吸管吸取1 mL已滅菌的常溫乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）液體，移至菌種管內(nèi)，輕微充分振蕩，將凍干乳酸菌體溶解成懸浮液狀，取約0.5 mL的菌液MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，連續(xù)培養(yǎng)三代后再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后，挑選生長(zhǎng)旺盛的單菌落。將生長(zhǎng)旺盛的單菌落接種到已滅菌的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，即得菌液，備用[16]。

主發(fā)酵與后發(fā)酵：將活化好的菌種固定酵母菌添加量為0.1%，混合乳酸菌一起加入發(fā)酵液后封閉罐口，于24 ℃環(huán)境（波動(dòng)不大于5 ℃）發(fā)酵一周，每日早晚監(jiān)測(cè)溫度。一周后（即主發(fā)酵結(jié)束）立即倒罐，棄下層沉淀。倒罐后加少量偏重亞硫酸鉀，在10 ℃條件下密封陳釀一個(gè)月。

下膠：采用蛋清下膠，用量為每1 000 L果酒20個(gè)蛋清。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）果汁與苦瓜汁比例對(duì)苦瓜保健酒的影響：固定酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量為5 mL/L，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為10 d，蘋(píng)果菠蘿汁與苦瓜汁比例分別為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，以酒精度、感官評(píng)分及皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)苦瓜保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦瓜保健酒的影響：固定蘋(píng)果菠蘿汁與苦瓜汁比例為1∶2，酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量5 mL/L，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d，以酒精度、感官評(píng)分及皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)苦瓜保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（3）菌種添加量對(duì)苦瓜保健酒的影響：固定發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為10 d，果汁與苦瓜汁比例為1∶2，固定酵母菌添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量分別為3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L、6 mL/L、7 mL/L、8 mL/L、9 mL/L，以酒精度，感官評(píng)分及皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)苦瓜保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（4）發(fā)酵溫度對(duì)苦瓜保健酒的影響：固定果汁與苦瓜汁比例為1∶2，酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量為5 mL/L，發(fā)酵時(shí)間為10 d，發(fā)酵溫度分別為17.5 ℃、20 ℃、22.5 ℃、25 ℃、27.5 ℃、30 ℃、32.5 ℃，以酒精度，感官評(píng)分及皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)苦瓜保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行分析處理。以感官評(píng)分為響應(yīng)值，選擇果汁與苦瓜汁比值、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加量和發(fā)酵溫度為影響因素，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.5 苦瓜酒皂苷含量的測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品10 mg加甲醇溶液定容至10 mL之后搖勻，得1 g/L的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0、40、80、120、160、200、240 mL于500 mL具塞試管中，在70 ℃水浴揮干溶劑。先加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，高氯酸0.6 mL。搖勻，于70 ℃水浴鍋閉口加熱振蕩20 min，取出后用冰水冷卻至0 ℃。加入冰乙酸5 mL稀釋，搖勻，靜置15 min。以甲醇溶液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度值。以波長(zhǎng)550 nm處測(cè)得的吸光度值y為縱坐標(biāo)，人參皂苷Rg1的取樣量x為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.002 8x-0.001 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 6。

取適量的苦瓜保健酒置于10 mL的具塞試管中，在水浴中揮干溶劑，以甲醇溶液為空白對(duì)照，在可見(jiàn)分光光度計(jì)550 nm處測(cè)得吸光度值，并按公式（1）計(jì)算苦瓜皂苷提取率。

式中：1為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，g/L；x為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液的取樣量，L；V為定容體積，L；v為實(shí)際待測(cè)液取樣量，L；M為苦瓜粉質(zhì)量，g。

1.3.6 酒精度的測(cè)定

利用酒精計(jì)測(cè)定酒精度。

1.3.7 感官評(píng)定

感官指標(biāo)：混合果酒呈嫩綠色，果香與酒香味搭配和諧，芳香醇和，無(wú)異味，澄清有光澤，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的要求。對(duì)混合果酒進(jìn)行感官評(píng)定（滿分100分），感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 果酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine

1.3.8 抗氧化活性的測(cè)定

（1）苦瓜保健酒對(duì)羥自由基的清除作用

將苦瓜保健酒用蒸餾水配制為質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL、0.60 mg/mL、0.90 mg/mL、1.20 mg/mL、1.50 mg/mL、1.80 mg/mL的樣液，分別吸取1.2 mL樣品溶液于具塞試管中依次加入4 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液，3 mL 1 mmol/L H2O2溶液，輕輕搖勻，再加入4 mL 5 mmol/L水楊酸溶液，在38 ℃水溶鍋中振蕩加熱55 min，取出自然冷卻至室溫，最后測(cè)吸光度值A(chǔ)1，同時(shí)如上操作，用3 mL蒸餾水代替3 mL H2O2溶液測(cè)吸光度值，記錄為A2，用蒸餾水代替樣液作為空白對(duì)照，吸光度值為A0，同時(shí)以VC作陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

（2）苦瓜保健酒還原Fe3+能力的測(cè)定

將苦瓜保健酒用蒸餾水配制為質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80 mg/mL的樣液，分別吸取2 mL樣品溶液于具塞試管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液（K3Fe（CN）6），于50 ℃水浴中保溫20 min后在冰浴中快速冷卻，再加入2 mL10%三氯乙酸溶液，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2 mL蒸餾水，0.4 mL 0.1%三氯化鐵，充分混勻，靜置12 min后，在波長(zhǎng)700 nm條件下測(cè)定其吸光度值（以蒸餾水為參比溶液），同時(shí)以VC作為標(biāo)樣，操作同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 混合果汁與苦瓜汁比例對(duì)苦瓜保健酒的影響

圖1 混合果汁與苦瓜汁比例對(duì)苦瓜酒的影響Fig.1 Effect of the proportion of compound fruit juice to Momordica charantia juice on M.charantia wine

由圖1可知，隨混合果汁比例的增大，苦瓜酒的酒精度增加，在添加比為3∶1時(shí)達(dá)到最高，是由于蘋(píng)果和菠蘿的含糖量高于苦瓜，在發(fā)酵時(shí)能夠形成更高的酒精度。當(dāng)混合果汁∶苦瓜汁添加比為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2時(shí)，酒體的苦味重，果香味較淡。當(dāng)添加比為2∶1和3∶1時(shí)，酒體無(wú)苦瓜感官特征，果香味濃。當(dāng)蘋(píng)果菠蘿混合果汁與苦瓜汁添加比為1∶1時(shí)，苦瓜酒的感官評(píng)分最佳?？傇碥蘸侩S苦瓜用量的減少呈下降趨勢(shì)，當(dāng)苦瓜汁含量低于50%時(shí)皂苷含量明顯下降。因此，蘋(píng)果菠蘿混合果汁與苦瓜汁添加比為1∶1時(shí)效果最佳，此時(shí)感官評(píng)分為86分，酒精度為10.8%vol，皂苷含量為2.26%。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦瓜保健酒的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦瓜酒的影響Fig.2 Effect of fermentation time on Momordica charantia wine

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精度增加后保持平穩(wěn)，10 d以前變化明顯，10 d后基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。在發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，果香較重，酒香較淡。20 d以后苦瓜酒產(chǎn)生較重酸味，感官評(píng)分明顯下降。在發(fā)酵10～20 d時(shí)，感官評(píng)定趨于穩(wěn)定，10 d時(shí)感官評(píng)分最佳?？傇碥蘸吭诎l(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，10 d前較為明顯，10 d后趨于平緩，說(shuō)明皂苷含量已接近最大值。因此，發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)效果最佳，此時(shí)感官評(píng)分為90分，酒精度為11%vol，皂苷含量為2.71%。

2.1.3 乳酸菌添加量對(duì)苦瓜保健酒的影響

圖3 乳酸菌添加量對(duì)苦瓜保健酒的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculum on Momordica charantia wine

由圖3可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行釀酒酵母生成的酒精量增多，乳酸菌用量在3～6 mL/L范圍內(nèi)變化明顯，超過(guò)6 mL/L時(shí)酒精度趨于穩(wěn)定，是由于過(guò)量的乳酸菌抑制了酵母菌的發(fā)酵作用。當(dāng)乳酸菌添加量為3 mL/L時(shí)，酒體的果香和菜香較濃，苦味較重，酒香較淡，當(dāng)乳酸菌添加量為7～9 mL/L時(shí)，乳酸味稍明顯，影響了酒的味道。隨著乳酸菌添加量的增大，總皂苷含量增加，在添加量為3～5 mL/L時(shí)變化明顯，超過(guò)5 mL/L時(shí)皂苷含量變化趨于平穩(wěn)，說(shuō)明皂苷積累量已經(jīng)接近最大值。因此，乳酸菌添加量為6 mL/L時(shí)效果最佳，此時(shí)感官評(píng)分為84分，酒精度為9.5%vol，皂苷含量為2.71%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)苦瓜保健酒的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)苦瓜酒的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on Momordica charantia wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度逐漸增大，菌種表現(xiàn)出較好的發(fā)酵活力。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)25 ℃時(shí)，酒體香氣流失過(guò)多，口感不細(xì)膩，感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，此時(shí)酒體色澤飽滿鮮亮，香氣濃郁。隨著溫度的升高，總皂苷含量增加，說(shuō)明在較高溫度下乳酸菌對(duì)皂苷有較高的轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，效果最佳，此時(shí)感官評(píng)分為92分，酒精度為11.3%vol，皂苷含量為2.62%。

2.2 苦瓜保健酒發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，果酒發(fā)酵結(jié)束后分別對(duì)酒精度、感官評(píng)分及皂苷含量測(cè)定，以皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

續(xù)表

利用Design Expert軟件對(duì)表3中的響應(yīng)值進(jìn)行二元回歸擬合分析，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型：

表4 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4可知，二次回歸模型的F=66.20，P＜0.000 1，說(shuō)明苦瓜保健酒中皂苷含量（Y）與4個(gè)因素之間的回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)P=0.068 4＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著。響應(yīng)面優(yōu)化擬合出的方程回歸項(xiàng)的模型P＜0.05，有顯著性差異，失擬項(xiàng)（P=0.671 7＞0.05）差異不顯著。

試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定性系數(shù)R2=0.984 1，說(shuō)明皂苷得率的結(jié)果與預(yù)測(cè)值結(jié)果有良好的一致性，校正決定系數(shù)，表示試驗(yàn)結(jié)果有96.92%受試驗(yàn)因素影響。此外模型的響應(yīng)值變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值為3.99%，說(shuō)明模型的重現(xiàn)性好，所以此模型可以用于分析和預(yù)測(cè)苦瓜保健酒中的皂苷含量。同時(shí)從表4中還能看出，D、AB、BC、A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）?；貧w方程各項(xiàng)方差分析中F檢驗(yàn)可以判斷自變量對(duì)因變量的影響，由此，可以看出4個(gè)因素對(duì)苦瓜保健酒中的皂苷含量的影響大小排列順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞菌種添加量＞果蔬汁比例。

2.3 三維響應(yīng)面和等高線分析

以皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，AB、BC的交互作用對(duì)苦瓜酒皂苷含量影響的結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5（a）可以看出AB曲面圖最陡，二者的相互影響作用最為顯著。隨著發(fā)酵時(shí)間（B）和果蔬汁比例的增大，皂苷的含量先上增大后基本保持不變，說(shuō)明苦瓜酒中的皂苷己經(jīng)趨于最大值。圖5（b）中隨著發(fā)酵溫度（B）和菌種添加量（C）的增加，皂苷的含量均呈現(xiàn)先增大，達(dá)到最高值時(shí)又快速減小的趨勢(shì)。說(shuō)明發(fā)酵溫度或菌種添加量過(guò)大會(huì)對(duì)皂苷含量帶來(lái)負(fù)面影響，推測(cè)可能是由于提高溫度也許會(huì)破壞苦瓜皂苷之間的糖苷鍵，影響產(chǎn)率，而添加菌種過(guò)多也許會(huì)積累其他中間代謝產(chǎn)物，影響苦瓜保健酒中的皂苷含量。

圖5 各因素交互作用對(duì)皂苷含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of each factors on saponins content

2.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

通過(guò)軟件對(duì)所建立的模型進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)釀造苦瓜保健果酒的最優(yōu)工藝條件為混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，發(fā)酵時(shí)間為10 d，菌種添加量6.06 mL/L，發(fā)酵溫度為26.18 ℃。此條件下釀得的果酒皂苷含量可高達(dá)2.81%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，在蘋(píng)果菠蘿混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，發(fā)酵時(shí)間為10 d，菌種添加量6 mL/L，發(fā)酵溫度為26 ℃的條件下進(jìn)行5次平行性試驗(yàn)，所測(cè)得的皂苷含量平均值為2.78%，與理論預(yù)測(cè)值相差極小，說(shuō)明試驗(yàn)中的回歸方程適合于苦瓜保健酒釀造工藝的預(yù)測(cè)與分析。

2.5 苦瓜保健酒的抗氧化活性研究

2.5.1 產(chǎn)品清除羥自由基的能力

通過(guò)對(duì)苦瓜保健酒和VC進(jìn)行不同程度的稀釋，測(cè)定其羥自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著苦瓜皂苷質(zhì)量濃度的增加，對(duì)·OH清除能力也隨增強(qiáng)。雖然清除率略低于VC，但其增強(qiáng)趨勢(shì)與VC相似，對(duì)羥自由基的清除率與皂苷的質(zhì)量濃度成正相關(guān)，表明苦瓜保健酒對(duì)·OH有一定的清除能力。

圖6 苦瓜保健酒清除羥自由基能力Fig.6 Scavenging ability of Momordica charantia health wine on hydroxyl free radicals

2.5.2 產(chǎn)品還原Fe3+能力的測(cè)定

苦瓜保健酒和VC對(duì)Fe3+的還原能力結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，吸光度值逐漸升高，所表現(xiàn)的還原能力越強(qiáng)。在0.03～0.18 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，皂苷的吸光度值與質(zhì)量濃度成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.969 9，相關(guān)性極顯著。說(shuō)明苦瓜皂苷為良好的電子供應(yīng)者，可參與自由基反應(yīng)。但與VC相比，皂苷還原能力較弱。

圖7 苦瓜保健酒還原Fe3+能力Fig.7 Reduction capacity of Momordica charantia health wine on Fe3+

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，結(jié)果表明，苦瓜保健酒的最佳發(fā)酵工藝條件為混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1、發(fā)酵時(shí)間10 d、酵母添加量為1 mL/L、乳酸菌添加量6 mL/L、發(fā)酵溫度26 ℃，在此條件下成品果酒的顏色呈亮嫩綠色，酒體澄清，果香協(xié)調(diào)，香氣宜人，皂苷含量高達(dá)2.78%，酒精度為11.2%vol，感官評(píng)分達(dá)到90分。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，采用清除羥自由基和還原Fe3+的能力分析苦瓜保健酒的抗氧化活性，結(jié)果表明，苦瓜酒有一定的抗氧化活性，并且與皂苷質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。