刺楸樹皮中總皂苷的提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性

張曉紅，楊瑞琪，向 福，2 *，薛 松，彭 爽

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

刺楸（Kalopanax septemlobu）是五加科（Araliaceae）刺楸屬（Kalopanax）落葉、闊葉喬木，分布廣泛，主要生長(zhǎng)在中國(guó)的東北、華北、華中、華南和西南地區(qū)，以及國(guó)外的朝鮮、蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)和日本[1]。刺楸具有很高的藥用價(jià)值，其根莖皮和葉均可入藥，用于治療神經(jīng)痛、風(fēng)濕骨痛及跌打損傷等[2-3]?，F(xiàn)代研究表明，刺楸中的皂苷成分具有明顯的抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗類風(fēng)濕[6]、抗氧化[7]、抗糖尿病[8]等藥理活性。

皂苷分布在刺楸不同組織部位。BULGAKOV V P等[9]研究發(fā)現(xiàn)，刺楸不同組織中皂苷的含量從高到底依次為根、莖皮、綠葉、落葉和鋸末，而程?hào)|巖等[10]研究吉林集安刺楸發(fā)現(xiàn)，葉中的總皂苷含量較樹皮高，且有研究發(fā)現(xiàn)刺楸莖皮中分離出的化合物能抑制皮膚真菌[11]。

目前關(guān)于藥用植物中提取皂苷的方法主要有酶法提取[7]、微波提取[12]、超聲提取[13]、超臨界流體萃取[14]等新型方法，但這些方法在一定程度上存在設(shè)備投資較大、生產(chǎn)成本較高、安全性、生產(chǎn)條件較高等問(wèn)題[15]，因此實(shí)際生產(chǎn)中仍是主要利用乙醇溶液進(jìn)行滲漉、浸漬、回流等方法提取[16]。

鄂東大別山的野生刺楸資源十分豐富，當(dāng)?shù)鼐用窠?jīng)常將其莖皮熬成汁用于皮膚病防治。為了科學(xué)利用本地刺楸的莖皮資源，本實(shí)驗(yàn)擬以刺楸樹皮為材料，采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)探討其乙醇加熱回流法的最佳提取工藝條件，并通過(guò)抑菌圈法評(píng)價(jià)刺楸樹皮提取物的抑菌活性，從而為刺楸莖皮的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

刺楸樹皮：采自大別山國(guó)家森林公園；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、酵母菌：本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

高氯酸（分析純）：天津市鑫源化工有限公司；香蘭素、冰乙酸、葡萄糖、氯化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）（批號(hào)20161218）：上海金穗生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨6 g/L，NaCl 6 g/L，用2 mol/L的NaOH調(diào)pH值為7.2，蒸餾水定容至600 mL，于121 ℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：稱取100 g去皮土豆，切碎，加水500 mL，放入鍋中煮沸20 min，用4層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，丟棄濾渣，濾液補(bǔ)充水分至500 mL，加入10 g葡萄糖，于115 ℃滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary-100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；FA2104電子分析天平：上海精細(xì)天平有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；HYG-B全溫度搖瓶柜：大倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GPN型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品0.002 3 g于10 mL容量瓶中，用甲醇將其定容至刻度，搖晃均勻，得到對(duì)照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

稱取5 g刺楸樹皮粉末于500 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在60 ℃水浴鍋中加熱回流提取1.5 h，得到樣品溶液。

1.3.3 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]，以人參皂苷Re的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=5.012 1C+0.007 7，R2=0.999 1，表明人參皂苷Re取樣質(zhì)量濃度在0.023～0.207 mg/L范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。刺楸樹皮中總皂苷得率計(jì)算公式如下：

式中：Y為總皂苷得率，%；C為樣品中總皂苷質(zhì)量，mg；N為稀釋倍數(shù)；m為刺楸樹皮粉末的質(zhì)量，g。

1.3.4 總皂苷提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別稱取5 g刺楸樹皮粉末于500 mL圓底燒瓶中進(jìn)行加熱回流提取單因素試驗(yàn)，考察提取溫度（50℃、60℃、70℃、80 ℃、90 ℃）、提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）（g∶mL）對(duì)刺楸中總皂苷的得率的影響。

1.3.5 總皂苷提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素，找出對(duì)總皂苷得率影響最顯著的三個(gè)因素提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）為自變量，用-1、0、1編碼每一個(gè)變量的低、中、高試驗(yàn)水平，以總皂苷得率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 抑菌活性研究

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及酵母菌4種菌為指示菌，將活化后的細(xì)菌菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃的搖床中培養(yǎng)18 h，將活化后的酵母菌菌種接種至PDB培養(yǎng)基中后置于30 ℃的搖床中培養(yǎng)18 h。用移液槍分別移取200 μL濃度為10×106CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液于LB固體培養(yǎng)基中，移取200 μL濃度為10×106CFU/mL的酵母菌菌液于PDA培養(yǎng)基中，涂布棒涂抹均勻后用打孔器打孔，再用移液槍吸取100 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL總皂苷提取液于孔中，放恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總皂苷提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)總皂苷得率的影響

圖1 料液比對(duì)總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of total saponins

料液比對(duì)總皂苷得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)料液比在1∶5～1∶15（g∶mL）范圍內(nèi)時(shí)，刺楸樹皮中總皂苷的得率隨之升高，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)，此時(shí)總皂苷的得率達(dá)到最大，為3.12%，當(dāng)料液比繼續(xù)增加，總皂苷的得率則開始下降?？赡艿脑蚴请S著料液比的減小提取溶劑與物料的接觸更加充分，使得提取出的皂苷含量增加直到最大，繼續(xù)降低料液比皂苷含量不發(fā)生改變，但由于提取出其他雜質(zhì)類物質(zhì)，影響了皂苷含量的測(cè)定，使之變小[19]。因此，最適料液比為1∶15（g∶mL）。

2.1.2 提取溫度對(duì)總皂苷得率的影響

提取溫度對(duì)總皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)提取溫度從50 ℃升至60 ℃時(shí)樹皮總皂苷的得率呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)繼續(xù)升高溫度至70 ℃時(shí)，得率快速升高達(dá)到最大值為3.71%，繼續(xù)升高溫度時(shí)得率又開始下降。可能的原因是隨著溫度的不斷升高刺楸樹皮中皂苷苷鍵被高溫破壞后分解，所以呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)[20]。因此，最適提取溫度為70 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield total saponins

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of total saponins

提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著提取時(shí)間在1.0～3.0 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，總皂苷的得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間逐漸延長(zhǎng)時(shí)，刺楸中總皂苷的得率在逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，得率達(dá)到最大值為4.22%，繼續(xù)增加提取時(shí)間總皂苷得率反而逐漸降低，其原因可能是在提取液中，當(dāng)植物材料細(xì)胞內(nèi)外活性成分含量未達(dá)到平衡時(shí)，其得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡后，活性成分不再溶出[21]。而加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致皂苷成分的降解，破壞了皂苷的活性，使總皂苷得率降低[22]。因此，最適提取時(shí)間為1.5 h。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷得率的影響結(jié)果如圖4所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%范圍內(nèi)逐漸升高，總皂苷的得率先升高然后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%時(shí)，總皂苷得率逐漸升高然后達(dá)到最大值為3.49%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%時(shí)，總皂苷得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高又逐漸降低。可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)低時(shí)一些親水性物質(zhì)被提取出影響了皂苷的含量，乙醇體積分?jǐn)?shù)太大時(shí)易形成較大滲透壓[23-24]，導(dǎo)致皂苷溶解性差，從而使刺楸樹皮總皂苷的得率降低。因此，最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total saponins

2.2 總皂苷提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

選取單因素試驗(yàn)中對(duì)刺楸樹皮中總皂苷得率有顯著影響的3個(gè)因素：提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3），固定料液比為1∶15（g∶mL），以總皂苷得率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken法響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

通過(guò)Design Expert 8.06軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)回歸方程擬合，得到各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響的多元二次回歸方程為：Y=3.27-0.092X1-0.019X2-0.042X3-0.044X1X2-0.022X1X3-0.036X2X3-0.59X12-0.33X22-0.59X32

由表3可知，模型的P＜0.000 1，說(shuō)明回歸模型效果極顯著，而模型失擬項(xiàng)P=0.787 0＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型的擬合度好，擬合方程顯著。校正擬合度0.961 3與預(yù)測(cè)擬合度0.921 7基本一致，信噪比為17.868＞4，表明該模型可用于預(yù)測(cè)。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為3.83%，決定系數(shù)R2為98.31%，表明該模型的回歸方程有很強(qiáng)的線性關(guān)系。因此，該回歸方程可以很好地反映刺楸樹皮總皂苷得率與提取因素之間的真實(shí)關(guān)系，即可通過(guò)該方程確定最優(yōu)提取工藝條件。各因素對(duì)刺楸樹皮中總皂苷得率的影響大小為：提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，一次項(xiàng)X1、二次項(xiàng)X22對(duì)總皂苷得率有顯著影響（P＜0.05），X12、X32對(duì)總皂苷得率有極其顯著影響（P＜0.01），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

二元回歸多項(xiàng)式的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，提取時(shí)間與提取溫度的等高線相交成圓形，表明提取溫度與提取時(shí)間的交互作用不明顯，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取時(shí)間等高線相交的中心區(qū)域圖形據(jù)均程橢圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取時(shí)間的交互作用明顯。此外，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)這三個(gè)因素與總皂苷提取率的響應(yīng)面均構(gòu)成開口向下的凸面，表明在試驗(yàn)點(diǎn)連續(xù)區(qū)域內(nèi)存在最大值。用Design Expert 8.0.6軟件自動(dòng)求解總皂苷最佳提取工藝為提取溫度69.25 ℃、提取時(shí)間1.49 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)69.66%，總皂苷得率理論預(yù)測(cè)值為3.28%。

圖5 提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)總皂苷得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between extraction time,temperature and ethanol volume fraction on total saponins yield

2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

為方便實(shí)際操作，驗(yàn)證操作中修正最佳工藝條件預(yù)測(cè)值為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶15（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，實(shí)測(cè)總皂苷平均得率為（3.33±0.04）%，與理論預(yù)測(cè)值3.28%基本吻合一致，表明擬合的二元多項(xiàng)式模型對(duì)刺楸樹皮中總皂苷的乙醇加熱回流提取工藝具有指導(dǎo)和預(yù)測(cè)作用。

2.4 抑菌活性結(jié)果

抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，刺楸樹皮總皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈直徑大小分別為3.00 cm、3.02 cm、2.30 cm、1.20 cm，表明1.0 mg/mL的刺楸樹皮總皂苷對(duì)細(xì)菌及真菌均有一定的抑制作用，且相比革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用更強(qiáng)。同時(shí)由表可知，1.0 mg/mL的刺楸樹皮總皂苷提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用大于真菌。KIM D W等[11]發(fā)現(xiàn)，單糖鏈刺楸皂苷A和I（13）能有效抑制白色念珠菌（Candida albicans）KCTC 1940和新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）KCTC 7224這兩種真菌的生長(zhǎng)，LEE M W等[25]也發(fā)現(xiàn)，刺楸皂苷對(duì)犬小孢菌（Microsporum canis）、球孢子菌屬真菌（Coccidioidesimmitis）、須發(fā)癬菌（Trichophytonmentagrophytes）、新型隱球菌和白色念珠菌均具有抑制作用。因此，刺楸樹皮總皂苷提取物對(duì)真菌具有一定的抑制作用，且在相同質(zhì)量濃度下對(duì)細(xì)菌的抑制作用更強(qiáng)。

表4 刺楸樹皮總皂苷的抑菌作用Table 4 Antimicrobial effect of saponin from Kalopanax septemlobu bark

3 結(jié)論

選用乙醇回流法提取刺楸樹皮中總皂苷，基于單因素試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面分析軟件對(duì)刺楸樹皮中總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出的最佳提取條件為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶15（g∶mL）。在此優(yōu)化提取條件下，總皂苷提率為3.33%。所得的乙醇提取液抑菌實(shí)驗(yàn)得出，刺楸樹皮皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈分別為3.00 cm、3.02 cm、2.30 cm、1.20 cm，表明刺楸樹皮皂苷對(duì)以上四種菌均有抑制作用，且在此質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌的抑制效果較明顯，從而為刺楸莖皮的利用提供理論依據(jù)。