暴馬丁香葉乙醇提取物的體外抗氧化活性

馮馨慧，劉志明，王海英*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

暴馬丁香(Syringareticulatavar.amurensis)，又名暴馬子(東北)，木犀科(Oleaceae)丁香屬(Syringa)植物，葉片厚紙質(zhì)，寬卵形、卵形至橢圓狀卵形，產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧，是較好的綠化觀賞樹種[1]。暴馬丁香的樹皮、樹干及莖枝均可入藥[2]，其化學(xué)成分研究主要集中于枝干及樹皮部分[3]，其中暴馬丁香樹皮中紫丁香苷和橄欖苦苷含量較高，是具有多種藥理活性的天然藥用成分[4]，因此其全皮及內(nèi)皮水煎液對肺炎雙球菌和流感桿菌有中度抑菌作用[5]。此外，相比于其他種類的丁香[6,7]，暴馬丁香花揮發(fā)油中含有一定量的烯烴和烷烴化合物，其特有的宜人香味和藥用價值可能與這些成分的存在有關(guān)[8,9]。據(jù)報道，暴馬丁香葉中已分離出5個環(huán)烯醚萜苷類化合物[10,11]。由此可見，暴馬丁香各部位提取物有較優(yōu)良的藥用作用，如抑菌、抗氧化作用等[12-16]。抗氧化劑具有清除自由基的作用，對人體健康有益，廣泛應(yīng)用在食品、藥品領(lǐng)域[17,18]?？寡趸瘎┣宄杂苫椒ㄖ幸郧宄鼶PPH自由基最為常見[19]。本實驗對暴馬丁香葉乙醇提取物進行DPPH自由基清除能力和羥基自由基清除能力進行測定，評價了暴馬丁香葉乙醇提取物的抗氧化能力，為天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2017年7月采自東北林業(yè)大學(xué)校園，經(jīng)鑒定為木犀科丁香屬，暴馬丁香。暴馬丁香鮮葉放入烘箱，45℃烘干5 h，制成粉末(≤0.425 mm)，作為供試樣品，備用。

沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、抗壞血酸(Vc)、水楊酸、無水乙醇，均為分析純。甲醇，色譜純。

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 GC-MS測定

取樣品粉末10 g于圓底燒瓶中，第一次加入60 mL無水乙醇，超聲波處理15 min，抽濾，取濾渣加入20 mL無水乙醇，室溫靜置提取12 h，抽濾，取濾渣加入20 mL無水乙醇室溫靜置提取24 h，合并濾液，在T=40℃，P=-0.1 MPa，n=35 r/min，進行減壓蒸餾濃縮回收乙醇，制得暴馬丁香葉乙醇提取物。

將暴馬丁香葉乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀對試樣進行測定。色譜條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器；初始溫度40℃(保持2 min)，以10 ℃/min的升溫速率升到280℃(保持2 min)；進樣口溫度250℃；進樣量1.0 μL；不分流，氦氣載氣，流速1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI電離源，接口溫度280℃，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，掃描范圍為30～500 u。

1.3 抗氧化活性測定

1.3.1 樣品溶液的配制

稱取20 g樣品粉末于平底燒瓶中，加入100 mL體積濃度70%的乙醇，超聲波輔助提取，功率70 kHz，30℃，40 min。將提取液過濾，濾渣加入100 mL 70%乙醇繼續(xù)提取，重復(fù)兩次。將3次提取液合并，在T=50℃，P=-0.1 MPa，n=35 r/min條件下進行減壓蒸餾濃縮回收乙醇，得到暴馬丁香葉乙醇提取物浸膏。稱取1 g暴馬丁香葉乙醇提取物浸膏，加入100 mL無水乙醇充分溶解，得到10 mg/mL的樣品母液，用移液管準確移取體積為0.5、1、2、2.5、5、10 mL的母液，10 mL容量瓶定容，得到0.5、1、2、2.5、5、10 mg/mL的樣品溶液。抗壞血酸為陽性對照。

1.3.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，當向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對電子被配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以通過吸光度的變化進行定量分析[18,20-22]。Fenton反應(yīng)中，檢測樣品對羥基自由基的清除作用，過氧化氫和鐵離子混合產(chǎn)生羥基自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在 510 nm 波長處有最大吸收波長[23-24]。按照文獻的方法，稱取DPPH自由基0.02 g，加入無水乙醇，500 mL容量瓶定容，得到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液。

分別取2 mL不同濃度0.5、1、2、2.5、5、10 mg/mL的樣品溶液，加入2 mL DPPH自由基溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，于517 nm處，測吸光值(A1)，用無水乙醇替代樣品溶液測定吸光度(A0)，用無水乙醇替代DPPH自由基溶液測定吸光值(A2)。平行操作3次，樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式計算：

1.3.3 羥基自由基清除率測定

參考文獻[25]的方法，向試管中依次加入1 mmol/L FeSO4溶液1 mL、不同濃度樣液1 mL，1 mmol/L H2O21 mL，3 mmol/L水楊酸溶液2 m1混勻，室溫下放置30 min，于510 nm波長處測定吸光度(Ax)，用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度(A0)，用蒸餾水代替樣液測定吸光度(Ax0)。平行操作3次，取平均值。根據(jù)下式計算試樣對羥基自由基清除率：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS分析

利用超聲輔助溶劑提取法，以乙醇作為溶劑，提取得到的暴馬丁香葉乙醇提取物為深綠色透明液體，得率為0.1%。暴馬丁香葉乙醇提取物的總離子流色譜圖，如圖1所示。通過面積歸一化法計算出各組分的GC含量，共鑒定出12種化合物，暴馬丁香葉乙醇提取物的GC-MS分析，如表2所示。

圖1 暴馬丁香葉乙醇提取物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of ethanol extracts from leaves of S. reticulata var. amurensis

從表1可知，暴馬丁香葉乙醇提取物主要由烷烴類、酯類、醇類、芳香族化合物等組成，GC含量較高的化合物為十一烷(12.38%)、對二甲苯(6.58%)、乙苯(3.72%)、4-O-甲基-d-阿拉伯糖(2.22%)、乙酸丁酯(0.55%)、柏木醇(0.07 %)等，其中十一烷、4-O-甲基-d-阿拉伯糖、乙酸丁酯、柏木醇的質(zhì)譜圖，分別如圖2～圖5所示。暴馬丁香葉乙醇提取物的抗氧化活性組分可能為4-O-甲基-d-阿拉伯糖、乙酸丁酯、柏木醇及其他抗氧化活性組分，有待進一步研究。

表1 暴馬丁香葉乙醇提取物的GC-MS分析

圖2 十一烷的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrogram of Undecane

圖3 4-O-甲基-d-阿拉伯糖的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrogram of 4-O-Methyl-d-arabinose

圖4 乙酸丁酯的質(zhì)譜圖Fig. 4 Mass spectrogram of Acetic acid butyl ester

圖5 柏木醇的質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectrogram of Cedrol

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除率分析

圖6為樣品的DPPH自由基(DPPH·)清除率。由該圖可以看出，暴馬丁香葉乙醇提取物對DPPH自由基的清除有較好的作用，且隨濃度升高效果增強呈對數(shù)增長趨勢，暴馬丁香葉乙醇提取物濃度較低時，其DPPH自由基清除率隨濃度變化較明顯，隨著濃度增大，當濃度升高到一定程度時，清除率增長趨勢漸平緩但仍在升高。在本實驗條件下，抗壞血酸清除50% DPPH自由基的濃度(IC50)值為0.001 mg/mL，清除50% DPPH自由基的暴馬丁香葉乙醇提取物濃度(IC50)值為0.014 mg/mL。在提取物濃度0.5～10 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率最高達94.9%(10 mg/mL)，擬合回歸方程y = 3.9042(x) + 86.775(R2=0.9483)，但與抗壞血酸比較，清除力不及抗壞血酸效果明顯。要達到較好的抑制效果，提取物所需濃度較大。

圖6 樣品的DPPH·清除率Fig. 6 DPPH· scavenging rate of samples

2.2.2 羥基自由基清除率分析

圖7為樣品的羥基自由基(·OH)清除率。由圖7可看出，暴馬丁香葉乙醇提取物對羥基自由基的清除率隨濃度提高而升高呈對數(shù)增長模型。在本實驗條件下，抗壞血酸清除50%羥基自由基時的濃度(IC50)值為7.082 mg/mL，清除50%羥基自由基的暴馬丁香葉乙醇提取物濃度(IC50)值為4.171 mg/mL，本實驗條件下，暴馬丁香葉乙醇提取物對羥基自由基的半數(shù)抑制濃度低于抗壞血酸。質(zhì)量濃度在0.5～10 mg/mL范圍內(nèi)，清除率最高達72.15%，在濃度較小時，暴馬丁香葉乙醇提取物對羥基自由基清除率不高，擬合線性方程為y=20.871(x)+20.441(R2=0.9767)，在本實驗濃度條件下暴馬丁香葉乙醇提取物總體清除效果優(yōu)于抗壞血酸，在提取物高濃度時，抗氧化效果較明顯。

圖7 樣品的羥基自由基清除率Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging rate of samples

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取，以乙醇為溶劑，提取暴馬丁香葉中有效成分。GC-MS分析結(jié)果表明，暴馬丁香葉乙醇提取物主要由烷烴類、酯類、醇類、芳香族化合物等組成，GC含量較高的化合物為十一烷(12.38%)、對二甲苯(6.58%)、乙苯(3.72%)、4-O-甲基-d-阿拉伯糖(2.22%)、乙酸丁酯(0.55%)、柏木醇(0.07%)等。暴馬丁香葉乙醇提取物的抗氧化活性實驗研究結(jié)果表明，清除50% DPPH自由基的暴馬丁香乙醇提取物濃度(IC50)值為0.014 mg/mL，遠高于抗壞血酸；而清除50%羥基自由基的暴馬丁香葉乙醇提取物濃度(IC50)值為4.171 mg/mL則低于抗壞血酸。由此可見，暴馬丁香葉乙醇提取物對DPPH自由基的清除效果較差，但對羥基自由基的清除效果較好。暴馬丁香枝葉繁茂，其葉片數(shù)量較多，因此可作為原料提取有效成分，在天然抗氧化劑領(lǐng)域具有開發(fā)潛力。