裕民貝母種子形態(tài)休眠解除過程中的形態(tài)學(xué)研究

朱敏嘉，黃俊華*，楊文英，王厚強(qiáng)，帕孜來提古麗·塞買提，王嚴(yán)嚴(yán)

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林業(yè)研究所，新疆 烏魯術(shù)齊 830052)

裕民貝母(FritillariayuminensisX. Z. Duan)，隸屬于百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)多年生草本，是一種極富園林用途兼?zhèn)渌幱脙r(jià)值的早春藍(lán)紫色球根花卉資源。莖光滑直立；葉呈披針形，以輪生為主，僅基部葉對(duì)生；花呈傘狀倒鐘形，具湛藍(lán)及淺粉兩種花色；蜜腺窩向外凸起；花藥基著；柱頭不開裂；花柱上部具微毛；蒴果具翅[1]。喜陰耐濕，常出現(xiàn)在海拔2200-2800 m的高山地帶，如草地、曠野和礫石等自然環(huán)境中；分布于我國北疆塔城地區(qū)及中亞地區(qū)[2]。由于裕民貝母的觀賞及藥用價(jià)值備受關(guān)注，導(dǎo)致其被過度采挖、數(shù)量銳減，加之其多態(tài)性百分率低[3]，存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)，并且分布區(qū)狹窄，資源緊張，是亟待保護(hù)和研究利用的種質(zhì)資源。采集和研究裕民貝母種子可為野生撫育及人工栽培提供基礎(chǔ)材料，這對(duì)種質(zhì)保育、開發(fā)利用及引種馴化具深刻意義。

關(guān)于裕民貝母種子的研究較為貧乏，僅鄭秀菊[4]和段咸珍[5]指出該種子在5-10℃低溫條件下完成形態(tài)后熟需50 d，之后再經(jīng)過35-40 d生理后熟才能萌發(fā)。針對(duì)這一現(xiàn)象，擬以裕民貝母種子為研究對(duì)象，采取有效措施打破種子形態(tài)休眠，并從種子形態(tài)結(jié)構(gòu)和亞微結(jié)構(gòu)兩方面闡述種子解除形態(tài)休眠的響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步打破種子生理休眠提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以裕民貝母種子為供試材料，采集于2017年7月，地點(diǎn)位于新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)裕民縣江克斯鄉(xiāng)附近(45°56'-46°10' N，82°39'-82°67' E，海拔757-1080 m)。

1.2 儀器與設(shè)備

RTOP-268Y智能人工氣候箱(浙江托普公司)，SMZ-25體式顯微鏡(日本Nikon公司)，KB-250超聲波清洗器(德國Elma公司)，JFC-1600離子濺射儀(日本JEOL公司)，LEO-1430VP掃描電子顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子預(yù)處理

設(shè)置6個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段取GA3：30 mg/L(CK)、GA3：30 mg/L兩處理種子40粒，重復(fù)3次，浸種3 d后置于智能人工氣候箱中進(jìn)行5/10℃暗環(huán)境培養(yǎng)。

1.3.2 種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

每隔20 d取CK和GA3：30 mg/L兩處理種子各10粒，重復(fù)3次，用體式顯微鏡進(jìn)行解剖，觀察帶皮種子、去皮種子、胚乳及胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，拍照并計(jì)算胚率。公式如下：

(1)

1.3.3 種子亞微結(jié)構(gòu)的變化

每隔20 d取CK和GA3：30 mg/L兩處理帶皮種子、胚乳及胚各10粒，重復(fù)3次，用60%的丙酮溶液固定樣品24 h，待樣品自然干燥后，使用超聲波清洗器進(jìn)行清洗，再用導(dǎo)電膠固定于銅質(zhì)電鏡臺(tái)上，隨后使用離子濺射儀噴金鍍膜，最后轉(zhuǎn)入掃描電子顯微鏡下觀察氣孔器、種皮、胚乳及胚的亞微結(jié)構(gòu)，拍照并記錄各參數(shù)指標(biāo)。種子亞微結(jié)構(gòu)描述參考Barthlott[6]和Song等[7]；氣孔器密度，氣孔器指數(shù)測(cè)定參考Dilcher[8]和Wilkinson[9]。公式如下：

(2)

(3)

式中：D為氣孔器密度(個(gè)/mm2)；S為固定面積內(nèi)氣孔數(shù)量(個(gè))；M為固定面積；I為氣孔器指數(shù)(%)；E為固定面積內(nèi)表皮細(xì)胞數(shù)量(個(gè))。

1.4數(shù)據(jù)處理

SPSS 18.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Duncan方差分析檢驗(yàn)單因素(One-Way ANOVA)，Photoshop CS6軟件處理圖片，Microsoft Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)休眠解除過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

2.1.1 種子形態(tài)結(jié)構(gòu)

裕民貝母種子扁平且光滑，呈三角倒卵形或倒卵橢圓形，吸水腫脹后可觀察到種皮、胚乳及胚；棕褐色種翅干癟無彈性，具皺褶細(xì)紋；黃褐色種皮輕薄如紗，表面紋路同于種翅；弧形胚腔狹長且彎曲；種子尖端處存在小型種孔；經(jīng)測(cè)量胚長(1.13±0.07)mm，胚乳長(5.06±0.05)mm，胚率為(22.33±0.33)%(見圖1：A)。胚乳吸水后變?yōu)榘胪该鳡?，圓形微小的淀粉粒廣布其中(見圖1：B)；胚乳未吸水時(shí)硬如甲片，線形紋路清晰可見(見圖1：C)。點(diǎn)狀胚半透明，位于種孔和胚腔基部交匯處，停留在原胚階段，無分化明顯的子葉、胚芽、胚軸和胚根，子葉暫未分化出吸器、子葉聯(lián)結(jié)以及子葉鞘(見圖1：D)。

2.1.2 帶皮種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

圖2可見，裕民貝母帶皮種子吸水腫脹后，呈中間略鼓兩邊扁平狀態(tài)，乳白色胚尚未發(fā)育完全，處于點(diǎn)狀原胚階段，位于種孔端，體量很小，由于半透明狀胚乳面積較大，此時(shí)胚率僅為22.33%，弧形胚腔約與胚乳等長，種翅由種皮內(nèi)部萎焉細(xì)胞演化而來，并附著在胚乳周圍一圈。CK和GA3：30 mg/L的胚隨時(shí)間推移不斷生長發(fā)育，并逐漸充斥整個(gè)胚腔，胚率不斷增長。20-40 d胚率增長最快，CK的胚率由27.00%增至54.00%，而GA3：30 mg/L的胚率由36.33%升至62.67%；60 d時(shí)，GA3：30 mg/L的胚率已突破81.67%，CK的胚率則停留在70.00%。80 d時(shí)，CK的胚率緩慢增長為77.00%，GA3：30 mg/L的胚率穩(wěn)定在86.67%；100 d時(shí)，CK的胚率穩(wěn)定在79.33%，GA3：30 mg/L的胚率則高達(dá)87.67%，兩者胚率相差8.34%。綜上，裕民貝母種子發(fā)育不健全，存在形態(tài)休眠。CK處理80后胚率日漸恒定，說明裕民貝母種子形態(tài)休眠自然破除需80 d，但GA3：30 mg/L處理60 d后胚率高于80%并趨于穩(wěn)定，另外GA3：30 mg/L最終胚率高于CK，表明GA3：30 mg/L僅需60 d便可打破種子形態(tài)休眠，這意味著外源GA3能刺激胚細(xì)胞伸長從而提高胚率。整個(gè)過程種皮顏色有一定程度的加深，種翅吸水后彈性有些許增強(qiáng)但張力極小，后期少數(shù)種皮出現(xiàn)不同程度的龜裂情況，種皮龜裂部位大多數(shù)集中在種子略鼓的中部，另外始終不見胚根突破種孔，種子沒有任何發(fā)芽跡象。

2.1.3 去皮種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

裕民貝母種子未吸水時(shí)，種皮與胚乳很難被剝離，但是吸水后能很大程度的改善這種情況，反映出水分可以有效減輕種皮與胚乳的粘連程度，圖3顯示胚乳充分吸水后透明度變高。在種子破眠期間，兩處理去皮種子的胚乳清晰可見，還可以觀察到胚腔以及乳白色內(nèi)含物。胚腔是沒有任何細(xì)胞的空腔組織，位于胚乳中部，主要源于中部原始胚乳細(xì)胞的降解，為胚的生長發(fā)育提供場(chǎng)所。胚乳中主要可見的內(nèi)含物是淀粉粒，它們多以圓形微小顆粒散布于胚乳中，在胚成熟過程中為其提供營養(yǎng)物質(zhì)。隨處理時(shí)間延長，胚乳中的淀粉粒由胚腔向四周逐漸水解，且淀粉粒數(shù)量不斷減少，胚通過吸收胚腔中的降解物來維持生命活動(dòng)。此外，胚乳質(zhì)地不再堅(jiān)硬，變得柔軟光滑，但胚乳中的半纖維素組織依舊發(fā)達(dá)，細(xì)胞壁仍保持較高的機(jī)械強(qiáng)度，彎曲的滿胚無法借助反向作用力頂破珠孔端進(jìn)行萌發(fā)。

2.1.4 胚乳形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

圖4可見，人為分離胚乳和胚時(shí)，珠孔端有不同程度的開裂情況，形態(tài)破眠階段胚乳雖有弱化現(xiàn)象，但胚乳機(jī)械強(qiáng)度并未減少到胚根可直接突破珠孔，說明胚乳對(duì)胚具一定機(jī)械阻力。種子形態(tài)破眠時(shí)，由于胚乳吸收水分后變軟，胚乳與胚相比之前更易分離，水分蒸發(fā)后胚乳表面的線形紋路更加清晰，胚乳也因失水和內(nèi)含物減少慢慢呈干癟狀，因此胚乳對(duì)胚的機(jī)械阻礙越來越弱，可見胚完成形態(tài)休眠所需的營養(yǎng)主要由胚乳提供，在這個(gè)過程中胚乳將自身貯存的大分子內(nèi)含物水解成小分子化合物供胚吸收。

圖1 裕民貝母種子形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Morphological structure of seeds in F. yuminensisA-帶皮種子；B-去皮種子；C-胚乳；D-胚。A-Seeds with coat; B-Seeds without coat; C-Endosperm; D-Embryo.注：Sw-種翅；Sc-種皮；En-胚乳；Ec-胚腔；Em-胚；Mi-種孔；Sg-淀粉粒；Co-子葉；Ge-胚芽；Hy-胚軸；Ra-胚根；Ha-吸器；Cc-子葉聯(lián)結(jié)；Ls-子葉鞘。Note: Sw-Seed wing; Sc-Seed coat; En-Endosperm; Ec-Embryo cavity; Em-Embryo; Mi-Micropyle; Sg-Starch granule; Co-Cotyledons; Ge-Germ; Hy-Hypocotyl; Ra-Radicle; Ha-Haustoria; Cc-Cotyledon coupling; Ls-Leaf sheath.

圖2 裕民貝母帶皮種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 2 Morphological structure changes of seeds with seed coat in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖3 裕民貝母去皮種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 3 Morphological structure changes of seeds without seed coat in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

2.1.5 胚形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

圖5可見，0 d時(shí)，兩處理的點(diǎn)狀原胚均未觀測(cè)到分化明顯的子葉、胚芽、胚軸以及胚根。20 d時(shí)，兩處理的胚均有一定的生長，形狀類似魚雷，GA3：30 mg/L的胚稍長于CK。40 d時(shí)，兩處理胚的頂端有所膨大，CK的胚呈棒狀，而GA3：30 mg/L的胚出現(xiàn)折角，形似鐮刀，顯然此時(shí)胚已分化出子葉，子葉分為遠(yuǎn)基和近基兩部分，遠(yuǎn)基處將來會(huì)形成吸器，近基處將來會(huì)形成子葉鞘，兩者中間部位則會(huì)形成子葉聯(lián)結(jié)。60 d時(shí)，兩處理胚的頂端保持膨大且透明的狀態(tài)，呈扁舌狀，膨大部分為吸器，吸器透過胚腔吸收胚乳水解的內(nèi)含物來維持種胚正常生長；GA3：30 mg/L的胚不僅變長變粗，并且彎折角度變大，胚開始變綠，表明此處為子葉聯(lián)結(jié)，子葉聯(lián)結(jié)具有縱向生長能力，是胚根突破種孔的主要力量。80 d時(shí)，兩處理的胚保持緩慢速度縱向生長，彎折程度進(jìn)一步加深，CK的胚開始泛綠，GA3：30 mg/L處理下胚的綠色部分有所加深和延長。100 d時(shí)，兩處理胚的長度變化較小，彎折有所平展；透明吸器有些萎焉，作為胚的營養(yǎng)儲(chǔ)備物，即使將來胚乳消失，吸器依舊可以保證胚的正常發(fā)育，最終從種皮處脫落；子葉聯(lián)結(jié)部分變長且顏色加重，已具備同化功能，此后在胚腔內(nèi)產(chǎn)生的反向作用力，有利于短縮的胚芽、胚軸和胚根一起突破種皮而萌發(fā)；短縮狀態(tài)的胚芽、胚軸以及胚根始終很難被分辨出來，胚芽上端具保護(hù)功效的子葉鞘分化不明顯，胚軸作為胚前期生長的主要方式將會(huì)進(jìn)行向地性生長，胚根則會(huì)在種子萌動(dòng)期間率先突破種孔端。種子雖然未萌發(fā)，但是胚形態(tài)已趨于成熟，且胚率穩(wěn)定，標(biāo)志著種子形態(tài)休眠基本解除。

圖4 裕民貝母胚乳形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 4 Morphological structure changes of endosperm in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖5 裕民貝母胚形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 5 Morphological structure changes of embryo in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

2.2 種子形態(tài)休眠解除過程中亞微結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1 種子亞微結(jié)構(gòu)

圖6A所示，裕民貝母氣孔器隨機(jī)分布于種翅邊緣，呈寬卵圓形或長橢圓形，被4-6個(gè)表皮細(xì)胞包圍，位置略微低于表皮細(xì)胞的平面，內(nèi)部的細(xì)胞壁厚實(shí)，外部的細(xì)胞壁扁薄，由兩個(gè)腎形保衛(wèi)細(xì)胞組成，內(nèi)含少數(shù)排列整齊的葉綠體，無副衛(wèi)細(xì)胞，氣孔器處于開放狀態(tài)，屬于無規(guī)則型氣孔器，長度為(68.89±1.44)μm，寬度為(56.72±0.28)μm，密度為(0.67±0.33)個(gè)/mm2，指數(shù)為(0.68±0.34)%。圖6B所示，裕民貝母種皮表面紋飾為網(wǎng)紋型，表皮細(xì)胞為不規(guī)則形并且排列無序，長度為(171.05±22.34)μm，寬度為(60.30±6.77)μm，密度為(100.33±4.62)個(gè)/mm2，垂周壁樣式為深波形(波狀深度/表皮細(xì)胞寬度≥ 1/4)。圖6C所示，裕民貝母胚乳表面紋飾為條紋型，表皮細(xì)胞為長矩形或近四邊形并且排列有序，長度為(188.70±10.59)μm，寬度為(62.16±6.75)μm，密度為(107.33±5.61)個(gè)/mm2。圖6D所示，裕民貝母胚頂部表面紋飾為網(wǎng)紋型，表皮細(xì)胞為長矩形或多邊形并且排列緊致，長度為(48.06±3.63)μm，寬度為(30.39±0.08)μm，密度為(388.33±4.70)個(gè)/mm2。圖6E所示，裕民貝母胚中部表面紋飾為條紋型，表皮細(xì)胞為長矩形并且排列整齊，長度為(63.54±6.00)μm，寬度為(18.62±0.99)μm，密度為(762.33±10.99)個(gè)/mm2。圖6F所示，裕民貝母胚基部表面紋飾為網(wǎng)紋型，表皮細(xì)胞為長矩形或多邊形并且排列緊密，長度為(46.68±2.93)μm，寬度為(26.36±0.64)μm，密度為(437.33±15.03)個(gè)/mm2。

2.2.2 氣孔器亞微結(jié)構(gòu)的變化

觀察圖7，發(fā)現(xiàn)裕民貝母位于種翅邊緣的氣孔器呈寬卵圓形或長橢圓形，由兩個(gè)凹陷的腎形保衛(wèi)細(xì)胞組成。隨時(shí)間推移，腎形保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)部的葉綠體數(shù)量顯著增加，CK處理80 d時(shí)葉綠體幾乎遍布整個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞，而GA3：30 mg/L處理僅需60 d，意味著外源GA3可以促進(jìn)氣孔器發(fā)育成熟。裕民貝母種子形態(tài)破眠各階段，兩處理氣孔器的著生位置未發(fā)生改變，并且氣孔器始終處于開放狀態(tài)，這有利于種子的呼吸作用。內(nèi)側(cè)細(xì)胞壁較厚，可以盡量減少氣孔器在開閉過程中遭受外界傷害。外側(cè)細(xì)胞壁較薄，能夠有效連接氣孔器和種皮的表皮細(xì)胞。不同時(shí)期的氣孔器大小尺寸略微不同，是否存在差異需根據(jù)氣孔器長度、寬度、密度以及指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定。

圖6 裕民貝母種子亞微結(jié)構(gòu)Fig. 6 Submicrostructure of seeds in F. yuminensisA-氣孔器；B-種皮；C-胚乳；D-胚頂部；E-胚中部；F-胚基部。Note: A-Stoma; B-Seed coat; C-Endosperm; D-Top embryo; E-Middle embryo; F-Basic embryo.注： Sc-種皮；St-氣孔器；Ch-葉綠體；Cw-細(xì)胞壁；Gc-保衛(wèi)細(xì)胞。Note: Sc-Seed coat; St-Stoma; Ch-Chloroplast; Cw-Cell wall; Gc-Guard cell.

圖7 裕民貝母種皮中氣孔器亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 7 Submicrostructure changes of stoma in F. yuminensis seed coat注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

2.2.3 表皮細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的變化

兩處理種皮的不規(guī)則表皮細(xì)胞變化不明顯并且無破損，呈龍骨狀，光滑且無附屬物，網(wǎng)脊明顯，另外網(wǎng)眼突出，并且細(xì)胞界限清晰，深波形的表皮細(xì)胞垂周壁相互交錯(cuò)呈網(wǎng)狀(見圖8)。胚乳的條紋狀表面紋飾有顯著變化，由于淀粉粒吸水期間會(huì)腫脹并且水解期間會(huì)干癟，導(dǎo)致胚乳表皮細(xì)胞所受的支撐力不足而發(fā)生破裂現(xiàn)象，因此胚乳表皮細(xì)胞數(shù)目銳減，GA3：30 mg/L胚乳表皮細(xì)胞破損程度比CK更為嚴(yán)重，說明外源GA3可以加速淀粉粒的水解(見圖9)。兩處理的胚頂部和胚基部均呈半橢圓形，而胚中部則呈長方形；胚表皮細(xì)胞具三種形態(tài)，其中頂部和基部多為四邊形或多邊形，中部為長矩形；胚表皮細(xì)胞光滑且界限明顯，呈凹陷或凸出兩種狀態(tài)，凹陷細(xì)胞的網(wǎng)眼下陷且網(wǎng)脊凸出，凸出細(xì)胞的網(wǎng)眼稍鼓并且網(wǎng)脊平滑又或者是網(wǎng)眼和網(wǎng)脊均急劇皺縮呈線狀(見圖10、11、12)。綜上，裕民貝母種子解除形態(tài)休眠過程中，種皮和胚的表皮細(xì)胞變化不明顯，僅胚乳表皮細(xì)胞變化明顯。

2.3 種子形態(tài)休眠解除過程中亞微結(jié)構(gòu)的方差分析

2.3.1氣孔器亞微結(jié)構(gòu)的方差分析

表1數(shù)據(jù)顯示，在種胚生長過程中，氣孔器密度以及氣孔器指數(shù)均沒有顯著變化，僅氣孔器長度、寬度以及葉綠體數(shù)量存在顯著差異；其中氣孔器長度、寬度變化無規(guī)律，氣孔器多呈寬卵圓形或長橢圓形；而葉綠體數(shù)量隨時(shí)間變化規(guī)律性遞增，CK處理0-20 d與40-60 d、80-100 d存在顯著差異，GA3：30 mg/L處理0-20 d與40 d、60-100 d存在顯著差異。另外，GA3：30 mg/L處理60 d、CK處理80 d后葉綠體數(shù)量基本穩(wěn)定，關(guān)于葉綠體在種子休眠中的作用尚不清楚。

2.3.2 表皮細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的方差分析

表2數(shù)據(jù)顯示，裕民貝母種子解除形態(tài)休眠過程中，種皮和胚各部位的表皮細(xì)胞在長度和寬度上均無差異，雖然密度存在些許差異，但是這種差異并無規(guī)律可尋。胚發(fā)育過程中，胚乳表皮細(xì)胞寬度無差異；胚乳表皮細(xì)胞長度略有不同，主要是0 d和80 d的CK處理與其他時(shí)間段存在顯著性差異；胚乳表皮細(xì)胞密度顯著降低，種子經(jīng)CK處理80 d或GA3：30 mg/L處理60 d后，胚乳表皮細(xì)胞數(shù)量約減少一半。

圖8 裕民貝母種皮亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 8 Submicrostructure changes of seed coat in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖9 胚乳亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 9 Submicrostructure changes of endosperm in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖10 胚頂部亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 10 Submicrostructure changes of top embryo in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖11 胚中部亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 11 Submicrostructure changes of middle embryo in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

圖12 胚基部亞微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 12 Submicrostructure changes of basic embryo in F. yuminensis注：A-CK；B-GA3 30 mg/L。Note: A-CK; B-GA3 30 mg/L.

處理 Treatment指標(biāo) Index0 d20 d40 d60 d80 d100 dCK長度 Length (μm)68.89±1.44 a48.14±1.27 c65.02±1.21 ab71.66±3.99 a60.59±1.92 b52.01±1.94 c寬度 Width (μm)56.72±0.28 ab51.18±1.21 c53.40±1.68 bc53.95±0.83 bc55.06±1.00 b59.48±1.21 a密度 Density (個(gè)/mm2)0.67±0.33 a1.00±0.58 a0.67±0.33 a0.67±0.67 a1.00±0.58 a0.67±0.33 a指數(shù) Index (%)0.68±0.34 a1.06±0.69 a0.64±0.32 a0.68±0.68 a0.90±0.50 a0.51±0.26 a葉綠體 Chloroplast (個(gè))21.00±0.58 c22.33±1.20 c64.33±2.33 b66.33±0.88 b87.33±1.20 a89.00±0.58 aGA3:30 mg/L長度 Length (μm)59.48±1.54 b53.12±1.27 c63.08±0.96 b60.59±1.27 b67.51±1.21 a61.14±1.21 b寬度 Width (μm)47.03±2.41 c50.08±1.00 c61.97±0.73 a58.93±0.96 a54.78±0.96 b59.48±0.55 a密度 Density (個(gè)/mm2)0.67±0.33 a0.67±0.33 a0.67±0.67 a0.67±0.33 a0.67±0.33 a0.67±0.33 a指數(shù) Index (%)0.60±0.30 a0.62±0.31 a0.67±0.67 a0.65±0.33 a0.58±0.29 a0.60±0.30 a葉綠體 Chloroplast (個(gè))20.33±2.19 c24.67±0.88 c70.33±1.20 b86.67±0.67 a88.00±1.00 a90.33±1.86 a

注：每行標(biāo)以不同小寫字母代表5%水平差異顯著。

Note: Each line with different lowercase letters represents significant difference at 5% level.

表2 裕民貝母表皮細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的方差分析

續(xù)表2

部位 Part時(shí)間 Time長度 Length (μm)CKGA3:30 mg/L寬度 Width (μm)CKGA3:30 mg/L密度 Density (個(gè)/mm2)CKGA3:30 mg/L胚中部Middle embryo0 d63.54±6.00 a53.40±2.00 a18.62±0.99 a19.90±1.55 a762.33±10.99 b816.00±17.04 ab20 d71.15±3.18 a65.58±2.74 a21.13±0.71 a18.39±1.01 a745.67±10.48 b800.67±6.69 ab40 d61.25±4.57 a55.20±2.37 a19.07±1.65 a19.71±1.09 a790.33±9.91 a834.67±8.88 a60 d69.52±2.15 a66.00±5.37 a21.22±0.67 a18.49±0.89 a739.00±8.50 b798.00±20.78 ab80 d64.23±3.35 a64.44±3.05 a22.53±3.01 a19.14±1.61 a745.33±5.04 b770.00±18.72 b100 d70.96±5.76 a65.42±6.11 a18.54±0.75 a18.60±1.04 a793.00±4.36 a815.67±10.41 ab胚基部Basic embryo0 d46.68±2.93 a59.94±1.40 a26.36±0.64 a23.47±1.99 a437.33±15.03 ab444.33±11.32 ab20 d49.24±1.52 a55.21±1.40 a24.73±1.01 a26.93±0.75 a440.33±10.27 ab417.00±3.46 b40 d51.05±1.61 a64.48±1.88 a26.03±2.28 a25.92±1.82 a442.33±12.77 ab442.00±8.08 ab60 d48.93±3.23 a55.21±1.47 a25.33±1.51 a25.07±2.26 a464.33±11.05 a431.33±11.46 ab80 d52.08±2.32 a58.96±6.56 a25.18±1.43 a23.67±0.85 a471.67±9.21 a444.67±4.67 ab100 d54.58±2.11 a65.34±2.80 a29.10±1.64 a27.82±1.45 a419.67±7.62 b449.33±10.41 a

注：每列標(biāo)以不同小寫字母代表5%水平差異顯著。

Note: Each column with different lowercase letters represents significant difference at 5% level.

3 討論

3.1種子形態(tài)結(jié)構(gòu)與種子形態(tài)休眠的關(guān)系

裕民貝母種子由黃褐色種皮、透明狀胚乳及點(diǎn)狀原胚組成，胚率僅為22.33%，種子存在形態(tài)休眠。種皮是保護(hù)胚的第一道生物屏障[10]，并能限制種子的最終大小[11]。裕民貝母種皮輕薄且無機(jī)械束縛，與胚乳結(jié)合緊密，不易剝離。Beeckman等[12]認(rèn)為植物成熟種皮會(huì)經(jīng)過珠被細(xì)胞分化、營養(yǎng)積累和色素沉淀等階段，例如單子葉植物羊草[13]在種子成熟過程中種皮從淺綠色過渡為黃色最終呈現(xiàn)棕黑色。本試驗(yàn)結(jié)果顯示裕民貝母黃褐色種皮隨處理時(shí)間增長顏色加深至紅褐色，可知種子剛采收時(shí)種皮未完全成熟，此后種子才逐漸發(fā)育完善。胚乳是多數(shù)單子葉植物種子的重要短命結(jié)構(gòu)[14]，內(nèi)含豐富的淀粉粒，淀粉粒經(jīng)水解成為可供幼胚吸收利用的簡單營養(yǎng)物質(zhì)。裕民貝母種子在形態(tài)破眠期間可觀察到淀粉粒數(shù)量減少，可見胚乳在胚生長發(fā)育過程中扮演著重要角色。Blumenthal等[15]認(rèn)為胚乳機(jī)械阻力是導(dǎo)致種子萌發(fā)受抑的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)裕民貝母胚乳細(xì)胞壁較厚，淀粉粒等內(nèi)含物排列緊密，導(dǎo)致胚乳組織異常堅(jiān)硬，胚根不易突破種皮進(jìn)行正常萌發(fā)，但隨處理時(shí)間的增加，胚乳械強(qiáng)度不斷減弱從而變得柔軟且干癟，這種弱化現(xiàn)象有利于幼苗突破種皮，所以胚乳機(jī)械強(qiáng)度不是導(dǎo)致種子休眠的物理因素。Otegui和Staehelin[16]認(rèn)為單子葉植物胚完善的標(biāo)志表現(xiàn)為子葉僅一枚有效，并且胚芽、胚軸和胚根容易被辨別。剛獲取的裕民貝母種胚結(jié)構(gòu)不完善，分化程度極低，這與其生長環(huán)境寒冷、生命周期短暫有關(guān)，因?yàn)榉N子沒有足夠的時(shí)間供胚生長發(fā)育[17]，因此胚發(fā)育不全是誘發(fā)種子形態(tài)休眠的關(guān)鍵因子。裕民貝母胚最終解除形態(tài)休眠時(shí)，僅分化出明顯的子葉結(jié)構(gòu)，后期還能觀察到吸器和子葉聯(lián)結(jié)，但無法從形態(tài)上區(qū)別胚芽、胚軸和胚根。裕民貝母種子整個(gè)形態(tài)破眠過程中，胚主要通過吸器汲取胚腔中的降解物進(jìn)行生長，CK需80 d才能觀察到胚基本充斥整個(gè)胚腔，胚率逐漸穩(wěn)定，子葉聯(lián)結(jié)泛綠，而GA3：30 mg/L僅需60 d，此外GA3：30 mg/L最終胚率高于CK，體現(xiàn)了外源GA3能誘導(dǎo)胚體加速生長的特點(diǎn)。種子始終無萌發(fā)跡象，還存在生理休眠現(xiàn)象，這一特性與百合科植物黃精[18]相似。

3.2種子亞微結(jié)構(gòu)與種子形態(tài)休眠的關(guān)系

氣孔器是植物氣體交換、水分運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ?，?duì)碳水調(diào)控具重要意義，具氣孔器的植物對(duì)生境變化表現(xiàn)出更強(qiáng)適應(yīng)性[19]。裕民貝母生于灌木林下，由于光照不足導(dǎo)致光合作用減弱，為保證種子萌發(fā)前營養(yǎng)物質(zhì)充足，種皮進(jìn)化出數(shù)量少、結(jié)構(gòu)獨(dú)特、富含葉綠體的氣孔器，這些氣孔器隨機(jī)分布于種翅附近。本研究顯示裕民貝母種子剛采收時(shí)，種皮上的氣孔器結(jié)構(gòu)雖然完整，但是葉綠體含量較少，后期隨種子形態(tài)破眠葉綠體數(shù)量激增，這有利于種子光合作用積累更多的營養(yǎng)物質(zhì)，改善種子呼吸作用從而調(diào)節(jié)碳水平衡，減少種子蒸騰作用防止水分流失后種子失活。Stebbine和Khusk[20]指出進(jìn)化植物的氣孔器所含副衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量不超過兩個(gè)，本研究顯示裕民貝母氣孔器無副衛(wèi)細(xì)胞，這意味著該種是較進(jìn)化的植物。種皮表面紋飾與生活力、吸水性及萌發(fā)率密切相關(guān)[21]，小種子植物具復(fù)雜種皮紋飾是進(jìn)化的標(biāo)志[10]，復(fù)雜種皮紋飾利于種子吸收水分加快萌發(fā)進(jìn)程。裕民貝母種皮的表皮細(xì)胞較大，網(wǎng)脊明顯，網(wǎng)眼突出，且網(wǎng)底具精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，種皮表面紋飾屬于復(fù)雜型，進(jìn)一步證明該種是進(jìn)化植物。另外，Wilkinson[22]認(rèn)為深波狀垂周壁表皮細(xì)胞為進(jìn)化植物，而裕民貝母種皮則為此類型，再次證實(shí)該種非原始植物。進(jìn)化植物通常采取種子休眠策略來適應(yīng)環(huán)境變更[23]，因此推斷裕民貝母種子具休眠特性是為了積極響應(yīng)種子傳播擴(kuò)散和種群繁衍的重大使命。裕民貝母種子破除形態(tài)休眠時(shí)，種皮表面始終呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，兩處理的表皮細(xì)胞長度、寬度差異不顯著，此外GA3：30 mg/L的表皮細(xì)胞密度也無差異，但是CK的表皮細(xì)胞密度有所變化。胚乳細(xì)胞最先經(jīng)過平周分裂形成具保護(hù)作用的表皮細(xì)胞[24]，其后才逐漸分化出其它功能細(xì)胞，簡單的長矩形皮層細(xì)胞構(gòu)成了裕民貝母胚乳條紋狀表面紋飾。在種子形態(tài)休眠解除期間，胚乳內(nèi)外細(xì)胞受內(nèi)含物降解影響受力不均，導(dǎo)致胚乳表皮局部斷裂，因此胚乳表皮細(xì)胞數(shù)目嚴(yán)重銳減，兩處理的胚乳表皮細(xì)胞密度發(fā)生變化。裕民貝母胚中部的表皮細(xì)胞為長矩形，延伸至兩端時(shí)會(huì)慢慢過渡為四邊形或多邊形，網(wǎng)眼存在凹陷或凸出兩種狀態(tài)，不同狀態(tài)可能與吸水程度或生長趨勢(shì)有關(guān)，兩處理隨時(shí)間推移胚各部位的表皮細(xì)胞在尺寸方面差異不顯著，僅表皮細(xì)胞密度存在些許變化。CK處理80 d后葉綠體數(shù)量增至恒定，胚乳表皮細(xì)胞數(shù)量約減少一半，GA3：30 mg/L僅需60 d，反映出外源GA3可以刺激葉綠體生成并加速胚乳水解。

4結(jié)論

分析裕民貝母種子形態(tài)結(jié)構(gòu)及亞微結(jié)構(gòu)可知，種皮顏色加深、胚率恒定、子葉發(fā)綠、葉綠體數(shù)量恒定、胚乳表皮細(xì)胞數(shù)量約減少一半是判定種子形態(tài)休眠解除的重要依據(jù)。種子形態(tài)休眠自然解除需80 d，而GA3：30 mg/L可將時(shí)間縮短20 d，表明外源GA3能促進(jìn)種子的形態(tài)建成。種皮作為種子形態(tài)休眠破除的重要標(biāo)志，體現(xiàn)在色素沉著度以及氣孔器中葉綠體完善度兩方面。隨時(shí)間推移種皮變深，氣孔器中的葉綠體數(shù)量升至恒定，種皮日漸發(fā)育成熟。胚發(fā)育不全是誘發(fā)種子形態(tài)休眠的主要原因，表現(xiàn)在胚結(jié)構(gòu)不完整且分化程度低。隨種子形態(tài)休眠解除，胚變長加粗，胚率日趨穩(wěn)定，子葉分化出明顯的吸器和子葉聯(lián)結(jié)，胚芽、胚根以及胚軸呈短縮狀態(tài)。胚乳作為解除種子形態(tài)休眠的啟動(dòng)因子，通過水解相關(guān)內(nèi)含物為胚的生長提供營養(yǎng)。胚乳隨時(shí)間變化淀粉粒數(shù)量減少，機(jī)械強(qiáng)度減弱，表皮細(xì)胞數(shù)量銳減，表皮破損嚴(yán)重。