懸浮MDCK細胞源與雞胚源H9亞型 禽流感疫苗免疫效力比較研究

習碩，趙蕾，史愛華，章振華，李林，沈佳，崔麗娜，姜北宇，張建偉

(北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是嚴重危害家禽和野禽的一種烈性傳染性病原，根據(jù)其臨床致病性差異，將其分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[1]。其中，H9N2亞型低致病性禽流感病毒(LPAIV)感染禽類雖然引起的死亡率較低、臨床癥狀較輕，但仍然是威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的重要病原之一[2]。H9 AIV不僅廣泛存在于活禽市場，還可以感染人[3-4]。有報道表明，目前流行的H9 AIV可以作為基因供體，為多種流感病毒提供內部基因與其他亞型病毒重排，給新型流感病毒在人群中的大規(guī)模流行埋下了隱患[5]。通過疫苗免疫接種預防禽流感仍然是現(xiàn)今采用的主要手段。值得注意的是，近年來H9 AIV的變異現(xiàn)象時有發(fā)生，其中2011-2014年H9 VIA的變異速度是1999-2005年的10.64倍[6]。然而，AIV抗原大多利用非免疫雞胚制備，病毒在雞胚中的傳代是造成AIV基因變異的主要原因之一[7-8]；其次，禽流感流行需要大量疫苗時，有可能存在雞胚供應不足的問題；同時，制苗用雞胚的來源不明，也有造成外源病毒污染的可能[9]。與傳統(tǒng)雞胚制苗方法比較，動物懸浮細胞制備疫苗具有細胞來源和背景清晰，不含有外源病毒的優(yōu)點，病毒抗原穩(wěn)定，批間差異小，易于擴大和大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。許多學者比較了MDCK貼壁細胞制備的人流感疫苗與雞胚源疫苗的效果，認為兩種疫苗有著相當?shù)拿庖咝Ч鸞10-12]。為了探討和驗證由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所純懸浮馴化的MDCK細胞制備H9亞型AIV抗原疫苗免疫效力，進行了MDCK細胞源疫苗和雞胚源H9亞型AIV疫苗的比較試驗，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 MDCK懸浮細胞株(MDCK-sus)由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所免疫與預防研究室購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的MDCK貼壁細胞自行馴化獲得，懸浮細胞批號為20190520，代次為MDCK-sus F10。

1.1.2 病毒株 制苗毒株：H9亞型AIV BX13株由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預防研究室2013年從北京某雞場分離、純化及鑒定，毒株代號為A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)。制苗毒株為H9亞型AIV BX13株1-E3，批號：20170523，毒價為107.7EID50/0.1mL。攻毒毒株為H9亞型AIV BX13株1-E1，批號：20170411，毒價為108.7EID50/0.1mL。

1.1.3 雞胚 SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，在本研究室孵化至10日齡，用于毒種繁殖，毒價測定及攻毒后的分毒試驗。

1.1.4 試驗動物 21日齡SPF雞購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所SPF雞舍飼養(yǎng)。

1.1.5 HI抗原 HI工作抗原由本研究室制備，H9亞型AIV BX13株1-E3，批號：20170425，HA效價為29，使用時按照1∶128配制4HA工作抗原。

1.1.6 雞紅細胞懸液 1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備，用于收獲的病毒液HA和試驗雞的血清HI抗體測定。

1.1.7 主要試劑與耗材 無血清培養(yǎng)基MS01購自蘇州市沃美生物技術有限公司；250 mL三角瓶購自Corning公司。

1.1.8 儀器設備 細胞搖床購自上海一恒科技有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學儀器廠；血球計數(shù)板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司；2L生物反應器BioFlo?/CelliGen?115購自美國NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 分別制備雞胚源和MDCK純懸浮細胞源疫苗。雞胚源疫苗抗原制備方法為取10萬倍稀釋的AIV BX13制苗毒株，接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL, 密封針孔，置37 ℃孵育，每24 h照蛋，棄去24 h內死亡雞胚，收獲24 h～120 h內死胚和120 h時活胚的雞胚尿囊液，測定其HA和EID50，用作制備雞胚源疫苗抗原。

MDCK細胞源疫苗抗原制備方法為將2L生物反應器進行清洗、安裝、高壓滅菌后冷卻備用，取生長到一定密度的細胞，使用無血清MS01培養(yǎng)基制備成密度為2.0×106/mL ～2.5×106/mL的細胞懸液1L，以感染復數(shù)(MOI)0.01接種H9亞型禽流感病毒BX13株，同時按照3.5 μg/mL的終濃度加入TPCK-Trypsin，將以上細胞-病毒混合液加入到生物反應器中，設置生物反應器參數(shù)，溶氧DO為40%，pH 7.2，溫度33 ℃，攪拌速度60 r/min, 收獲培養(yǎng)72 h的抗原液，測定其HA和EID50，用作制備細胞源疫苗抗原。

疫苗制備方法為首先分別將2種抗原液加入終濃度為2 mL/L的甲醛溶液，置37 ℃恒溫搖床內滅活24 h。經(jīng)滅活檢驗合格后取上述2種滅活抗原液，分別制備雞胚源抗原水相和細胞源抗原水相，同時制備油相，以油相∶水相比為2∶1的比例乳化制成油包水型滅活疫苗，配苗時收獲抗原液的病毒滴度均為107.7EID50/0.1mL。

1.2.2 疫苗物理性狀檢驗 外觀：應為白色均勻乳劑。劑型：取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應不擴散。穩(wěn)定性：吸取疫苗10 mL加入離心管中，以3500 r/min離心15 min, 管底析出水相應不超過0.5 mL。粘度：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應符合規(guī)定。無菌檢驗：按現(xiàn)行《中國獸藥典》進行，應無菌生長。

1.2.3 免疫試驗分組與免疫接種 90只21日齡SPF雞隨機分為9組，A1～A4組每組10只雞，分別胸肌注射雞胚源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；B1～B4組每組10只，分別胸肌注射MDCK懸浮源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；C組5只雞，不免疫接種，用于攻毒對照；D組5只雞為健康對照。

1.2.4 試驗雞HI抗體檢測 各組雞均在免疫接種后7 d、14 d、21 d翅靜脈采血、分離血清，待檢測AIV HI抗體。

1.2.5 攻毒試驗 免疫后21 d采血后，A1～A4, B1～B4，C組雞分別翅靜脈注射100倍稀釋的AIV BX13攻毒毒株, 每只0.5 mL(病毒含量107.4EID50), D組5只雞不做任何處理，為健康對照。

1.2.6 分毒試驗 試驗雞攻毒后第3天，分別采集每只雞的咽拭子和泄殖腔拭子，置于裝有0.8mL生理鹽水(含青、鏈霉素雙抗1萬單位，pH 7.2)的eppendorf管中，渦旋振蕩混勻后，3000 r/min離心5 min, 取同一只雞的咽拭子和泄殖腔拭子上清液混合作為1個樣品，尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚。接種后定期照蛋，棄去24 h內死亡雞胚，收獲72～120 h死亡雞胚尿囊液，分別測定HA價，至120 h, 按照分組分別收獲活胚尿囊液，測定HA價。若同一只雞的樣品接種的5枚雞胚中有1枚雞胚的HA價≥4log2,該樣品判定為分毒陽性。若接種樣品的5枚雞胚均為陰性，取5枚雞胚尿囊液的混合液再接種5枚10齡SPF雞胚進行盲傳，最終確定樣品的分毒結果。

2 結果與分析

2.1 疫苗制備 參照《中國獸藥典》有關雞禽流感疫苗的檢驗方法，對2種疫苗的試驗室制品進行了物理性狀和無菌檢驗，結果見表1。

表1 AIV BX13株雞胚源疫苗與MDCK細胞源疫苗物理性狀和無菌檢驗Tab 1 Physical characters and sterility test of AIV BX13 strain of the two vaccines

2.2 血清HI抗體消長規(guī)律 不同源和劑量疫苗免疫后7 d、14 d、21 d各組雞的血清HI抗體，結果見表2。免疫前隨機抽取90只21日齡試驗雞中10只，測定其AIV HI抗體水平均為陰性。以不同免疫劑量的雞胚源疫苗和MDCK細胞源疫苗免疫21日齡SPF雞后7 d，AIV HI抗體水平為0log2；免后14 d和21 d, 兩種疫苗免疫雞的HI抗體滴度隨著免疫時間的增加而提高，同時也隨著免疫劑量的增加而提高，兩種疫苗免疫接種后21 d的 HI抗體也較免疫后7 d、14 d顯著提高。MDCK細胞源疫苗免疫組與雞胚源疫苗組均在免疫后21 d產(chǎn)生了更高水平的HI抗體。攻毒前攻毒對照組和健康對照組試驗雞HI 抗體均為陰性。

表2 禽流感BX13株不同源疫苗和劑量免疫后抗體消長規(guī)律Tab 2 Growth and decline of AIV BX13 HI titer after different source vaccines and doses of immunization

HI抗體單位log2

2.3 攻毒試驗結果 攻毒保護試驗結果見表3。攻毒試驗結果顯示，雞胚源疫苗和細胞源疫苗免疫接種后21 d，用與制苗株同源的H9亞型 AIV BX13株翅靜脈攻毒，雞胚源疫苗免疫雞的接種劑量為0.1 mL/只雞(107.2EID50/只)以上時，試驗雞的攻毒保護率達到100%；MDCK細胞源疫苗免疫雞的免疫劑量為0.2 mL/只雞(107.5EID50/只)以上時，試驗雞的攻毒保護率達到100%。攻毒對照雞均100%分毒陽性，健康對照雞分毒陰性。

表3 2種滅活疫苗不同免疫接種劑量的攻毒試驗結果Tab 3 The challenge results of the 2 vaccines with different immune doses

攻毒試驗結果：陽性數(shù)/攻毒數(shù)(健康對照除外))

2.4 抗體水平與分毒陽性率的關系 抗體水平與分毒率關系結果分別見表4和表5。雞胚源疫苗免疫后，3只AIV HI抗體為0log2～3log2的試驗雞均分毒陽性，5只AIV HI 抗體4log2～5log2的試驗雞均毒陰性， 7只AIV HI抗體為6的試驗雞1只分毒陽性，25只AIV HI 抗體為7log2～11log2的試驗雞，分毒陽性率為0，試驗雞均保護；MDCK細胞源疫苗免疫組，3只AIV HI抗體水平為0log2～3log2的試驗雞分毒陽性，9只AIV HI 抗體為4log2、5log2、6log2的試驗雞5只病毒分離陽性，12只AIV HI抗體為7log2的雞1只分毒陽性，16只AIV HI抗體水平為8log2～10log2的試驗雞均未分離到病毒，100%保護。

表4 雞胚源疫苗免疫后抗體水平與攻毒保護率的關系Tab 4 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after chicken embryo-derived vaccine immunization

表5 MDCK細胞源疫苗免疫后抗體水平與保護率的關系Tab 5 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after cell-derived vaccine immunization

3 討論與結論

本研究分別采用雞胚培養(yǎng)的方式和純懸浮培養(yǎng)MDCK細胞的方式制備了2種H9亞型AIV BX13株滅活疫苗，以不同劑量(0.02、0.1、0.2和0.3 mL/只)免疫接種21日齡SPF雞后兩種疫苗均能誘發(fā)雞只產(chǎn)生AIV HI抗體，免疫雞的AIV HI抗體水平均隨著免疫劑量的增加而提高。2種疫苗免疫后7 d均未檢測到AIV HI抗體，免疫后14 d最高免疫劑量組雞胚源疫苗免疫雞的AIV HI抗體滴度最高達到3.6log2，MDCK細胞源疫苗AIV HI抗體滴度最高達到4.6log2，細胞源疫苗組稍高。免疫后21 d，兩種疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平明顯高于免后14 d,結果說明免疫時間和AIV HI抗體水平呈正相關。當免疫劑量為0.1～0.3 mL/只時，雞胚源疫苗的抗體水平為7.0log2～8.8log2，細胞源疫苗的抗體水平為7.2log2～8.3log2。張建偉等[13]使用微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細胞制備禽流感病毒疫苗，證明MDCK細胞制備的禽流感病毒疫苗具有較好的免疫效果，使用不同劑量接種21日齡SPF雞，免后21 d HI抗體水平最高為5.6log2，如果以免疫后抗體水平評價免疫效果，與本研究對比，免疫劑量相同時，純懸浮細胞源疫苗免疫效果明顯高于貼壁培養(yǎng)的MDCK細胞源疫苗。

攻毒試驗結果顯示，本研究中相同免疫劑量時，雞胚源疫苗的保護效果高于純懸浮MDCK細胞制備的H9亞型AIV疫苗，雞胚源病毒液制備的疫苗以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫就可以達到100%保護；細胞源病毒液制備的疫苗抗原以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫保護率為80%，當免疫劑量達到0.2～0.3 mL/只(107.5EID50/只～107.7EID50/只)時，保護率達到100%，說明當免疫劑量為0.2 mL/只(107.5EID50/只)以上時，雞胚源疫苗和MDCK細胞源疫苗的攻毒保護率無顯著差異。免疫劑量相同時，雞胚源疫苗免疫效果高于細胞源疫苗的原因尚不清楚，筆者認為有以下幾種原因，病毒在MDCK細胞中傳代是否會導致病毒變異，抗原液中的MDCK細胞組分是否影響雞的免疫應答，是否存在試驗雞只的個體差異等都有待進一步試驗證實和深入研究。

鮮有學者針對使用懸浮MDCK細胞制備禽流感疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平與分毒陽性率的關系做過比較，本試驗分析了2種疫苗免疫試驗雞后21 d，HI抗體滴度與分毒陽性率之間的關系。當使用雞胚源疫苗免疫時，15只AIV HI抗體水平為0log2～6log2的試驗雞有4只分毒陽性，其中1只AIV HI為6log2也分毒陽性，因此不排除抗體水平為4log2～6log2雞只感染AIV后向環(huán)境排毒的風險，當AIV HI抗體水平為7log2～11log2時，所有免疫雞均未分離到病毒，說明使用雞胚源抗原制備H9亞型AIV BX13株疫苗免疫試驗雞，當HI抗體滴度達到7log2時，即可阻止雞只排毒。當使用MDCK細胞源疫苗免疫時，24只AIV HI抗體水平為0log2～7log2的試驗雞中9只分毒陽性，其中4只AIV HI抗體水平為6log2～7log2的試驗雞病毒分離陽性，說明細胞源疫苗的免疫效力可能稍低于雞胚源疫苗，是疫苗本身的原因還是試驗雞只的個體原因尚待進一步確認，當細胞源疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平達到8log2以上時，雞只停止向外排毒，說明該抗體水平可以有效抑制病毒的排放。綜上所述，抗體水平與排毒有明顯相關性，雞胚苗源疫苗的AIV HI抗體滴度達到7log2，細胞苗源疫苗的AIV HI達到8log2時均可抑制病毒排放，本研究由于統(tǒng)計數(shù)量較少，也由于雞只個體間存在差異，結論尚需更多數(shù)據(jù)驗證。

本研究顯示，如果用攻毒保護率評價疫苗的免疫效果，細胞苗與雞胚苗尚有差異，但差異不大，通過進一步篩選對AIV敏感的細胞株和改進培養(yǎng)工藝，或許可以獲得高產(chǎn)細胞株和高毒價的抗原，通過提高毒價獲得與雞胚苗一致的保護率的疫苗是可能的。

本研究的目的是找到一種能夠替代雞胚制備AIV疫苗抗原的方法，有學者研究發(fā)現(xiàn)，AIV在MDCK懸浮細胞上的增殖能力與MDCK貼壁細胞相當，可獲得較高的病毒滴度，但貼壁細胞增殖病毒工藝復雜，同一批次細胞瓶中的病毒滴度也存在差異[14]。因此，懸浮培養(yǎng)細胞增殖AIV成為了研究熱點。本研究采用純懸浮的MDCK細胞接種AIV制備抗原和疫苗，通過AIV HI抗體檢測和攻毒試驗證明純懸浮培養(yǎng)方式制備的AIV疫苗具有較好的免疫效果，使用該疫苗免疫SPF雞，0.1 mL/只以上的免疫劑量免疫SPF雞后21 d，抗體水平達到7.2log2～8.3log2, 0.2 mL/只的免疫劑量即可保護100%的雞不向外界排毒，證明懸浮培養(yǎng)MDCK細胞制備的禽流感疫苗免疫效力確實可靠。本研究的結果為后續(xù)繼續(xù)篩選對AIV增殖效率更高的MDCK細胞株和利用純懸浮培養(yǎng)MDCK細胞制備AIV疫苗抗原奠定了基礎。