響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取浮萍多糖工藝研究

于忠娜，王軍，劉桂伶，王玉梅，韓榮偉*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109)

浮萍(Common Duckweed Herb，Herba spirodelae)為浮萍科植物紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiz(L.)Schleid)或青萍(LemnaminorL.)的全草，其生長周期短、繁殖快、喜陰喜濕等，其干燥的全草可以做家畜的飼料，在我國四川、浙江、湖北等地區(qū)的動物養(yǎng)殖中廣泛分布并使用[1-3]。浮萍味辛，性寒，歸肺經(jīng)，有利尿消腫、發(fā)汗解表、止癢等功效。研究表明，浮萍中含有多糖、蛋白質(zhì)、樹脂、類脂、黃酮類化合物等多種物質(zhì)，浮萍多糖是浮萍中重要的生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)作用。而中獸藥具有價(jià)格低廉、藥物殘留少、不會產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而浮萍多糖在中獸藥中的應(yīng)用越來越受重視[4]。

國內(nèi)對浮萍多糖的提取純化方法研究較多，主要有堆熱法、超濾法等，但這些方法對設(shè)備要求較高，技術(shù)工藝繁瑣，費(fèi)用較高[5-6]。本研究利用超聲波的空化效應(yīng)增加溶劑的穿透力，輔助浮萍多糖的提取[7-8]，并通過Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波輔助提取浮萍多糖的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 浮萍干燥全草購于四川成都國際商貿(mào)城荷花池中藥材專業(yè)市場，批號：20150416；去離子水，葡萄糖，濃硫酸，苯酚，乙醇，所用試劑均為分析純，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備 FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；分樣篩，浙江上虞市肖金化驗(yàn)儀器廠；SB25-12DTD型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；302型電熱鼓風(fēng)干燥箱，中國山東龍口市先科儀器公司；TGL-16C高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；WFJ7200型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼科儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取方法 用高速萬能粉碎機(jī)將干燥浮萍全草粉碎，過60目分樣篩，備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g浮萍粉末，加入去離子水，靜置10 min，設(shè)定超聲功率、時(shí)間、溫度，進(jìn)行超聲波處理；超聲處理后的樣品8000 r/min離心10 min，收集上清液并抽濾，濾液中加95%乙醇(V∶V，1∶4)過夜后8000 r/min離心10 min得到沉淀；沉淀物放入60 ℃干燥箱中烘干得浮萍多糖粉末。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃烘干至恒重后，準(zhǔn)確稱取10.0 mg，加去離子水溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別加入具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加5%苯酚1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，蓋上塞，立刻搖勻，室溫靜置30 min后，以空白校正零點(diǎn)，用1 cm比色皿于490 nm處測定吸光度，平行3次并記錄吸光度值，作出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。多糖組分近似等于葡聚糖，故多糖回歸方程為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程系數(shù)乘以葡萄糖與葡聚糖間的轉(zhuǎn)換系數(shù)0.9[9]。

1.3.3 多糖提取率的測定與計(jì)算 準(zhǔn)確稱取1.0 g過分樣篩的干燥浮萍粉末，加入一定質(zhì)量的去離子水，靜置10 min，設(shè)置一定的超聲功率、超聲時(shí)間、溫度，進(jìn)行超聲波處理，將經(jīng)過超聲波處理完的樣品用臺式離心機(jī)8000 r/min離心10 min，收集上清液并抽濾。應(yīng)用苯酚-硫酸法測濾液中的多糖含量[10]，多糖提取率計(jì)算方法見公式(1)。

(1)

式中：R為多糖提取率；c為濾液中的多糖濃度；n為稀釋倍數(shù)；V為濾液總體積；m為浮萍原料質(zhì)量。

1.3.4 產(chǎn)品純度的測定與計(jì)算 精密稱取所得浮萍多糖粉末50.0 mg，加去離子水溶解并定容至250 mL。吸取上述溶液1.0 mL加入具塞試管(蒸餾水，做空白對照)，補(bǔ)水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入5.0 mL濃硫酸，蓋上塞，立刻搖勻，靜置30 min后，于490 nm處測定吸光度。再以多糖為對照，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得多糖含量，計(jì)算方法見公式(2)。

(2)

式中：C為樣品純度；m1為產(chǎn)品中的多糖質(zhì)量；m2為待測樣品質(zhì)量。

1.3.5 單因素試驗(yàn) 按照1.3.1浮萍多糖提取工藝流程，考察料液比、超聲波提取時(shí)間、超聲波功率、提取溫度以及提取次數(shù)等因素對浮萍多糖提取率的影響。具體操作如下：

(1)準(zhǔn)確稱取6份干燥浮萍粉末(1.0 g/份)，設(shè)定超聲波功率400 W、超聲波提取時(shí)間 80 min、超聲波提取溫度50 ℃，提取次數(shù)1次等條件下，考察1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70等不同料液比對浮萍多糖提取率的影響。

(2)準(zhǔn)確稱取6份干燥浮萍粉末(1.0 g/份)，設(shè)定料液比1∶50、超聲波功率400 W、超聲波提取溫度50 ℃、提取次數(shù)1次等條件下，考察20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min等不同提取時(shí)間對浮萍多糖提取率的影響。

(3)準(zhǔn)確稱取6份干燥浮萍粉末(1.0 g/份)，設(shè)定料液比1∶50、超聲波提取溫度50 ℃、超聲波提取時(shí)間 80 min、提取次數(shù)1次等條件下，考察250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W等不同超聲功率對浮萍多糖提取率的影響。

(4)準(zhǔn)確稱取6份干燥浮萍粉末(1.0 g/份)，設(shè)定料液比1∶50、超聲波功率400 W、超聲波提取時(shí)間 80 min、提取次數(shù)1次等條件下，考察20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃等不同提取溫度對浮萍多糖提取率的影響。

(5)準(zhǔn)確稱取4份干燥浮萍粉末(1.0 g/份)，設(shè)定料液比1∶50、超聲波功率400 W、超聲波提取時(shí)間 80 min、超聲波提取溫度50 ℃等條件下，考察1次、2次、3次、4次等不同提取次數(shù)對浮萍多糖提取率的影響。

1.3.6 工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0基于Box-Behnken中心組合的設(shè)計(jì)原理，料液比(A)、超聲時(shí)間(B)和超聲功率(C)為自變量(表1)，以浮萍多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)[11]，優(yōu)化浮萍多糖的提取工藝，實(shí)驗(yàn)方案見表2。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合如下模型：

Y=n0A2+n1B2+n2C2+n3AB+n4AC+n5BC+

n6A+n7B+n8C+n9

(3)

式中:Y為響應(yīng)值，A、B、C為自變量，n0～n9為系數(shù)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由測定結(jié)果計(jì)算出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=15.957x+0.00057，R2=0.99921。多糖組分近似等于葡聚糖，而葡萄糖與葡聚糖間的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.9，故上述方程可校正為：y=14.361x+0.00051，R2=0.99921。以多糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 The standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對浮萍多糖提取率的影響 不同料液比對多糖提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對浮萍多糖提取率的影響Fig 2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides duckweed

由圖2可知，料液比在1∶20～1∶50之間時(shí)，浮萍多糖的提取率隨料液比的增大而提高，在料液比為1∶50時(shí)達(dá)到最大，之后隨料液比的增大而降低。這是因?yàn)殡S著溶劑量的增大，超聲波需要處理的液體增多，使多糖的分離效率降低，多糖的損失率增加[13]，故本試驗(yàn)選擇料液比因素水平為1∶40、1∶50和1∶60。

2.2.2 超聲波提取時(shí)間對浮萍多糖提取率的影響不同超聲波提取時(shí)間對多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲波提取時(shí)間多浮萍多糖提取率的影響Fig 3 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides duckweed

由圖3可知，在超聲波提取時(shí)間試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，浮萍多糖的提取率隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在超聲波提取時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)檫^長時(shí)間的超聲波處理會引起熱量積聚或機(jī)械剪切作用而破壞多糖的結(jié)構(gòu)；同時(shí)，提取時(shí)間的增加也會導(dǎo)致能耗增加[14]，因此本試驗(yàn)選擇的超聲提取時(shí)間因素水平為40 min、60 min和80 min。

2.2.3 超聲波功率對浮萍多糖提取率的影響 不同超聲波功率對浮萍多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。可見，在超聲波功率試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，浮萍多糖的提取率隨著超聲波功率的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在超聲波功率為350 W時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)槌暡üβ蔬^低，細(xì)胞破碎效能不足，而功率過大導(dǎo)致浮萍多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞或者使其降解[15]，所以本試驗(yàn)中的超聲波功率因素水平定為300 W、350 W和400 W。

2.2.4 超聲波提取溫度對浮萍多糖提取率的影響不同提取溫度對多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖4 超聲波功率對浮萍多糖提取率的影響Fig 4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides duckweed

圖5 超聲波提取溫度對浮萍多糖提取率的影響Fig 5 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides duckweed

由圖5可知，在超聲波提取溫度試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，浮萍多糖的提取率隨著超聲波溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在超聲波提取溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)樘崛囟冗^高，多糖會發(fā)生降解，影響浮萍多糖的提取率[16]，所以本試驗(yàn)中的最佳超聲波提取溫度選擇為50 ℃。

2.2.5 提取次數(shù)對浮萍多糖提取率的影響 不同提取次數(shù)對多糖提取率的影響結(jié)果見圖6。

圖6 提取次數(shù)對浮萍多糖提取率的影響Fig 6 Effect of extraction times on the extraction rate of polysaccharides duckweed

由圖6可知，提取次數(shù)1～2次時(shí)，浮萍多糖的提取率有顯著的提高，但第3、4次，浮萍多糖的提取率有提高，但不顯著，結(jié)合實(shí)際成本考慮，故本試驗(yàn)選擇提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素的選取 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲時(shí)間和超聲功率為自變量，以浮萍多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

2.3.2 響應(yīng)面模型的建立及分析 運(yùn)用Design-Expert進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為分析因子，5個(gè)為中心試驗(yàn)用以估計(jì)誤差。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design-Expert對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多遠(yuǎn)回歸擬合，得到浮萍多糖提取率對試驗(yàn)自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：多糖提取率Y=-0.019A2-0.0065B2+0.0025C2-0.0008AB-0.0013AC+0.016BC+0.060A-0.036B+0.055C+1.01。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab 1 The response surface experiment factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表Tab 2 Design and Results of the response surface experiment result

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映了影響的方向[17]。由方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以得出，影響浮萍多糖提取率的因素的主次順序?yàn)椋毫弦罕?、超聲功率、超聲時(shí)間，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab 3 ANOVA results of the response surface experiment

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 利用Design Expert 軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，所得到的響應(yīng)面及其等高線圖見圖7-圖9。通過等高線的形狀可以判斷因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形標(biāo)識兩因素交互作用可以忽略，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著[18]。根據(jù)浮萍多糖提取過程中各因素的兩兩交互作用確定各因素的最佳水平范圍。

由圖7等高線圖可知水料比和超聲時(shí)間的交互作用對浮萍多糖提取率的影響不顯著。曲面圖中顯示，在所選的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在多糖提取率的極值；水料比對于浮萍多糖提取率的影響較超聲時(shí)間顯著。

圖7 水料比和超聲時(shí)間的相互作用及等高線分析圖Fig 7 The ratio of water and ultrasonic time interaction and contour analysis chart

圖8 水料比和超聲功率的相互作用及等高線分析圖Fig 8 The ratio of water and the interaction of ultrasonic power and contour analysis chart

圖9 超聲時(shí)間和超聲功率的相互作用及等高線分析圖Fig 9 Interaction of ultrasonic time and ultrasonic power and contour maps

由圖8等高線圖和曲面圖可知，水料比和超聲功率的交互作用對浮萍多糖提取率影響較為顯著，水料比對于浮萍多糖提取率的影響較超聲功率顯著。

由圖9等高線圖和曲面圖可知，超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對浮萍多糖提取率的影響顯著；超聲功率對于浮萍多糖提取率的影響較超聲時(shí)間顯著。

綜上可知，對浮萍多糖提取率的影響程度從大到小依次為料液比、超聲功率和超聲時(shí)間。通過響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到浮萍多糖最大提取率為1.188%，提取浮萍多糖的最佳工藝條件為料液比1∶40.06、超聲時(shí)間79.58 min、超聲功率341.37 W。

2.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證 在上述優(yōu)化的提取條件下，浮萍多糖提取率的理論值可達(dá)到1.188%。為了檢驗(yàn)此最佳工藝條件的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件改為：料液比1∶40、超聲時(shí)間80 min、超聲功率340 W，做3組平行試驗(yàn)，進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表4所示，得到的多糖提取率的平均值為1.125%，與模型理論預(yù)測值僅相差0.063%，因此，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

表4 多糖提取驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Polysaccharide extraction and verification

2.4 多糖含量測定結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)中得到的最佳提取條件，采用苯酚-硫酸法測定樣品(粗多糖粉末)中的多糖含量，結(jié)果見表5。

表5 多糖含量測定結(jié)果Tab 5 Polysaccharide content determination results

超聲波法提取浮萍多糖測得的樣品純度為18.03%，國內(nèi)堆熱法提取浮萍多糖測得的樣品純度為15%～30%。相比可發(fā)現(xiàn)，提取的多糖的純度仍需要提高。

3 討 論

浮萍其營養(yǎng)價(jià)值很高，而蛋白、脂肪含量均超過其他水草[19]。本研究運(yùn)用超聲波輔助提取浮萍多糖，運(yùn)用了超聲波的空化效應(yīng)，大大地增加了溶劑的穿透力，加深需提取成分的在溶液中的釋放擴(kuò)散，提高了物質(zhì)的提取速度和工作效率。

通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化浮萍多糖的提取工藝，試驗(yàn)值與模型理論預(yù)測值僅相差0.063%。因此采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。葛星星等曾用該方法對豆薯多糖進(jìn)行工藝優(yōu)化[20], 徐仰麗等也用該方法對蝦殼進(jìn)行脫鹽處理[21]，都獲得了較高的提取率和純度，說明該方法切實(shí)可行。所以在浮萍多糖提取方面需要繼續(xù)優(yōu)化工藝，這也是該實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行的后續(xù)探索。

超聲波法提取浮萍多糖測得的樣品純度與國內(nèi)堆熱法[5]和超濾法提取浮萍多糖[6]測得的樣品純度相比可發(fā)現(xiàn)，在多糖提取率和多糖純度方面仍需要提高，但本實(shí)驗(yàn)降低了設(shè)備需求，技術(shù)流程相對簡單，更適合工業(yè)應(yīng)用。另外，在葛星星、徐仰麗等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，他們在單因素實(shí)驗(yàn)選取數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)選擇的數(shù)據(jù)段與該實(shí)驗(yàn)不同，可能這是導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)純度相對較低的原因。后續(xù)工作將在不破壞多糖活性的前提下，改進(jìn)試驗(yàn)過程，提高樣品提取率和純度。