高效液相色譜法測(cè)定飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量

商軍，華賢輝，張浩然，張亦菲，田愷，徐汀

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

葡萄糖胺鹽酸鹽是一種天然的氨基單糖，可以刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，提高軟骨細(xì)胞的修復(fù)能力，抑制產(chǎn)生損傷軟骨的酶，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的修復(fù)和重建，可延緩骨關(guān)節(jié)疼痛的病理過(guò)程和疾病的進(jìn)程[1]?，F(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中主要采用甲殼類動(dòng)物和其他節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼為原料，經(jīng)鹽酸水解，再經(jīng)活性炭脫色和干燥步驟得到其成品[2]，葡萄糖胺鹽酸鹽已被收錄于中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1773號(hào)《飼料原料目錄》中，其不僅廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域，而且也已在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和寵物保健中得到了應(yīng)用[3]。

目前醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域葡萄糖胺鹽酸鹽含量測(cè)定的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要有以下幾種方法：分光光度法[4]、高效液相色譜(HPLC)- 紫外檢測(cè)法[5-6]、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[7-8]、HPLC-示差折光檢測(cè)法[9]和HPLC - 熒光光度檢測(cè)法[10]，其中分光光度法操作繁瑣費(fèi)時(shí)、人為操作誤差較大；采用HPLC - 蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，ELSD 的響應(yīng)值與葡萄糖胺鹽酸鹽濃度的關(guān)系曲線，在較高濃度范圍內(nèi)大致呈線性，而在低濃度范圍內(nèi)呈指數(shù)關(guān)系；采用HPLC - 示差折光檢測(cè)法，示差折光檢測(cè)器的靈敏度低，不能實(shí)現(xiàn)梯度洗脫，對(duì)有干擾峰的樣品不適用；采用HPLC-熒光光度檢測(cè)法，需要衍生，操作相對(duì)復(fù)雜，消耗時(shí)間長(zhǎng)，上述檢測(cè)法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，均不如HPLC - 紫外檢測(cè)法。目前，標(biāo)準(zhǔn)收載的葡萄糖胺鹽酸鹽原料含量測(cè)定方法主要有電位滴定法(歐洲藥典9.0 版)[11]、高效液相色譜法(美國(guó)藥典40 版)[12]，國(guó)內(nèi)尚無(wú)國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一含量測(cè)定就非常重要，為此，本方法參考美國(guó)藥典40 版，進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)條件，建立高效液相色譜法測(cè)定不同來(lái)源和批次的葡萄糖胺鹽酸鹽原料含量，并與電位滴定法進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明，建立的方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以作為飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量測(cè)定的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(分離系統(tǒng)e2695，二極管陣列檢測(cè)器PDA2998，紫外檢測(cè)器2487，美國(guó) Waters公司，配Empower 3軟件)；電位滴定儀(904 Titrando，瑞士萬(wàn)通公司)；電子天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO 公司，精度為0.01 mg)；純水機(jī)(Molatom 1810A，中國(guó)重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為140649～201304，含量為100%)；磷酸氫二鉀(分析純)；磷酸(分析純)；乙腈(色譜純)；磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5，稱取磷酸氫二鉀3.5 g，精確至0.01 g，置1000 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加入0.25 mL氨水，用水稀釋至刻度，搖勻；用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5±0.2)；0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；實(shí)驗(yàn)用水(電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682一級(jí)用水的規(guī)定)。飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽由國(guó)內(nèi)4家典型的生產(chǎn)企業(yè)各提供3批(企業(yè)1的批號(hào)為201802173、201803122、201805215；企業(yè)2的批號(hào)為Y1710015、Y1710023、Y1803001；企業(yè)3的批號(hào)為20171102、20180116、20180429；企業(yè)4的批號(hào)為M1811001、M1811002、M1811003)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(長(zhǎng)：150 mm，內(nèi)徑：4.6 mm，粒徑：4～5 μm)；流動(dòng)相：乙腈 - 磷酸鹽緩沖溶液(70+30，V1+V2)；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：195 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液(4.00 mg/mL)和葡萄糖胺鹽酸鹽供試品溶液(4.00 mg/mL)的典型色譜圖見(jiàn)圖1，保留時(shí)間約為2.5～2.6 min，分離度大于1.5。

圖1 葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液和供試品 溶液的HPLC色譜圖Fig 1 Chromatogram of standard solution and sample solution of glucosamine hydrochloride

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品約0.2 g，精確至0.1 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取供試品約0.2 g，精確至0.1 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.3 供試品測(cè)定 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得對(duì)照品和供試品溶液中葡萄糖胺鹽酸鹽的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中葡萄糖胺鹽酸鹽含量。

2.4 線性關(guān)系考察 分別稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品0.15、0.175、0.2、0.225、0.25 g，精確至0.1 mg，分別置50 mL棕色容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)至刻度，搖勻，制成葡萄糖胺鹽酸鹽濃度分別為3.00、3.50、4.00、4.50和5.00 mg/mL的對(duì)照品曲線溶液。取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)的色譜條件操作，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制對(duì)照品曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3.00～5.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 葡萄糖胺鹽酸鹽的線性關(guān)系(n=3)Tab 1 Linear relationship of glucosamine hydrochloride (n=3)

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取2.2.1項(xiàng)的葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液(4.00 mg/mL)1份，按2.1項(xiàng)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，檢驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定的重復(fù)性；取201802173一批供試品，按2.2.2項(xiàng)的供試品溶液制備，分別制備成供試品溶液5份，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，檢驗(yàn)供試品測(cè)定的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.02%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%；5份葡萄糖胺鹽酸鹽供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.1%，系統(tǒng)和供試品測(cè)定重復(fù)性均良好。

2.5.2 中間精密度實(shí)驗(yàn) 取201802173一批供試品，分別于不同日期、不同人員和不同儀器，按2.3項(xiàng)的供試品測(cè)定對(duì)該批供試品含量進(jìn)行雙樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同日期、不同人員和不同儀器對(duì)批號(hào)201802173葡萄糖胺鹽酸鹽含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.09%。精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.5.1項(xiàng)的重復(fù)性試驗(yàn)中201802173一批供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、24、30、36 h進(jìn)樣10 μL，在0～12 h，測(cè)得峰面積的RSD為0.7%；在16 h后峰面積有顯著下降，說(shuō)明供試品有部分降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn) 分別稱取已知含量的供試品約0.1 g，精確至0.1 mg，共9份，分別置50 mL容量瓶中，另分別稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品0.08 g、0.1 g和0.12 g各3份，精確至0.1 mg，依低、中、高分別置上述9個(gè)50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；另取葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品，按2.2.1項(xiàng)的對(duì)照品溶液制備操作，制備成對(duì)照品溶液。分別取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)的色譜條件操作，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算測(cè)定結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品不同量的葡萄糖胺鹽酸鹽平均回收率為99.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.6%，RSD為0.6%，方法的準(zhǔn)確度較好。

表2 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Repeatability test results of the method

表3 方法的中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Intermediate precision test results of the method %

表4 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab 4 Method recovery test results

2.8 檢測(cè)限與定量限 精密稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對(duì)照品0.03028 g，置10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液(V1∶V2)溶解稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，用50%乙腈溶液(V1∶V2)逐級(jí)稀釋成系列濃度，吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比(S/N)≥3計(jì)算為檢測(cè)限，以信噪比(S/N)≥10計(jì)算為定量限。檢測(cè)限為0.032 mg/mL，定量限為0.12 mg/mL。

2.9 本法與電位滴定法測(cè)定含量的比較 取批號(hào)為M1811001和Y1710015的供試品，分別按歐洲藥典9.0 版的電位滴定法和本法的HPLC法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果采用雙樣本T進(jìn)行檢驗(yàn)，由表5和圖2可知，兩法測(cè)定供試品批號(hào)為M1811001和Y1710015葡萄糖胺鹽酸鹽含量的結(jié)果均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 本法與電位滴定法測(cè)定結(jié)果比較(n=6)Tab 5 Comparison of the results of this method and potentiometric titration (n=6)

圖2 本法與電位滴定法含量測(cè)定結(jié)果的分布比較圖Fig 2 Comparisons of determination results between this method and potentiometric titration

2.10 不同實(shí)驗(yàn)室比較測(cè)定結(jié)果 分別取4家生產(chǎn)企業(yè)提供的飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽各3批，按本法由本實(shí)驗(yàn)室(Ⅰ)與4家生產(chǎn)企業(yè)實(shí)驗(yàn)室(Ⅱ)測(cè)定同批供試品中葡萄糖胺鹽酸鹽含量，結(jié)果見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按本法測(cè)定飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量，本實(shí)驗(yàn)室與生產(chǎn)企業(yè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的結(jié)果基本一致。

表6 供試品比較測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 6 Comparisons of sample determination results in different laboratories (n=3) %

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由于葡萄糖胺鹽酸鹽分子結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛雙鍵，基本無(wú)紫外吸收，在195 nm和205 nm波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)的末端吸收，美國(guó)藥典(40版)[12]和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6，13]對(duì)原料藥的測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)均采用195 nm，故本實(shí)驗(yàn)選擇195 nm為本品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相與流速的優(yōu)化 目前，從高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖胺鹽酸鹽含量的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，流動(dòng)相組成主要有乙腈與磷酸鹽緩沖液[6，12]、乙腈與乙酸銨溶液[13-14]。本研究參考了美國(guó)藥典(40版)，采用乙腈與磷酸鹽緩沖液為組成的流動(dòng)相，并優(yōu)化了流動(dòng)相的比例和磷酸鹽緩沖液的pH值，優(yōu)化結(jié)果表明，乙腈比例在65%～75%范圍及磷酸鹽緩沖液pH值在7.2～7.7范圍時(shí)保留時(shí)間和分離效果均較好，為確保方法的耐用性，選擇了乙腈比例為70%，磷酸鹽緩沖液pH值為7.5±0.2，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。美國(guó)藥典(40版)采用NH2色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定，由于該型柱對(duì)葡萄糖胺鹽酸鹽的保留行為較強(qiáng)，故流速為1.5 mL/min，保留時(shí)間約為25 min，隨著測(cè)定的進(jìn)行，保留時(shí)間的重復(fù)性變化較大。為此本實(shí)驗(yàn)采用了C18柱進(jìn)行分離測(cè)定，并對(duì)流速進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.6 mL/min時(shí)，葡萄糖胺鹽酸鹽色譜峰與供試品中的基質(zhì)峰能完全分離，保留時(shí)間約為2.5～2.6 min，大大縮短了分析時(shí)間，且保留時(shí)間的重復(fù)性較好。

圖3 流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)保留時(shí)間和分離度的影響Fig 3 Effect of acetonitrile ratio on retention time and resolution in mobile phase

圖4 磷酸鹽緩沖液pH對(duì)保留時(shí)間和分離度的影響Fig 4 Effect of pH of phosphate buffer on retention time and resolution

采用高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖胺鹽酸鹽含量，該方法操作簡(jiǎn)便易行、快速，方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可用于飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量測(cè)定的質(zhì)量控制。