葡萄F1代雜交種的SRAP分子標(biāo)記鑒定

耿牡丹，劉 俊，孫瑞芬，趙 鎰，石慧芹，蘇慧明，金 珂

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.包頭市果樹果品科學(xué)技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014045）

葡萄是我國重要的經(jīng)濟(jì)果樹，加速葡萄新品種培育對葡萄產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有舉足輕重的作用。我國葡萄育種途徑主要有實(shí)生選種、雜交育種、芽變選種、人工誘變育種等，其中雜交育種是最常用、也是成功率最高的育種手段，我國68%的優(yōu)良品種來源于雜交育種[1]。葡萄品種繁多，資源豐富，不同地域品種雜交導(dǎo)致葡萄品種命名混亂，同名異物或同物異名成為普遍現(xiàn)象，且葡萄具有閉花受精習(xí)性，在雜交育種中，可能由于人工去雄套袋的不及時(shí)或去雄不徹底等原因使后代中混有自交苗，造成真假雜交種苗混雜，使雜交育種效率降低。因此，就雜交種的真實(shí)性進(jìn)行鑒定對葡萄新品種創(chuàng)制具有重要意義。

葡萄雜交后代的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、同工酶及分子標(biāo)記等方法。形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的鑒定方法，容易受環(huán)境條件和栽培措施的影響，且其周期較長；細(xì)胞學(xué)鑒定程序較煩瑣，技術(shù)水平要求高，對于染色體小且相似的個(gè)體難于準(zhǔn)確識別；同工酶標(biāo)記難以體現(xiàn)親緣關(guān)系近的雜種之間的差異，而且同工酶在植物體內(nèi)較敏感，其標(biāo)記結(jié)果易受取材多少、采樣部位、時(shí)間及環(huán)境條件等諸多因素的影響[2]；分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展提供了直接以DNA 圖譜的方式顯示、在基因水平上揭示雜交子代與父母本間的遺傳差異，標(biāo)記位點(diǎn)多、多態(tài)性高，且不受環(huán)境及發(fā)育等因素的影響，為雜交后代進(jìn)行早期快速鑒定與選擇提供新的理論依據(jù)。王西平等[3]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定了我國野生葡萄毛葡萄商-24 與歐洲葡萄龍眼的F1代雜交種。樊秀彩等[4]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了山葡萄和河岸葡萄的種間雜交種。朱駿馳等[5]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了玫瑰香與紅地球的210 個(gè)雜交種后代。

SRAP 分子標(biāo)記是一種基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記技術(shù)具有簡便、高效、快速、重復(fù)性好、多態(tài)性高、無須預(yù)知物種序列信息的特點(diǎn)，已成功地應(yīng)用于不同物種種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[6-8]、雜交種鑒定[9-10]、遺傳圖譜的構(gòu)建[11-12]以及重要性狀的標(biāo)記[13]等方面的研究。本研究采用SRAP 技術(shù)對3 對葡萄種間雜交組合紅提×紅玫瑰、紅提×貝達(dá)和紅提×貴妃的F1代實(shí)生苗進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，以建立有效的葡萄雜交種鑒定方法，從而為葡萄新種質(zhì)的創(chuàng)制提供輔助選擇手段。

1 材料和方法

1.1 植物材料

葡萄親本材料歐亞種品種紅提、紅玫瑰、貴妃和美洲種貝達(dá)幼嫩葉片采自內(nèi)蒙古包頭市沙爾沁村種植戶；紅提×紅玫瑰的2 個(gè)F1代實(shí)生苗、紅提×貝達(dá)的3 個(gè)F1代實(shí)生苗和紅提×貴妃的3 個(gè)F1代實(shí)生苗幼葉均采自內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院科技示范園13 號大棚。采集時(shí)間為2018年7月，采集的葉片于液氮中速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

植物基因組DNA 提取試劑盒、Loading Buffer購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖、核酸染料購自南京博爾迪生化試劑有限公司；50 bp DNA Ladder（Dye Plus）和100 bp DNA Ladder（Dye Plus）購自TakaRa 公司，其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 SRAP 引物序列

1.3 植物基因組DNA 提取與檢測

用植物基因組DNA 提取試劑盒提取各試驗(yàn)樣品的基因組DNA，提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，通過超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度及純度后，將樣品DNA 濃度稀釋為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SRAP-PCR 引物的篩選

用14 條正向引物和14 條反向引物組合成196對SRAP-PCR 引物（表1），以4 個(gè)親本材料的DNA為模板進(jìn)行SRAP 擴(kuò)增，每對引物重復(fù)3 次。SRAPPCR 反應(yīng)體系為12.5 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 6.25 μL，上游引物0.25 μL，下游引物為0.25 μL，dd H2O 4.75 μL，模板DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5 次；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。將能夠擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的父本特異性條帶的引物，或在每對雜交組合的父、母本間能夠產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶的引物作為鑒定F1代雜交種的SRAP 擴(kuò)增引物。

1.5 F1 代雜交種的SRAP-PCR 分析

在SRAP-PCR 中，以擴(kuò)增出父本特異性條帶的雜種確定為真雜種。以此為判定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定F1代雜交種的真實(shí)性有2 種情況：（1）有父本的特異條帶，有或無子代的特異條帶；（2）既有母本的特異條帶又有父本的特異條帶，有或無子代的特異條帶。如果只有母本和子代的特異條帶而沒有父本的特異條帶，則認(rèn)為母本的自交種或假雜種。每對引物重復(fù)3 次SRAP 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物基因組DNA 檢測

用植物基因組DNA 提取試劑盒提取4 份親本材料及8 份F1代植株葉片總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 條帶清晰且沒有明顯拖尾（圖1）；通過超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA 的濃度及純度，DNA 的A260/280比值均在1.8～2.0，說明所提DNA 完整性好，純度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。將試驗(yàn)樣品DNA 濃度稀釋為20 ng/μL，用于SRAP 擴(kuò)增的模板。

圖1 葡萄基因組DNA 電泳結(jié)果

2.2 SRAP-PCR 引物組合篩選

由于SRAP 標(biāo)記或?yàn)轱@性標(biāo)記或?yàn)楣诧@性標(biāo)記，在雙親中進(jìn)行引物篩選時(shí)，無法判斷具有父本特異位點(diǎn)的類型是純合顯性位點(diǎn)還是雜合顯性位點(diǎn)，故至少需要3～5 個(gè)SRAP 標(biāo)記進(jìn)行綜合分析。將14 條正向引物和14 條反向引物組合成196 對SRAP 引物組合，分別對3 對親本組合的父、母本進(jìn)行SRAP-PCR 擴(kuò)增，選擇在每對組合的父、母本間產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶的引物，作為F1代雜交種鑒定的引物。經(jīng)過反復(fù)篩選，選出可以鑒定紅提×紅玫瑰及其F1代雜交種的引物有4 對（Me1/Em10、Me8/Em13、Me9/Em3 和Me9/Em10）；可以鑒定紅提×貝達(dá)及其F1代雜交種的引物有10 對（Me1/Em10、Me2/Em11、Me3/Em10、Me4/Em10、Me5/Em6、Me8/Em13、Me9/Em3、Me9/Em10、Me13/Em5 和Me14/Em3）；可以鑒定紅提×貴妃及其F1代雜交種的引物有4 對（Me1/Em10、Me2/Em11、Me5/Em6 和M8/Em13）。

2.3 紅提×紅玫瑰的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的4 對SRAP-PCR 引物中選擇3 對進(jìn)行紅提×紅玫瑰的2 個(gè)F1代雜交種的鑒定。以紅提（♀）、紅玫瑰（♂）以及紅提×紅玫瑰的2 個(gè)F1代植株基因組DNA 為模板，分別用引物Me1/Em10、Me9/Em3 和Me8/Em13 進(jìn)行SRAP 擴(kuò)增。在引物Me1/Em10 的擴(kuò)增中，400～500 bp，2 個(gè)子代均有父本的特異條帶，說明有父本基因的滲入；子代2（2F1）在1 500 bp 以上還有1 條自己的特異條帶（圖2A，箭頭所示），說明在子代2 中產(chǎn)生了變異，符合真實(shí)雜交種的判定標(biāo)準(zhǔn)。在引物Me9/Em3 的擴(kuò)增中，由圖2B 可知，2 個(gè)子代在700～800 bp 均有1 條父本的特異條帶，說明均有父本基因滲入；子代1（1F1）在1 000～1 500 bp 有1 條清晰的母本特異條帶，所以認(rèn)為，2 個(gè)子代均為真雜種。在引物Me8/Em13 的擴(kuò)增中，由圖2C 可知，2 個(gè)F1代植株均在1 000 bp 處和600～700 bp 分別有1 條清晰的父本特異條帶，在1 000～1 500 bp 有1 條清晰的母本特異條帶；子代2（2F1）在500～600 bp 和350～400 bp 各有1 條母本特異條帶，且子代2（2F1）在150 bp 處和150～200 bp既有1 條母本特異條帶，同時(shí)有1 條父本特異條帶。除此之外，子代1（1F1）在350～500 bp 還有4 條父本特異條帶，由此，進(jìn)一步確定2 個(gè)F1代雜交種均為紅提×紅玫瑰的真雜種。

圖2 引物Me1/Em10（A）、Me9/Em3（B）和Me8/Em13（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

2.4 紅提×貝達(dá)的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的10 對SRAP-PCR 引物中，隨機(jī)選取3 對（Me3/Em10、Me13/Em5、Me14/Em3）進(jìn)行紅提×貝達(dá)的3 個(gè)F1代雜交種的鑒定。從引物Me3/Em10擴(kuò)增的電泳圖（圖3A）可知，在500 bp 處，3 個(gè)F1子代均有1 條父本的特異條帶，且在700～800 bp、400～450 bp、300～350 bp 均有1 條母本的特異條帶；另外，在1 500 bp 處，子代2（2F1）有2 條母本特異條帶；在450 bp 處，子代1（1F1）有1 條母本特異條帶；在1 500 bp 以上、300～350 bp 位點(diǎn)處，子代1（1F1）各有1 條父本特異條帶，在150～200 bp，子代2（2F1）和子代3（3F1）均有1 條父本的特異條帶。引物Me13/Em5 擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示（圖3B），3 個(gè)子代在300～350 bp 均有父本的特異條帶，且在400 bp 處均有母本的特異條帶。所以，用引物Me13/Em5 很容易鑒定出3 個(gè)子代均為真雜種。用引物Me14/Em3 進(jìn)行SRAP-PCR 反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示（圖3C），3 個(gè)子代在200 bp 處均有父本的特異條帶，且子代1（1F1）和子代2（2F1）在1 500 bp 以上有1 條父本的特異條帶，子代1（1F1）和子代3（3F1）在600～700 bp 有1 條父本的特異條帶；子代1（1F1）和子代2（2F1）在接近700 bp 處均有1 條自己的特異帶型，所以，3 個(gè)子代均為紅提×貝達(dá)的真雜種。

2.5 紅提×貴妃的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的4 對引物中，用其中3 對引物Me1/Em10、Me2/Em11 和Me5/Em6 對紅提（♀）、貴妃（♂）及其3 個(gè)F1代雜交種進(jìn)行SRAP-PCR 分析。在引物Me1/Em10 的擴(kuò)增電泳結(jié)果中（圖4A），子代2（2F1）和子代3（3F1）在700～900 bp 均有3 條父本特異條帶，子代1（1F1）在700～800 bp 有1 條父本特異條帶，子代1（1F1）和子代3（3F1）在1 000 bp 以上均有1 條父本特異條帶，說明3 個(gè)子代均有父本基因滲入。子代1（1F1）和子代3（3F1）在600 bp 處均有1 條母本特異條帶，子代2（2F1）在1 000 ～1 500 bp有1 條母本特異條帶，說明3 個(gè)子代均有母本特異條帶。除此之外，3 個(gè)子代分別在400～500 bp、500～600 bp、500 bp 處均有各自的特異條帶。子代既有父本特異型條帶又有母本特異型條帶，并且還有自己的特異條帶，所以，3 個(gè)子代無疑為紅提×貴妃葡萄的雜交種。在引物Me2/Em11 的擴(kuò)增電泳結(jié)果中（圖4B），3 個(gè)子代在350 bp 處和250～300 bp 均有父本的特異條帶，子代3（3F1）在700 bp 處有自己的特異條帶。由于鑒定子代以擴(kuò)增出父本的特異條帶為依據(jù)，所以，引物Me2/Em11 可以確定3 個(gè)子代均為真雜種。引物Me5/Em6 的擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示（圖4C），3 個(gè)子代在400～450 bp 和1 000～1 500 bp 均各有1條清晰可見的父本的特異條帶，且在700 bp 處均有1 條母本特異條帶；子代2（2F1）在1 000～1 500 bp 有1 條父本特異條帶，在接近1 500 bp 處還有1 條母本特異條帶。所以，引物Me5/Em6 也較容易將紅提、貴妃及其二者的雜交后代區(qū)別開來。

圖3 引物Me3/Em10（A）、Me13/Em5（B）和Me14/Em3（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

圖4 引物Me1/Em10（A）、Me2/Em11（B）和Me5/Em6（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

3 討論與結(jié)論

葡萄雜交育種是種質(zhì)創(chuàng)制的重要途徑。由于葡萄育種周期長、且自花授粉習(xí)性容易導(dǎo)致假雜種產(chǎn)生，因此，對雜交種進(jìn)行早期鑒定、早期選擇是提高育種效率、節(jié)約育種成本、加速育種進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)。分子標(biāo)記輔助選擇則是快速、有效進(jìn)行雜交種早期鑒定與選擇的手段。

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)是由LI 等[14]開發(fā)，稱為序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性。它是以雙引物擴(kuò)增為基礎(chǔ)，旨在對基因組中的開放閱讀框架（ORF）進(jìn)行擴(kuò)增，因此能夠體現(xiàn)物種間基因的多態(tài)性，更能體現(xiàn)出個(gè)體間真實(shí)的親緣關(guān)系。本研究的3 對雜交組合中，紅提和貝達(dá)分別屬于歐亞種和美洲種，二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故196 對SRAP-PCR 引物中，可用于鑒別雙親和子代的SRAP 引物相對較多，為10 對；而紅提和紅玫瑰、紅提和貴妃均屬于歐亞種，親緣關(guān)系相對較近，故196 對引物中，可用于鑒別雙親及其后代的引物相對較少，紅提和紅玫瑰組合為4 對，紅提和貴妃組合也為4 對，這8 對引物同時(shí)可鑒定紅提和貝達(dá)及其二者的雜交后代。

本研究利用SRAP 技術(shù)，對紅提×紅玫瑰的2 個(gè)F1代實(shí)生苗、紅提×貝達(dá)的3 個(gè)F1代實(shí)生苗和紅提×貴妃的3 個(gè)F1代實(shí)生苗進(jìn)行了真雜種的早期鑒定。我們的判定標(biāo)準(zhǔn)主要是依據(jù)父本特異條帶的產(chǎn)生，即父本遺傳信息的滲入。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合有母本特異條帶的擴(kuò)增或者F1代實(shí)生苗中出現(xiàn)新的特異條帶（新帶型可能是不同等位基因上同源序列的遺傳重組）。在LI 等[14]的研究結(jié)果中，20%的SRAP 標(biāo)記為共顯性標(biāo)記。因此，本研究中有些雜交種只有父本的特異帶型，而沒有出現(xiàn)父母本標(biāo)記位點(diǎn)信息的疊加。通過反復(fù)試驗(yàn)，篩選出能夠鑒定不同親本組合的F1代雜交后代的特異引物，表明采用SRAP 技術(shù)快速鑒定葡萄真?zhèn)坞s交種是可行的，這些相應(yīng)的引物可以繼續(xù)用來分別進(jìn)行3 對親本組合的其他F1代雜交植株的鑒定。