銀杏葉黃酮化合物提取和純化研究進(jìn)展

李琦

摘 ?????要：系統(tǒng)歸納總結(jié)了銀杏葉黃酮化合物提取和純化方法，從提取率、提取純度、工業(yè)化適用性和環(huán)保性等角度，詳細(xì)分析了溶劑提取法、酶輔助提取法、微波提取法、超聲波提取法和超臨界CO2萃取提取法的優(yōu)缺點(diǎn);并根據(jù)銀杏葉黃酮化合物的結(jié)構(gòu)差異性，對(duì)其純化方法-膜分離、大孔樹脂和聚酰胺分離等研究現(xiàn)狀系統(tǒng)地總結(jié)對(duì)比;最后，對(duì)銀杏葉黃酮化合物的提取開發(fā)技術(shù)提出建議和展望。

關(guān) ?鍵 ?詞：銀杏葉;黃酮;提取;純化;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S713; ?R284.2 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）04-0812-04

Abstract： Extraction and purification methods of flavonoids from Ginkgo biloba leaves were introduced， including organic solvent method， enzyme-assisted method， microwave-assisted method， ultrasonic method， supercritical CO2 extraction method and so on. Their advantages and disadvantages were discussed from the aspects of extraction yield， extraction purity， industrial applicability and environmental protection effect. Furthermore， the research progress of membrane separation， microporous resin and polyamide resin purification methods were systematically reviewed. In the end， the development trend of extraction and purification technologies of Ginkgo biloba leaf flavonoids was prospected.

Key words： Ginkgo biloba leaves; Flavonoids; Extraction; Purification; Research progress

我國植物資源豐富，對(duì)天然植物的根莖葉進(jìn)行提取純化可得到具有多種生物活性的化合物，對(duì)我國食品、醫(yī)藥和保健品等行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。銀杏葉提取物的主要活性成分為銀杏葉黃酮，具有清除自由基、抗氧化和改善心腦血管循環(huán)等多種功能，可以起到預(yù)防和治療心腦血管等疾病的作用。由于來源于天然產(chǎn)物，且具有優(yōu)異生物活性，而被廣泛應(yīng)用于化妝品、保健品和醫(yī)藥等多種領(lǐng)域。銀杏葉黃酮的提取與功能應(yīng)用研究一直是天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)之一[1]，已有多篇論文對(duì)銀杏葉提取物研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述報(bào)道，如徐芳[1]、陳西娟[2]等[3]對(duì)銀杏葉黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理臨床應(yīng)用、提取工藝等研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，但對(duì)銀杏葉黃酮的純化精制、性能和構(gòu)效關(guān)系等概括還不夠系統(tǒng)。

本文則系統(tǒng)地對(duì)銀杏葉黃酮提取方法優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行概括比較，分析銀杏葉黃酮膜分離、樹脂法、柱層析分離純化技術(shù)研究現(xiàn)狀，并對(duì)銀杏葉黃酮提取純化技術(shù)發(fā)展進(jìn)行展望。

1 ?銀杏葉黃酮的提取方法

根據(jù)提取過程采用的供能方式（如微波和超聲波）、體系（如溶劑和超臨界流體）以及其它輔助物質(zhì)等，銀杏葉黃酮化合物提取方法主要有溶劑浸提法、酶輔助法、微波法、超聲波法和超臨界流體法等。

1.1 ?溶劑浸提法

溶劑浸提法是目前應(yīng)用最廣泛的銀杏葉黃酮提取方法[4]。文獻(xiàn)報(bào)道中所浸提用溶劑多采用極性較大的乙醇水體系，例如，薛志彬[5]利用70%乙醇作為浸提所用的溶劑，在80 ℃下，提取3.0 h，總黃酮純度達(dá)16.13%。賈長(zhǎng)英[6]等研究發(fā)現(xiàn)乙醇溶劑浸提條件的影響規(guī)律如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>浸提時(shí)間>浸提溫度。乙醇水體系作為溶劑，相比其它大極性溶劑如丙酮等，毒性小，殘留處理方便;溶劑提取法方便、操作簡(jiǎn)易，然而存在提取率低、操作時(shí)間長(zhǎng)、材料浪費(fèi)等弊端。

1.2 ?酶輔助提取法

由于植物中的活性成分多存在于根莖葉中，而根莖葉中主要結(jié)構(gòu)組織成分為三大素-纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，均為聚合的高分子化合物，且具有穩(wěn)定密集的結(jié)晶區(qū)，三大素的緊密結(jié)構(gòu)導(dǎo)致植物中活性成分更難被提取，采用溫和的生物酶技術(shù)破壞三大素結(jié)構(gòu)來提高活性成分的提取效果是近年來植物提取發(fā)展的新技術(shù)[7]。銀杏葉黃酮多存在于銀杏葉細(xì)胞內(nèi)，銀杏葉細(xì)胞壁主要成分是纖維素，利用纖維素酶破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可使細(xì)胞內(nèi)的黃酮更多地溶解于溶劑中[8]。因此，生物酶技術(shù)也逐步被用于銀杏葉黃酮的提純技術(shù)中，在提純過程中，利用纖維素酶先降解細(xì)胞壁中纖維素，釋放出細(xì)胞壁中黃酮，可大幅度增大銀杏葉黃酮的提取率，而且，提純結(jié)束可通過瞬間升溫等方式，將生物酶殺死，不會(huì)在目標(biāo)產(chǎn)物中殘留含有毒副作用的物質(zhì)。吳梅林[9]等利用纖維素酶輔助法提取銀杏葉總黃酮，與乙醇浸提提取法相比，總黃酮得率提高了18.92%;CHEN Shuo [10]利用纖維素酶法提取銀杏葉黃酮，同時(shí)加入麥芽糖作為糖基，促進(jìn)黃酮苷配基的轉(zhuǎn)糖基作用，使苷元轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性更大的苷，從而使更多的有效成分溶解于提取液中，比在相同條件而無酶時(shí)產(chǎn)率提高了102%。酶輔助法可大幅度提高提取率，而且環(huán)保、安全性好等，所得提取物可用于食品和營養(yǎng)品添加應(yīng)用。

1.3 ?微波輔助提取法

微波輔助提取技術(shù)具有副產(chǎn)物少，速度快和產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于黃酮的提取[11，12]。徐春明[13]等利用微波輔助乙醇溶劑法提取銀杏葉總黃酮，得出較佳的提取條件，在溫度70 ℃，料液比為1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波功率300 W，微波時(shí)間60 s的條件下提取銀杏葉，總黃酮的提取率可達(dá)到2.698%。但微波溫度過高會(huì)破壞黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)，且更容易溶解出更多的雜質(zhì)，且當(dāng)功率較大溫度較高時(shí)，溶劑很易揮發(fā)，造成一定污染。因此，微波提取法在提取功率和溫度上有待進(jìn)一步優(yōu)化，如控低溫而保持微波功率的作用。

1.4 ?超聲波輔助提取法

豁銀強(qiáng)[14]利用超聲波技術(shù)提取銀杏葉黃酮，在70%乙醇作為浸提液，超聲功率100 W條件下，將超聲輔助乙醇浸提，在提取時(shí)間50 min，液料比為30∶1時(shí)，得到銀杏葉黃酮的提取率為3.51%。GAO Han [15]則先進(jìn)行21.66 min超聲，再經(jīng)39.34 ℃下2 h的提取，產(chǎn)品黃酮純度為40.62mg/g。超聲波輔助溶劑提取法，不需高溫條件，控制簡(jiǎn)便[16]，但易形成超聲空白區(qū)，且設(shè)備制造成本較高。

超聲波和微波均是利用介觀尺度的能量波為能源，快速提取植物有效物的一種方法，其穿透度對(duì)植物提取作用影響較大。黃莉莉[17]探索了微波和超聲輔助提取銀杏葉有效成分過程中尺度的影響，通過理論分析微波和超聲波穿透深度的大小，確定兩種方法作用的尺度范圍，通過比較微波功率密度、輻射時(shí)間和料液比3個(gè)因素，發(fā)現(xiàn)在50 ℃以下，超聲波法提取率均明顯高于微波輔助提取法。

1.5 ?超臨界CO2提取法

何擴(kuò)[18]利用超臨界CO2提取法，提取率為3.27%，純度為64.7%;韓玉謙[19]等用超臨界CO2提取法，同樣條件下，采用乙醇提取法所得銀杏葉黃酮的提取率僅為2.56%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.1%，而超臨界CO2法得到的黃酮提取率提高到3.95%，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到35.28%。采用超臨界CO2提取銀杏黃酮，可大幅度提高提取效率 [20]，但由于工業(yè)化萃取設(shè)備的費(fèi)用較大，仍不適宜用于大規(guī)模提純銀杏葉黃酮。

另外，在銀杏葉黃酮提取過程中，還可添加其它化學(xué)物質(zhì)以增加收率等。例如，在體系中添加表面活性劑還可提高活性物質(zhì)的溶解度和溶出速度，提高活性物質(zhì)的收率，但所加化學(xué)助劑的殘留會(huì)對(duì)銀杏葉黃酮目標(biāo)活性產(chǎn)物造成污染，并未被廣泛采用。

2 ?銀杏葉黃酮的純化方法

采用前面所述提取方法所得到的銀杏葉提取物中黃酮含量偏低，達(dá)不到相應(yīng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，特別是藥用標(biāo)準(zhǔn)，還需要進(jìn)行進(jìn)一步精制純化，提高黃酮純度。純化銀杏黃酮最常用的方法是膜分離法、大孔樹脂和聚酰胺樹脂層析法。

2.1 ?膜分離法

膜分離是純化技術(shù)中較成熟穩(wěn)定的方法，也被用于純化銀杏葉黃酮研究中。XU Zhihong[21]采用自制的PVDF-PVP膜對(duì)銀杏葉提取物進(jìn)行精致提純，最終將黃酮純度從21.3%提高至34.8%，由于膜的制備采用氧化法，體系pH和壓力均對(duì)提取效果具有一定影響，pH的增加會(huì)導(dǎo)致提純效果變差。ZHU Minghang[22]采用超濾膜法純化銀杏葉黃酮，發(fā)現(xiàn)超濾膜MWCO（10 000 Dalton）效果最佳，可將銀杏黃酮純度從質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%提高到68%，溫度是影響提純效果的最大因素。贠延濱[23]則采用三步驟的膜分離技術(shù)進(jìn)行超濾提純銀杏葉黃酮粗提物，將黃酮的純度由24%提升到99.2%。膜分離能耗低，設(shè)備易放大;具有工藝簡(jiǎn)單、節(jié)能、成本低的優(yōu)點(diǎn)，且所得產(chǎn)品純度高，便于工業(yè)放大。

2.2 ?大孔樹脂法

由于大孔樹脂具有物化穩(wěn)定高、吸附容量大、選擇性好、易再生等特點(diǎn)，利用大孔樹脂對(duì)銀杏葉提取物進(jìn)一步純化的研究越來越受到關(guān)注。根據(jù)黃酮苷以及黃酮苷元的極性不同，采用不同濃度的乙醇-水溶液，利用大孔樹脂純化黃酮極為廣泛。吳梅林[24]用AB-8大孔吸附樹脂在pH =5、流速為1.0 mL/min、70%乙醇為洗脫劑純化銀杏葉總黃酮，純度提高至26%;吳昊[25]用S-8大孔樹脂，對(duì)粗黃酮粉純化，黃酮的純度達(dá)48.03%。倪力軍[26]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉中黃酮的含量對(duì)采用大孔樹脂純化銀杏葉具有重要影響，選用黃酮含量分別為1.0%、0.8%和0.6%的三批銀杏葉，研究發(fā)現(xiàn)0.6%黃酮含量的工藝參數(shù)最為敏感，提取物中黃酮含量與乙醇濃度和洗脫液體積成正相關(guān)，提取物得率與洗脫液體積負(fù)相關(guān)，并得到較佳的純化銀杏葉黃酮的工藝，在保持原料銀杏葉中的黃酮含量為1%左右時(shí)，以2倍質(zhì)量15%乙醇進(jìn)行洗脫，可獲得符合中國藥典要求的銀杏葉提取物。孫勝武[27] 建立了基于黃酮類銀杏葉提取物的特征圖譜和總黃酮醇苷含量的綜合評(píng)分法，用于評(píng)價(jià)銀杏葉提取物的質(zhì)量，使用AB-8大孔樹脂純化銀杏葉提取物，在體系pH=5.0，先后采用25%和75%乙醇洗脫，為銀杏葉提取物質(zhì)量的評(píng)價(jià)方式提供新思路。

2.3 ?聚酰胺樹脂層析法

王永剛[28]利用70%乙醇洗脫，經(jīng)聚酰胺樹脂純化洗脫后，黃酮純度可達(dá)到63.8%。ZHANG Jing[29]利用聚酰胺樹脂純化法，采用30%乙醇洗脫，黃酮純度提高可至55%。相比大孔樹脂，聚酰胺樹脂對(duì)銀杏葉黃酮的純化，具有更強(qiáng)的選擇性，具有更好的分離純化效果，但聚酰胺樹脂作為吸附劑，洗脫速度遲緩，且小分子量的聚酰胺容易霉變混入產(chǎn)品中，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定或下降。

此外，硅膠柱色譜、離子交換樹脂、離子液體/鹽雙水相體系和金屬絡(luò)合-解離法等也常用來作為銀杏黃酮的純化精制。

3 ?展 望

我國植物資源豐富，發(fā)展植物提取技術(shù)，對(duì)增加我國資源高效利用具有重要意義。全球?qū)︺y杏葉提取物的需求量日益增多，對(duì)銀杏葉黃酮的提取純度也有更高的要求，目前銀杏葉黃酮的提取和純化技術(shù)繁多[30，31]，基本能滿足醫(yī)藥食品等工業(yè)需求。此外，銀杏葉黃酮清除自由基的能力與其作為活潑氫供體的酚羥基有著密切聯(lián)系，銀杏葉黃酮的酚羥基基團(tuán)具有很強(qiáng)的還原能力，容易被氧化，在提取純化和放置過程中均有一定不穩(wěn)定性[32，33]，在以后的研究中可考慮采用適當(dāng)技術(shù)，如減少提取物與空氣氧氣接觸機(jī)會(huì)或加抗氧化劑，消除結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的影響。銀杏葉提取物在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用不僅要求銀杏葉黃酮含量達(dá)到一定值，還對(duì)其它副產(chǎn)物具有嚴(yán)格要求，如具有毒副作用的銀杏酸含量要低，對(duì)銀杏葉提取物的精密分離和分析技術(shù)同樣值得進(jìn)一步研究[34];隨著多學(xué)科技術(shù)交叉協(xié)作發(fā)展，銀杏葉黃酮的提取和純化技術(shù)將逐漸提高和完善。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐芳， 李杰， 毛宇， 等. 銀杏葉提取物的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā)， 2013， 34（16）： 124-127.

[2] 陳西娟， 王成章， 葉建中. 銀杏葉化學(xué)成分及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程， 2008， 42（4）：57-62.

[3] 陶鋒， 李向榮， 占潔. 黃酮醇類化合物提取分離方法的研究進(jìn)展[J]. 中藥材， 2008， 31（10）： 1586-1589.

[4] 閆高穎， 張必榮， 張敏， 等. 水浸法提取銀杏葉總黃酮工藝的研究[J]. 西北藥學(xué)雜志， 2016， 31（6）： 560-562.

[5] 薛志彬， 承偉. 銀杏葉黃酮提取工藝的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（10）：5751-5752.

[6] 賈長(zhǎng)英， 唐麗華， 張曉娟， 等. 銀杏葉黃酮的乙醇提取工藝優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械， 2012， 12（36）： 90-90.

[7] 王旭， 王志， 蔡夢(mèng)宇， 等. 纖維素酶Umcel9y-1在銀杏葉總黃酮提取中的增效作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 44（1）： 22-26.

[8] PURI M.， SHARMA D.， BARROW C. J. Enzyme-assisted extraction of bioactives from plants[J]. Trends in biotechnology， 2012， 30（1）： 37-44.

[9] 吳梅林， 周春山， 陳龍勝， 等. 酶法提取銀杏黃酮類化合物研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2004， 16（6）：557-560.

[10]CHEN Shuo， XING Xinhui， HUANG Jianjun， et al. Enzyme-assisted extraction of flavonoids from Ginkgo biloba leaves： Improvement effect of flavonol transglycosylation catalyzed by Penicillium decumbens cellulase[J]. Enzyme and microbial technology， 2011， 48（1）： 100-105.

[11] 吳昊， 宗志敏， 李秀秀. 超聲-微波協(xié)同萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的工藝研究， 中國釀造， 2016， 35（10）： 153-156.

[12] 盛瑋， 滕井通， 薛建平， 等. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取黃秋花中總黃酮工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（8）： 290-293.

[13] 徐春明， 王英英， 李婷， 等. 銀杏葉總黃酮的微波提取及生物利用度研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 2014， 34（4）：131-136.

[14]豁銀強(qiáng)， 尹杰， 陳雪. 銀杏葉黃酮的超聲波提取及其抗菌研究[J]. 食品工業(yè)， 2012 （5）：47-49.

[15] GAO Han，LIU Benguo ， NAN Haijuan， et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids with ethanol from ginkgo leaves by response surface methodology[C]. ITIME'09. IEEE International Symposium on. IEEE， 2009， 1： 1154-1157.

[16] 房磊. 超聲波輔助提取銀杏葉黃酮及體外抗運(yùn)動(dòng)氧化作用研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（17）： 153-157.

[17] 黃莉莉， 汪良峰， 崔政偉. 介尺度下微波和超聲波輔助提取銀杏黃酮的比較研究[J]. 食品科技， 2017，5：188-193.

[18] 何擴(kuò).超臨界CO2 萃取銀杏黃酮類物質(zhì)工藝的研究[D].西華大學(xué)，2006.

[19] 韓玉謙， 隋曉. 銀杏葉活性成分萃取工藝的研究[J]. 精細(xì)化工， 2000， （9）：505-506.

[20] 劉雯， 李素娟， 馬丹鳳. 超臨界CO2萃取銀杏葉中總黃酮醇苷的夾帶劑工藝條件[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 2017， 27（3）： 41-44.

[21] XU Zhihong， LI Lei， Wu Fawen， et al. The application of the modified PVDF ultrafiltration membranes in further purification of Ginkgo biloba extraction[J]. Journal of membrane science， 2005， 255（1）： 125-131.

[22] ZHU Minghang， YUN Yanbin， XIANG Wenyi. Purification of Ginkgo biloba flavonoids by UF membrane technology[J]. Desalination and Water Treatment， 2013， 51（19-21）： 3847-3853.

[23] 贠延濱.利用膜分離提純銀杏黃酮的方法： 中國， 102302522A（P）.2012-01-04.

[24]吳梅林， 周春山， 鐘世安， 等. 大孔吸附樹脂純化銀杏活性化合物的工藝研究[J]. 中南藥學(xué)， 2005， 3（2）：75-77.

[25]吳昊， 宗志敏， 石金龍. S-8大孔吸附樹脂分離純化銀杏黃酮的工藝研究[J]. 食品科技， 2013（4）：224-227.

[26]倪力軍， 顏瑋韜， 張立國. 銀杏葉黃酮含量對(duì)銀杏葉提取物大孔樹脂純化工藝條件的影響研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2017， 12：2097-2103.

[27]孫勝斌， 丁艷譜， 馮玉康， 等. 基于黃酮類特征圖譜和總黃酮醇苷含量?jī)?yōu)化AB-8大孔樹脂制備銀杏葉提取物工藝[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2017， 5：1134-1138.

[28]王永剛.銀杏總酮酯有效部位的制備工藝及質(zhì)量研究[D].山東大學(xué)，2010.

[29]ZHANG Jing， KHIZAR Hayat， ZHANG Xiaoming， et al. Separation and purification of flavonoid from ginkgo extract by polyamide resin[J]. Separation Science and Technology， 2010， 45（16）： 2413-2419.

[30]李保同， 徐永霞， 李娟， 等. 纖維素酶-微波輔助提取銀杏葉總黃酮及抗氧化性能研究[J]. 現(xiàn)代化工， 2016（3）： 67-70.

[31]金華， 鐘方麗， 李秀萍， 等. 杏葉黃酮活性炭脫色工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2017， 38（8）： 85-88.

[32]張光輝， 孟慶華， 龍旭， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助銀杏葉中黃酮的提取及其抗自由基活性研究[J]. 當(dāng)代化工， 2018（1）： 17-19.

[33]徐友， 王歡利， 汪貴斌， 等. 溫度和光照強(qiáng)度對(duì)銀杏葉黃酮合成的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 36（4）： 30-34.

[34]姚鑫， 薛平， 郁丹紅， 等. UPLC-MS/MS測(cè)定銀杏葉提取物中5種微量銀杏酸[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2017， 18： 174-179.