氣相色譜-質譜法測定苦苣菜、葡萄籽超臨界萃取物中的脂肪酸含量

張文 張琪瑋 閆君 張菁菁

摘 ?????要：通過氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對苦苣菜、葡萄籽的CO2超臨界萃取物進行成分分析，得到主要成分為脂肪酸類，對其脂肪酸建立定性定量方法，以準確分析其萃取物的脂肪酸含量。運用優(yōu)化的CO2超臨界萃取方法得到苦苣菜、葡萄籽提取物，通過氣質聯(lián)用儀及NIST譜庫對提取物進行成分分析，改進氣相色譜條件（色譜柱為HP-5msUI，分析時間為57 min），優(yōu)化質譜條件（單反應監(jiān)測模式和分段掃描），得到多種脂肪酸的定性定量方法。通過氣質聯(lián)用儀解析了苦苣菜CO2超臨界提取物的活性成分，脂肪酸測定方法對于植物提取物具有較好的線性關系（相關系數(shù)R均高于0.992 0）、回收率在80%～105%之間，定量限在0.002～0.010 g/kg之間，RSD均小于4.0%。測得苦苣菜萃取物中有20種脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.5%，葡萄籽萃取物中檢出了10種脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91.74%。脂肪酸測定方法操作簡便、靈敏度高，縮短了檢驗時間，適用于植物萃取物中脂肪酸的測定。解析了苦苣菜的活性成分，得到了苦苣菜、葡萄籽中脂肪酸的準確含量。

關 ?鍵 ?詞：GC-MS; CO2超臨界; 苦苣菜; 葡萄籽; 脂肪酸

中圖分類號：O657 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0876-05

Abstract： A method for the determination of fatty acids by gas chromatography-mass spectrometry was established to analyze the fatty acids in the supercritical CO2 extracts of Sonchus oleraceus L. and grape seeds. By using the improved gas chromatography conditions （HP-5msUI column was adopted and analysis time was 57 min.）， the optimized mass spectrometry conditions （selected ion monitoring mode and segment detection） were used to analyze the types and contents of fatty acids of supercritical CO2 extracts of Sonchus oleraceus L. and grape seeds. This method had a good linear relationship， the correlation coefficient（R）was above 0.992 0， the recoveries were within 80%～105%， the RSD of precision was less than 4.0%，the quantitative limit was between 0.002 and 0.010 g/kg. It was found that there were 20 kinds of fatty acids in that extract of the Sonchus oleraceus L.， the unsaturated fatty acid accounted for 83.5% of the total fatty acid， 10 kinds of fatty acids were detected in the grape seed extract， and the unsaturated fatty acid accounted for 91.74% of the total fatty acid. The method is simple and sensitive， and it can reduce the cost of testing， shorten the testing time. It is applicable to the determination of fatty acids in plant extracts.

Key words： GC-MS; Supercritical CO2 fluid extraction; Fatty acid; Sonchus oleraceus L.; Grape seeds

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.），又名北敗醬，是菊科（Compositae）苦苣菜屬（Sonchus）兩年或多年生草本植物，作為中藥材曾收載于《中國藥典》[1，2]，具有清熱解毒、消腫排膿、益肝利尿等功效，還具有抗腫瘤、治療急性痢疾等作用[2-5]，在民間它被稱做滇苦菜、苦苦菜、野芥子等，作為野菜食用歷史悠久[1，2]。已報道的關于苦苣菜的研究，主要集中于其化學成分的分析及藥理實驗[6，7]，對苦苣菜營養(yǎng)成分的研究鮮有報道。本實驗通過CO2超臨界儀對苦苣菜進行萃取，運用GC-MS對其成分進行解析，得到脂肪酸類化合物為其主要成分之一，在此基礎之上，建立苦苣菜中脂肪酸的測定方法，為其開發(fā)應用及成分的解析奠定了基礎。

葡萄籽油脂含量較高，特別是不飽和脂肪酸——亞油酸含量高達58%～78%，是良好的油料作物之一，近年葡萄籽油提取工藝的相關研究已較完善[8，9]，而其中脂肪酸的組成及每種脂肪酸的準確含量，是評價葡萄籽油品質優(yōu)劣以及真假的主要因素[10，11]，因此，準確定性定量脂肪酸為進一步開發(fā)葡萄籽、豐富營養(yǎng)資源能提供理論依據(jù)。

目前，脂肪酸的檢測方法為《GB5009.168- 2016》[12]，而植物提取物成分較復雜，對脂肪酸的干擾雜質較多，在日常工作中還存在分析時間長（85 min）、耗材特殊（氣相色譜柱為100 m的專屬柱）、部分脂肪酸色譜峰重合、不易分離等問題。已報道的脂肪酸方法為通過GC-MS的面積歸一化法測其總含量，或者通過譜庫檢索單一脂肪酸，但該法定性存在一定誤差。本試驗通過GC-MS建立脂肪酸的單離子檢測掃描（SIM）方法，優(yōu)選出脂肪酸的特征離子，采用分時間段掃描，避開同系物的干擾，能夠準確測定植物提取物（低油脂的苦苣菜、高油脂的葡萄籽）中的脂肪酸含量。本方法具有較高靈敏度、檢出限低、分離效果好、分析時間短、定量準確，適用于天然產物提取物中脂肪酸的準確定性定量檢測，為天然產物的脂肪酸研究開發(fā)奠定基礎。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器與試劑

儀器：7890B/7000D氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），Sp-ed超臨界萃取設備（美國應用分離公司），RV10旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司），Centrifuge 5810R超低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），Milli-Q IQ7000超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），BSA224S-CW電子天平（德國Sartorius公司）;SCG-6智能恒溫槽（寧波新芝），MS3 digital渦旋混合器（德國IKA公司），微孔濾膜0.22 μm有機系濾膜。

實驗試劑：37種脂肪酸甲酯混合標準溶液（批號XA17032V，Sigma-Aldrich公司）、單個脂肪酸甲酯對照品（Dr.Ehrensorfer GmbH，純度均98.5%），正庚烷（色譜純）、異辛烷（色譜純）、氫氧化鉀、甲醇、無水硫酸鈉、硫酸氫鈉、無水乙醇。

樣品為甘肅產裂葉苦苣菜、紅提葡萄籽。

1.2 ?方法

1.2.1 ?對照品溶液的制備

精密量取1.00 mL脂肪酸甲酯混合標準溶液移至10 mL容量瓶中，精密稱取10 mg單個脂肪酸甲酯對照品于10 mL容量瓶中，分別用正庚烷稀釋定容，貯存于-18 ℃冰箱中。低濃度標準溶液以此為母液進行相應的稀釋。

1.2.2 ?色譜條件

色譜柱：HP-5msUI（30 m×250 μm，0.25 μm）;載氣：高純氮氣;流量1 mL/min;進樣量：1 μL;進樣口：250 ℃;平衡時間0.5 min;隔墊吹掃3 mL/min;壓力10.523 psi，不分流;升溫程序：

100 ℃（5 min） 10 ℃/min 180 ℃（3 min） 2 ℃/min 200 ℃（10 min） 5 ℃/min 230 ℃（15min）。

1.2.3 ?質譜條件

電離模式：電子轟擊源（EI），電子能量70 eV;離子源溫度：230 ℃;傳輸線溫度：280 ℃;溶劑延遲時間：2.5 min;離子監(jiān)測模式：單反應監(jiān)測模式（SIM）;選擇離子監(jiān)測方式的質譜參數(shù)見表1。

1.2.4 ?樣品處理過程

樣品制備：分別稱取苦苣菜、葡萄籽在50 ℃恒溫下干燥10～12 h至干燥，粉碎至40～200目待用。

CO2超臨界萃取條件：分別稱取15 g干燥粉碎后的苦苣菜、葡萄籽粉末，填充于萃取釜內，萃取條件為：CO2流量17～20 kg/h，分離釜Ⅰ溫度35 ℃，分離釜Ⅱ溫度45 ℃，萃取溫度40 ℃，萃取壓力25 MPa，萃取時間120 min[13，14]。萃取制得苦苣菜、葡萄籽的超臨界萃取物。

樣品前處理：將提取物（粉末或膏狀物）準確稱取適量（50 mg左右）至具塞試管中，加入4.0 mL異辛烷溶解試樣，使試樣溶解后加入 200 μL 氫氧化鉀甲醇溶液（2 mol/L），蓋上玻璃塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后，將上層溶液移至上機瓶中，過0.22 μm有機濾膜，待測。

2 ?結果與討論

2.1 ?GC-MS對超臨界提取物的成分分析

用正己烷將苦苣菜超臨界提取物稀釋100倍后進氣質聯(lián)用儀進行分析，設置氣相溫度為50 ℃至320 ℃，覆蓋各物質出峰的溫度范圍，全掃描（SCAN）模式下的掃描范圍為（m/z）50～550，運用NIST譜庫檢索所有峰，得到有效的成分見表2。通過GC-MS得到苦苣菜超臨界提取物的主要成分為：植醇、新植二烯、脂肪酸類、維生素E、谷甾醇、白樺脂醇、羽扇醇酯類等。

2.2 ?色譜條件

根據(jù)脂肪酸甲酯的沸點，選取色譜柱的起始溫度為60、80、100 ℃進行比較，發(fā)現(xiàn)脂肪酸甲酯的分離、峰形在這三種溫度下不受影響，僅色譜峰的保留時間因起始溫度升高而延后，為了縮短檢測時長，選擇起始溫度為100 ℃，并優(yōu)化了程序升溫的條件（1.2.2）。1.2.2的方法與國標中的升溫條件相比，第二、三段升溫速率較國標中快，且每一段的保留時間均縮短，但對峰形及分離度沒有影響，本法較國標方法縮短了分析時間。然而由于本試驗使用HP-5msUI色譜柱，對丁酸甲酯、己酸甲酯有所影響，但對于植物提取物的分析能夠滿足要求。另外順-15-二十四碳一烯酸甲酯出峰時間較遲，延長230 ℃下的升溫時間也未檢測到該物質峰，使用HP-88的色譜柱也未檢測到，分析原因為該物質的響應較小，應加大該物質的檢測濃度和提高儀器的靈敏度。脂肪酸混合標準溶液的總離子流圖見圖1。

2.3 ?質譜條件

脂肪酸甲酯在色譜柱上的出峰時間與碳鏈長短相關，同分異構體的脂肪酸只是空間結構不同，化學、物理性質相似，因此出峰時間重疊，很難分離，采用質譜的選擇離子監(jiān)測（SIM）模式，找出每種脂肪酸的特征離子，并通過時間段將多種脂肪酸分段采集，可較好分離每種脂肪酸，特征離子見表2。

2.4 ?標準曲線及檢出限

用正庚烷稀釋混合標準儲備液，配制為0、25、50、100、200、400、600、800 μg/L的31種脂肪酸混合標準溶液，在所述色譜和質譜條件下測定，記錄峰面積，繪制峰面積-濃度標準曲線，并計算各脂肪酸線性回歸方程及相關系數(shù)。在相應的濃度范圍內，31種脂肪酸線性良好，相關系數(shù)R均在0.9920以上。以S/N≥10確定31種脂肪酸的定量限，線性方程及定量限見表3。

2.5 ?回收率及樣品測定

采用本方法對苦苣菜、葡萄籽的超臨界提取物進行測定，苦苣菜提取物中檢出了20種脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.5%，葡萄籽提取物中檢出了10種脂肪酸，順，順-9，12-十八碳二烯酸甲酯、順-9-十八碳-烯酸甲酯含量高達68.41%，10.41%，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91.74%。

精密稱取苦苣菜提取物，添加如表4的脂肪酸甲酯混合標準溶液，按照前處理方法處理加標樣品，并對加標樣品進行重復性試驗（n=6），計算回收率和RSD，結果見表4。得到31種脂肪酸的回收率在80%～105%之間，重復性在1.3%～3.9%之間。

3 ?結 論

本實驗建立了植物提取物中脂肪酸的氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定方法，該方法改進了氣相條件，優(yōu)化了質譜條件，解決了復雜樣品中脂肪酸的測定時雜質干擾的問題，具有較好得回收率，定性、定量準確。并對甘肅產苦苣菜、葡萄籽的超臨界提取物進行測定，得到苦苣菜提取物中含有20種脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.5%，葡萄籽提取物中檢出了10種脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91.74%。

參考文獻：

[1]夏正祥，唐中艷，梁敬鈺，等. 苦苣菜屬植物化學成分與藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志， 2012，18（14）：300-302.

[2]崔文燕，劉素香，宋曉凱等. 黃花敗醬草和白花敗醬草的化學成分與藥理作用研究進展[J]. 藥物評價與研究， 2016，39（3）：482-488.

[3]Ting Huyan， Qi Li， Yi-Lin Wang， et al. Anti-tumor effect of hot aqueous extracts from Sonchus oleraceus （L.） L. and Juniperus sabina L-Two traditional medicinal plants in China[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2016， 185： 289-299.

[4]O. Kenny， T.J. Smyth， D. Walsh， et al. Investigating the potential of under-utilised plants from the Asteraceae family as a source of natural antimicrobial and antioxidant extracts[J]. Food Chemistry， 2014， 161： 79-86.

[5]Mohamed ZM Salem， Hayssam M Ali， Nader A El-Shanhorey，et al. Evaluation of extracts and essential oil from Callistemon viminalis leaves：Antibacterial and antioxidant activities， total phenolic and flavonoid contents[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine， 2013， 6 （10）： 785-791.

[6]王金蘭， 王丹， 李軍， 等. 中華苦荬菜中的新三萜[J]. 中草藥，2015， 46 （22）： 3304-3309.

[7]Kyung-su Kima， Won-Gul Hwang， Hong-Gi Jang，et al. Assessment of Indigo （Polygonum tinctorium Ait.） water extracts bioactive compounds， and their antioxidant and antiproliferative activities[J]. LWT - Food Science and Technology， 2012， 46 （2）： 500-510.

[8]王麗娟，楊宋琪，郭興霞，等. 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取葡萄籽中油脂及其脂肪酸成分分析[J]. 糧食與油脂，2018，31（3）：49-51.

[9]魏玲玲，陳競男，王杰. 葡萄籽中油脂脂肪酸和蛋白質組分分析[J].糧食與油脂，2017，30（12）：65-68.

[10]田翔，喬治軍，田琴，等. 氣相色譜-質譜法定性定量測定糜子中的脂肪酸[J]. 食品科學，2016，37（14）：128-131.

[11]劉明，魏芳，謝亞， 等. 基于衍生化技術的游離脂肪酸的色譜-質譜分析方法研究進展[J].分析測試學報，2017，36（10）：1269-1278.

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5009.168-2016 食品中脂肪酸的測定[S]. 北京：中國標準出版社，2016.

[13]瞿研， 賀成， 張建軍， 等. 超臨界 CO2 萃取阿薩伊油的工藝優(yōu)化及 GC-MS 分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2018， 39 （9）： 257-261.

[14]張紅英，姚元虎，顏雪明. 超臨界流體萃取分離技術及其應用[J]. 首都師范大學學報： 自然科學版，2016，37