基于半仿生酶解技術(shù)的中藥烏賊墨最佳用酶初步篩選

陶然 劉金虎 毛會秀 呂迎蘭 王婭玲 李佳懌 王舒玉 王集會 張珊珊

摘 ?????要：以體外抗腫瘤實驗為指標(biāo)，初步確定中藥烏賊墨的最佳用酶。用人胃腸道系統(tǒng)中的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，彈性蛋白酶酶解烏賊墨，以烏賊墨水提液為對照組，在茚三酮顯色法測定水解度的基礎(chǔ)上，采用四唑鹽（MTT）比色法研究四種蛋白酶酶解液對肺腺癌細胞株A549的抑制作用，初步篩選出最佳用酶。四種蛋白酶酶解中藥烏賊墨后的蛋白質(zhì)水解度分別為胰蛋白酶5.12%，胃蛋白酶4.61%，胰凝乳蛋白酶2.09%，彈性蛋白酶0.32%?？鼓[瘤實驗結(jié)果表明：胰蛋白酶酶解液在藥物濃度0.4～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，細胞抑制率均在85%～95%。其他三種酶解液的抑制率在各實驗濃度范圍內(nèi)均未超過30%。通過半仿生酶解技術(shù)，初步篩選出酶解中藥烏賊墨的最佳用酶為胰蛋白酶。

關(guān) ?鍵 ?詞：中藥烏賊墨;水解度;抑制率;最佳用酶

中圖分類號：R282.77 ??????文獻標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0738-04

Abstract： ?In order to determine the optimum enzyme of Chinese traditional medicine cuttlefish ink by anti-tumor experiment in vitro， the squid ink was hydrolyzed by trypsin， chymotrypsin， pepsin and elastase in human gastrointestinal system. And then using the squid ink extract as control group， the hydrolysis degree was determined by ninhydrin chromogenic method. The inhibitory effects of four protease hydrolysates on lung adenocarcinoma cell line A549 were studied by tetrazolium （MTT） colorimetry. The results showed that the degrees of protein hydrolysis of Chinese squid ink by enzymatic hydrolysis of trypsin， pepsin， chymotrypsin and elastase were 5.12%， 4.61%， 2.09% and 0.32%. The results of antitumor experiment showed that the inhibition rate of trypsin enzymatic hydrolysis solution in the range of 0.4～1.4 mg·mL-1 was in the range of 85%～95%，while the inhibition rates of the other three kinds of enzymatic hydrolysates were not more than 30% in each range of experimental concentration. So the trypsin was screened out as the best enzyme for enzymatic hydrolysis of squid ink.

Key words： Chinese medicine squid ink; Degree of hydrolysis; Inhibition rate; Optimum enzyme

烏賊（Sepia），本名烏鲗，又稱花枝、墨斗魚或墨魚，屬于軟體動物門頭足綱烏賊目烏賊科的一種海洋動物[1]。烏賊種類繁多，分布于中國福建南部、廣東，日本海域。烏賊墨作為一種中藥，文獻上早有記載，《本草拾遺》中有：“腹中墨，主治血刺心痛”。在《本經(jīng)》中有記載：“可收斂止血，固精止帶，制酸定痛，除濕斂瘡”?，F(xiàn)代臨床證明它是一種良好的止血用藥，且無明顯副作用[2]。近代研究表明烏賊墨還具有抗腫瘤，抗氧化，抗輻射，抗菌，促造血及調(diào)血脂功能等作用[3]。

海洋動物藥是中醫(yī)藥的重要組成部分，其用于防治疾病已有幾千年的歷史。海洋藥物通常具有多咸、多寒的藥性特點，其成分除了常見的萜類、生物堿、甾醇之外，還有一些特殊結(jié)構(gòu)的成分，如多鹵素取代結(jié)構(gòu)，多氧、氮結(jié)構(gòu)[4]。

中藥經(jīng)口服進入人體后，其消化和吸收除了pH的調(diào)節(jié)外，還有多種酶在起著催化作用。半仿生-酶法就是模擬胃腸道的環(huán)境和運行原理，用適當(dāng)?shù)拿笇λ幬镞M行酶解，得到含指標(biāo)成分較高的“活性混合物”的一種新型提取方法，為中藥及其復(fù)方研究提供新思路[5]。

為了篩選出酶解中藥烏賊墨的最佳用酶，本文應(yīng)用半仿生技術(shù)，模擬胃腸道的環(huán)境和運行原理，用胃中的胃蛋白酶，胰臟中的彈性蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解烏賊墨，并以烏賊墨水提液為對照組，運用半微量凱氏定氮法和茚三酮顯色法測定蛋白酶酶解液中蛋白質(zhì)的水解度;將酶解液制成凍干粉，用其配制成一系列不同濃度的藥液，運用MTT比色法測定藥物對肺腺癌細胞株A549的抑制率，優(yōu)選出酶解烏賊墨的最佳用酶[6]。為今后烏賊墨的活性組分和生產(chǎn)工藝研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 ?實驗部分

1.1 ?試藥及細胞

烏賊墨粉（購自安徽省亳州市的中國（亳州）中藥材交易中心，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為烏賊科動物無針烏賊和金烏賊等烏賊墨囊中的墨汁）。

肺腺癌A549細胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 ?實驗方法

2.1 ?半微量凱氏定氮法測定烏賊墨粉總氮量

稱取0.08 g烏賊墨粉于干燥的50 mL凱氏燒瓶中，依次加入0.30 g硫酸鉀、5滴30%硫酸銅溶液、2.0 mL硫酸;用小火緩緩加熱，氣泡消失后，逐步加大火力，待溶液變成澄明的綠色，繼續(xù)加熱10 min，停止加熱，放置冷卻，加入2 mL水。取40 mL 2%硼酸溶液于100 mL錐形瓶中，加5滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示液，將冷凝管尖端插人液面下。將凱氏燒瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)入蒸餾瓶中，加入10 mL 40%氫氧化鈉溶液，進行蒸氣蒸餾，至硼酸液變?yōu)樗{綠色后，繼續(xù)蒸餾約10 min，將冷凝管尖端提出液面使蒸氣繼續(xù)沖洗1 min后停止蒸餾。餾出液用硫酸滴定液滴定至溶液由藍綠色變?yōu)榛易仙玔7]。做空白對照，平行三次實驗。根據(jù)每1 mL硫酸滴定液（0.005 mol·L-1）相當(dāng)于0.140 1 mg的N，計算出1 g烏賊墨粉中的總氮量。

2.2 ?烏賊墨酶解液的制備

精密稱取烏賊墨粉1.000 0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為8，超聲提取30 min，37 ℃加熱4 h，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min、溫度4 ℃條件下，離心15 min，抽濾，定容至100 mL容量瓶中，制得烏賊墨水提液。按表3制備四種蛋白酶酶解液。每組進行三次平行試驗。

2.3 ??烏賊墨酶解液含量測定

2.3.1 ?甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g，配制成1 mg·mL-1的甘氨酸溶液，取2.00 mL定容至100 mL容量瓶，取1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL容量瓶，配成濃度為2、4、6、8、10 ?g·mL-1甘氨酸的稀釋液，取2 mL各稀釋液于具塞試管中，同時做空白對照，加入1.00 mL茚三酮顯色劑，充分混勻，放置100 ℃水浴鍋中加熱15 min，冷水冷卻置室溫，加入5 mL 40%乙醇溶液混勻，靜置15 min后，在570 nm波長下測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 ?烏賊墨酶解液含量的測定

取“2.2”項制備的蛋白酶酶解液適量，稀釋到適宜濃度，按“2.3.1”項茚三酮顯色法測定蛋白酶酶解液的吸光度。將吸光度帶入甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出蛋白酶酶解液中甘氨酸的含量，從而計算得到氨基態(tài)氮的含量，根據(jù)水解度和1 g烏賊墨粉總氮量計算四種蛋白酶酶解液中蛋白質(zhì)的水解度。

式中：A—烏賊墨粉總氮數(shù);

B—烏賊墨蛋白酶酶解液中游離的氨基態(tài)氮數(shù);

C—烏賊墨水提液中游離的氨基態(tài)氮數(shù)。

2.4 ?MTT法測定烏賊墨凍干粉對肺腺癌細胞株A549的抑制作用

2.4.1 ?烏賊墨藥物的配制

按“2.1”項制得烏賊墨的水提液和蛋白酶酶解液，凍干后精密稱取凍干粉10 mg，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，加入RPMI-1640培養(yǎng)基至藥物濃度為2 mg·mL-1，然后在無菌環(huán)境中用0.22 μm的濾膜過濾，用已濾菌的1640培養(yǎng)基依次稀釋，配成 1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg·mL-1的藥物濃度梯度。

2.4.2 ?細胞鋪板和加藥

取對數(shù)增長期的人肺癌A549細胞，經(jīng)胰酶消化后，用計數(shù)板細胞計數(shù)，以100 μL·孔-1接種于96孔平底培養(yǎng)板中，空出板的邊緣孔，板的上方預(yù)留調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細胞。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)24 h;至細胞生長旺盛貼壁后，去掉培養(yǎng)基，加藥孔每孔加入100 μL藥液，每個藥物濃度重復(fù)4次，空白孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，陽性對照為100 μL 100 μg·mL-1的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4.3 ??MTT比色法測定細胞抑制率

吸去上清液，在避光條件下，每個孔加入20 μL，5 mg·mL-1的MTT溶液，在37 ℃條件下孵育4 h，然后吸盡上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，輕輕拍打板壁，至沉淀完全溶液后，用酶標(biāo)儀在波長492 nm下測定OD值，進而計算細胞抑制率[8]。

3 ?實驗結(jié)果

3.1 ?甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用茚三酮顯色法，在波長為570 nm下測定甘氨酸的吸光度，以甘氨酸的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

3.2 ?烏賊墨酶解液的含量測定

根據(jù)半微量凱氏定氮法測得1 g烏賊墨粉的總氮量為57.09 mg。根據(jù)表4可知，胰蛋白酶對烏賊墨的酶解效果最佳，其氨基態(tài)氮含量為5.162 7 mg·g-1，DH為5.12%，其次是胃蛋白酶，氨基態(tài)氮含量為4.879 5 mg·g-1，DH為4.61%，胰凝乳蛋白酶氨基態(tài)氮含量為3.503 6 mg·g-1，DH為2.09%，彈性蛋白酶對烏賊墨的酶解效果最差，氨基態(tài)氮含量為2.3584 mg·g-1，水解度僅為0.32%。

3.3 ?MTT法測定烏賊墨酶解產(chǎn)物對肺腺癌細胞株A549的抑制作用

通過測定細胞抑制率可以反映藥物對細胞增殖的影響。圖1為5種條件下的酶解液對肺腺癌細胞株A549的抑制率，由圖可知，胰蛋白酶酶解液對肺腺癌細胞A549的抑制效果最為顯著，藥物濃度在0.4 mg·mL-1時，細胞抑制率就有了大幅度的提升。隨著藥物濃度的升高，均有顯著的抑制作用。彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶酶解液及無酶的烏賊墨水提液對肺腺癌細胞A549的抑制作用微小，其細胞抑制率均為超過30%。

4 ?結(jié) 論

烏賊墨的主要化學(xué)成分是黑色素和蛋白多糖復(fù)合體。20世紀(jì)90年代，日本弘前大學(xué)醫(yī)學(xué)部和青森縣產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)中心用大白鼠所做的動物實驗表明，烏賊墨含有抗癌物質(zhì)，據(jù)分析這是一種蛋白質(zhì)，脂肪等與糖結(jié)合的復(fù)合多糖，從而使得烏賊墨抗腫瘤的研究成為新的熱點[9]。近年來的研究證實，烏賊墨中的黑色素、肽聚糖、寡肽均有抗腫瘤作用。烏賊墨的抗腫瘤活性主要通過免疫系統(tǒng)作用而產(chǎn)生，包括影響免疫細胞活性，影響細胞內(nèi)蛋白激酶活性等[10]。半仿生–酶法模擬胃腸環(huán)境，使溫度更加接近人的體溫，克服了高溫提取導(dǎo)致有效成分被破壞等問題。在中藥提取加入適當(dāng)?shù)拿敢云骗h(huán)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以促進中藥中有效成分的溶出[5]。

通過本實驗結(jié)果顯示，四種酶對中藥烏賊墨均有一定的酶解作用，其水解度大小依次為胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶;但經(jīng)四種蛋白酶酶解后的烏賊墨酶解液的蛋白質(zhì)水解度均未超過10%。利用MTT法對其抗腫瘤效果進行了研究發(fā)現(xiàn)，四種蛋白酶酶解液對肺腺癌細胞A549的抑制率大小依次為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、胃蛋白酶;其中胰蛋白酶酶解液的抗腫瘤作用最為顯著，在藥物濃度為0.4 mg·mL-1時，抑制作用大幅度提升，隨著藥物濃度的增加，均有較好的抑制作用。分別用胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶酶解后的產(chǎn)物對肺腺癌細胞株A549的抑制作用較差，細胞抑制率在10%～30%之間波動。烏賊墨經(jīng)胃蛋白酶酶解后的水解度與經(jīng)胰蛋白酶酶解后的相近，但在藥理活性上卻有著很大的差異，在藥物濃度0.2～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，胃蛋白酶酶解液對細胞的抑制率均未超過50%，對肺腺癌細胞株A549抑制作用極低。胃蛋白酶的抗腫瘤作用最差，可能是因為經(jīng)胃蛋白酶酶解后黑色素等具有抗腫瘤作用的活性物質(zhì)沉淀而被過濾掉。在實驗過程中，胃蛋白酶酶解后的粗解液經(jīng)離心抽濾后得到的酶解液接近透明，無色。而胰蛋白酶的酶解液粘稠，顏色墨黑。其原因是胃蛋白酶的酶解pH為2，胰蛋白酶的酶解pH為8，而烏賊墨中的黑色素可溶于堿性溶液，在酸性環(huán)境下會產(chǎn)生沉淀[11]。通過實驗研究，推測烏賊粉中抗腫瘤物質(zhì)可能是經(jīng)胰蛋白酶酶解后產(chǎn)生的小分子肽等具有抗腫瘤的活性物質(zhì)。胰蛋白酶酶解后的烏賊墨酶解液具有較好的水解度和體外抗腫瘤活性，初步篩選為中藥烏賊墨的最佳用酶。

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