大白菜非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)影響因素研究

張紅　徐瑩莉　黃志銀　李梅　范偉強(qiáng)　王超楠

摘要 電泳技術(shù)是分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵步驟，建立一套高效的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)體系可提高分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的工作效率。以根腫病抗感大白菜作為試材，以凝膠聚合速度及凝膠條帶的清晰度作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)電泳中的凝膠濃度、溫度、促凝劑配比3個(gè)重要因素進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠濃度、溫度、促凝劑配比均與凝膠聚合時(shí)間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但4種常用凝膠濃度制膠時(shí)間差異不明顯，可主要根據(jù)目的產(chǎn)物的大小選擇濃度。在凝膠質(zhì)量方面，溫度、促凝劑配比與凝膠的脆性呈負(fù)相關(guān)。綜合分析，操作中環(huán)境溫度為25～35 ℃，促凝劑配比為1∶10的條件，聚合速度適中，條帶清晰，檢測效果最佳。

關(guān)鍵詞 非變性聚丙烯凝膠電泳;凝膠濃度;溫度;促凝劑配比;大白菜

中圖分類號(hào) S332.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）21-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research on Influence Factor of Non Denatured PAGE Technology of Chinese Cabbage

ZHANG Hong1，XU Yingli2，HUANG Zhiyin1 et al

（1.Tianjin Kernel Institute of Vegetables，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation，Tianjin Vegetable Genetics and Breeding Enterprise Key Laboratory，Tianjin 300381; 2.Life Science College of Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract The electrophoresis technology is the key step in the molecular marker assisted breeding technology.Establishing a set of effective system of modified polyacrylamide gel electrophoresis technology could improve the working efficiency of the molecular marker assisted breeding technology.Taking Chinese cabbage with resistance to club root as test materials，polymerization time to gel and the definition of the gel strips as standards，the concentrations of the gel temperature and ratio of coagulant were studied.Found that the gel concentration，temperature，ratio of coagulant were negatively correlated with gel time，but the differences of gel time by four kinds of commonly used gel concentration were not obvious，we can choose the concentration mainly according to the size of the objective.In terms of gel quality，the temperature and the ratio of coagulant were negatively correlated with the brittleness of the gel.Therefore，comprehensive analysis showed that the polymerization speed was moderate，the strip was clear，and the detection effect was the best when? the environmental temperature was 25-35 ℃，the ratio of coagulant promoter was 1∶10.

Key words Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis;Gel concentration;Temperature;The ratio of coagulant;Chinese cabbage

基金項(xiàng)目 青年科研人員創(chuàng)新研究與實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2018013，2018003，201913）;天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)計(jì)劃（ITTVRS2017003）。

作者簡介 張紅（1990—），女，天津人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事大白菜分子育種研究。通信作者，副研究員，從事十字花科蔬菜育種研究。

收稿日期 2019-07-25

隨著分子生物學(xué)與信息學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（marker assisted selection，MAS）應(yīng)運(yùn)而生，它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種周期長、篩選靠經(jīng)驗(yàn)等不足，不僅大大縮短了新品種的選育進(jìn)程，降低了選育過程中的工作量，而且從基因水平上確保了篩選的準(zhǔn)確性，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水稻[1]、小麥[2]、白菜[3]、辣椒[4]等農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)作物品種的選育中。分子標(biāo)記輔助選育過程中關(guān)鍵步驟就是對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，對(duì)于操作者來說，熟練掌握相關(guān)檢測技術(shù)至關(guān)重要。目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法主要是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），瓊脂糖凝膠操作過程更為簡便，初學(xué)者較易掌握，但它適用于長度200 bp至近50 kb的DNA，對(duì)于小片段DNA的檢測分辨率差;聚丙烯酰胺凝膠電泳則適用于高通量的樣本檢測，對(duì)于分離5～500 bp的DNA效果更佳，分辨率更好。黃烈健等[5]認(rèn)為在進(jìn)行近等基因系的差異分析時(shí)，SSR類型的標(biāo)記比RAPD標(biāo)記更具有優(yōu)勢性。而針對(duì)SSR類型的分子標(biāo)記，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠高效地檢測出單拷貝的差異，因此該檢測方法在實(shí)踐應(yīng)用中選擇率更高。但它的操作過程相對(duì)更為繁瑣，制膠、跑膠、染膠過程影響成敗的因素也復(fù)雜，國內(nèi)對(duì)此的相關(guān)研究主要集中在染膠方法的改進(jìn)[6]，對(duì)制膠影響因素的關(guān)注相對(duì)缺乏，初入實(shí)驗(yàn)室的研究者很難自主掌握規(guī)律。

中，凝膠質(zhì)量最佳。

凝膠濃度、操作環(huán)境溫度、促凝劑配比等都會(huì)影響凝膠聚合速度和凝膠檢測效果。該試驗(yàn)從凝膠聚合速度和檢測效果出發(fā)，綜合研究了3個(gè)主要因素[14-15]的作用，發(fā)現(xiàn)凝膠濃度對(duì)聚合時(shí)間的影響較小，但它決定著形成分子篩的孔徑大小，通過影響目的產(chǎn)物的通過，從而影響檢測效果。相比而言，制膠過程中的溫度和促凝劑配比對(duì)聚合速度及檢測效果影響明顯，實(shí)驗(yàn)室批量操作，建議選擇25～35 ℃，APS∶TEMED配比1∶10的試驗(yàn)條件，凝膠聚合時(shí)間大約在8 min，不僅能有效縮短制膠時(shí)間，而且跑膠讀帶效果清晰。

47卷21期 張 紅等 大白菜非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)影響因素研究

參考文獻(xiàn)

[1] 張薈，周鵬，涂詩航，等.利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)創(chuàng)制抗稻瘟病水稻新恢復(fù)系[J].分子植物育種，2015，13（9）：1918-1922.

[2] 呂學(xué)蓮，白海波，惠建，等.分子標(biāo)記輔助選擇小麥抗白粉病及優(yōu)質(zhì)基因聚合體[J].分子植物育種， 2017，15（4）：1378-1384.

[3] 饒立兵，胡齊贊，余小林，等.大白菜抽薹性狀相關(guān)SSR分子標(biāo)記的篩選[J].分子植物育種，2015，13（8）：1786-1793.

[4] 李怡斐，蔣曉英，張世才，等.加工型辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性基因分子標(biāo)記及輔助育種[J].分子植物育種，2016，14（4）：946-952.

[5] 黃烈健，向道權(quán).玉米Ht近等基因系的RAPD、SSR分子標(biāo)記比較研究[J].玉米科學(xué)，2003，11（3）：31-33.

[6] 李西平，錢新華，姚英民，等.DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法的選擇[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（9）：1072-1074.

[7] 王濤，王超楠， 張紅，等.大白菜基因組DNA快速提取方法的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，32（6）：67-72.

[8] 梁玉琴，李芳東，傅建敏，等.柿屬植物基因組DNA提取方法比較[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：170-173.

[9] 李委，戴祖云，夏偉偉，等.一種快速提取南瓜大群體基因組DNA的方法[J].中國蔬菜，2017（9）：36-40.

[10] 張紅，張斌，聞鳳英，等.大白菜根腫病的遺傳規(guī)律及抗病基因定位研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，32（4）：60-66.

[11] 許麗，李玥瑩，鄒劍秋，等.高粱微衛(wèi)星非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：328-329.

[12] 李霞斌，孫興旺.變性聚丙烯酰胺凝膠制備體會(huì)[J].西南軍醫(yī)，2010，12（3）：483.

[13] 梁寶萍，原玉香，樸鳳植，等.大白菜非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的優(yōu)化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：129-132.

[14] 張海添，陸云飛，李衛(wèi)，等.采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物的觀察[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（6）：894-896.

[15] 吉家敏，夏志強(qiáng)，鄒枚伶，等.木薯SSR標(biāo)記非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件的優(yōu)化[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：34-36.