Ⅱ型豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

劉運(yùn)鎮(zhèn)　桂文龍　溫思怡　謝昕芳

摘要 2018年8月，江蘇省蘇中地區(qū)某豬場(chǎng)出現(xiàn)疑似感染豬鏈球菌，病理剖檢可見發(fā)病豬表現(xiàn)為腦膜、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)出血腫脹，關(guān)節(jié)腔有纖維素性滲出物等病理變化，取鼻、肺、腦等組織進(jìn)行細(xì)菌鮮血培養(yǎng)基分離培養(yǎng)24 h可見不同的溶血現(xiàn)象;染色鏡檢可見紫色成對(duì)、短鏈或長(zhǎng)鏈排列的球菌;生化試驗(yàn)對(duì)乳糖、海藻糖、七葉苷產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甘露醇、山梨醇等不反應(yīng);經(jīng)PCR檢測(cè)最終確診該豬場(chǎng)為Ⅱ型豬鏈球菌感染。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該豬場(chǎng)豬鏈球菌對(duì)慶大霉素等常規(guī)藥物不敏感，而對(duì)頭孢曲松、氨芐西林具有較強(qiáng)的敏感性。

關(guān)鍵詞 Ⅱ型鏈球菌;藥敏試驗(yàn);分離;鑒定; PCR

中圖分類號(hào) S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）21-0102-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Streptococcus suis Type 2

LIU Yunzhen， GUI Wenlong， WEN Siyi et al

（Jiangsu Agrianimal Vocational College， Taizhou，Jiangsu? 225300）

Abstract In August of 2018， a pig farm in central area of Jiangsu Province was suspected to be infected with Streptococcus suis. Pathological examination revealed that the pigs were manifested as following： the meninges， lungs， kidneys and lymph nodes were hemorrhagic and swollen， and there were cellulosic exudates in the articular cavity;the tissues of nose， lung and brain were isolated and cultured on bacterial blood culture medium， and different hemolysis phenomena were observed 24 hours later;the purple， paired， shortchain or longchain cocci were seen by staining microscopy;biochemical experiments showed that it produced acid and gas from lactose， trehalose and aescin. Mannitol and sorbitol did not react;the infection of S.suis type 2 was finally diagnosed by PCR. At the same time， the dug sensitivity test showed that S.suis was not susceptible to routine drugs such as gentamicin， and had strong susceptibility to ceftriaxone and ampicillin.

Key words Streptococcus suis type 2;Drug sensitivity test;Isolation;Identification;PCR

基金項(xiàng)目 江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目;常州金牧藥業(yè)有限公司產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（00010114011）。

作者簡(jiǎn)介 劉運(yùn)鎮(zhèn)（1978—），男，江蘇邳州人，講師，碩士，從事獸醫(yī)臨床研究。通信作者，副教授，碩士，從事動(dòng)物傳染病研究。

收稿日期 2019-05-16;修回日期 2019-05-28

豬鏈球菌病是由致病性豬鏈球菌感染引起的一種人畜共患病[1]。豬鏈球菌是豬的一種常見和重要病原體，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為腦膜炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等癥狀。少部分患者發(fā)生鏈球菌中毒性休克綜合征，嚴(yán)重病例病情進(jìn)展非?？?，如果診斷、治療不及時(shí)，預(yù)后較差，病死率極高[2-4] ，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)有很大的影響，目前我國(guó)抗生素主要用于豬鏈球菌疾病的預(yù)防和治療，由于長(zhǎng)期使用抗生素，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，使得豬鏈球菌的發(fā)病率和死亡率顯著上升。2018年12月，江蘇某豬場(chǎng)發(fā)生疑似豬鏈球菌病例。筆者通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定確定為Ⅱ型豬鏈球菌感染，通過藥敏試驗(yàn)確定其耐藥性，為該養(yǎng)殖場(chǎng)及周邊豬場(chǎng)豬鏈球菌病的防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。采用李淼[5]的方法對(duì)疑似發(fā)病豬分別進(jìn)行鼻腔拭子和肺臟、腦組織的采集，所有病料采集嚴(yán)格按照無菌操作，采集后2 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

鼻腔拭子采集：對(duì)疑似發(fā)病豬的鼻孔周圍，用滅菌水進(jìn)行清洗后，將滅菌過的醫(yī)用棉簽插入鼻孔中，旋轉(zhuǎn)360°后取出，放入滅菌的1.5 mL EP管中（裝有含5%的無菌小牛血清的TSB培養(yǎng)基），封蓋、標(biāo)記后放于冰盒保存。肺臟采集：用滅菌過的組織剪，從喉頭下端將氣管剪斷，連同肺臟一起取出放于封口袋中，標(biāo)記后放于冰盒保存。腦組織采集：將疑似發(fā)病豬的顱骨切一方形小口，用滅菌過的組織剪將將腦組織輕輕挑出，放于封口袋中，標(biāo)記后放于冰盒保存[5]。

1.1.2 試劑。 TSB肉湯培養(yǎng)基、小牛血清和藥敏試紙（購(gòu)自杭州天和生物制品有限公司）、滅菌水（自制）、哥倫比亞綿羊鮮血平板、DNA提取試劑盒、2×ES Taq MasterMix（購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司）。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表的SS基因序列，通過比對(duì)分析后找出保守序列，使用Primer Premier 5軟件針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物SS-F和SS-R，并以陽(yáng)性樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期大小為415 bp的片段[6]。對(duì)分離的豬鏈球菌繼續(xù)進(jìn)行分型檢測(cè)，根據(jù)設(shè)計(jì)引物SS1-F、SS1-R、SS2-F、SS2-R、SS7-F、SS7-R、SS9-F、SS9-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得預(yù)期大小分別為719、524、710、569 bp的片段，見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)。采用李淼[5]的方法對(duì)采集的病料進(jìn)行細(xì)菌分離與培養(yǎng)。

鼻腔拭子的細(xì)菌分離培養(yǎng)：冰盒保存的鼻腔拭子1.5 mL EP管放于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2 h后，用移液槍吸取20 μL培養(yǎng)液滴入哥倫比亞綿羊鮮血平板中，用滅菌接種環(huán)涂抹均勻，標(biāo)記后放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后用接種環(huán)挑取具有淺綠色溶血環(huán)的疑似豬鏈球菌小菌落，在另外一個(gè)哥倫比亞綿羊鮮血平板中劃線、標(biāo)記后，將平板放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)24 h[5]。

肺臟和腦組織的細(xì)菌分離培養(yǎng)：用組織剪剪取0.5 g左右組織，剪碎后放入勻漿機(jī)中勻漿5 min，確保其充分打碎，然后將破碎的的組織用生理鹽水1 000倍稀釋，充分混合均后;用移液槍取20 μL稀釋液滴入哥倫比亞綿羊鮮血平板中，用滅菌接種環(huán)涂抹均勻，標(biāo)記后放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后用接種環(huán)挑取具有淺綠色溶血環(huán)的疑似豬鏈球菌小菌落，在另外一個(gè)哥倫比亞綿羊鮮血平板中劃線、標(biāo)記后，將平板放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)24 h[5]。

1.2.2 細(xì)菌的染色鏡檢。用滅菌接種環(huán)挑取疑似豬鏈球菌純培養(yǎng)物菌落，采用革蘭氏染色法染色，置于高倍顯微鏡下鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 生化試驗(yàn)。

將分離培養(yǎng)得到的菌株接種到進(jìn)行甘露醇、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、七葉苷等生化反應(yīng)管中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察生化反應(yīng)特征。

1.2.4 PCR鑒定。

參照鄒君等[7]建立的多重PCR檢測(cè)方法，采用煮沸裂解法制備細(xì)菌 DNA 模板。取適量的過夜培養(yǎng)液，以12 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用無菌超純水洗滌沉淀2次，并用100 μL超純水重懸細(xì)胞。100 ℃金屬水浴鍋?zhàn)饔?10? min，置于冰浴中冷卻10? min，12 000 r/min 離心 10? min，取上清液作為 DNA 模板。PCR反應(yīng)體系如下：Premix Taq 12.5 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物 0.5 μL、cDNA樣品 2 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃? 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;16 ℃ 1 min。按照瓊脂糖凝膠電泳SOP（編號(hào)）對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并判斷結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)。

按照CLSI M100的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物試驗(yàn)。用滅菌棉簽刮取細(xì)菌純培養(yǎng)物，使之溶解于滅菌生理鹽水中，將菌落濃度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，取適量菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板上，略干后貼上藥敏紙片，于37 ℃下培養(yǎng)18 h后，測(cè)量抑菌環(huán)直徑[8]。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：抑菌圈直徑 <10 mm為耐藥，抑菌圈直徑 10～15 cm為中度敏感， 直徑>15 mm則為高度敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

待檢病料經(jīng)過24 h培養(yǎng)，鼻拭子病料分離到1株可疑菌株，在鮮血培養(yǎng)基上菌落呈針尖大小、圓形隆起，濕潤(rùn)透明，灰白色，菌落周圍形成完全透明的溶血圈，為β-溶血[9]。

2.2 細(xì)菌的染色鏡檢

在革蘭氏染色后，顯微鏡檢查顯示病料培養(yǎng)物為球菌，呈單個(gè)、成對(duì)，短鏈或長(zhǎng)鏈排列，且革蘭氏染色為紫色（陽(yáng)性），其病料組織觸片鏡檢細(xì)菌形成對(duì)、短鏈、無鞭毛、無芽胞。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，3種病料培養(yǎng)的菌落生化特征均與鏈球菌生化指標(biāo)相一致。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

通過瓊脂糖凝膠電泳SOP（編號(hào)）對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，擴(kuò)增到524 bp大小片段，結(jié)果如圖1所示。

通過PCR擴(kuò)增，分離細(xì)菌基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說明該豬場(chǎng)發(fā)病豬分離菌株為Ⅱ型豬鏈球菌。結(jié)合病理變化和生化試驗(yàn)結(jié)果，可確定該豬場(chǎng)發(fā)生Ⅱ型豬鏈球菌病。

注：1.Marker;2.樣品;3.陽(yáng)性對(duì)照（2型鏈球菌，524 bp）;4.陰性對(duì)照

Note：1.Marker;2.Sample;3.Positive control （S.suis type 2， 524 bp）;4.Negative control

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，該豬場(chǎng)分離出的菌株對(duì)較多藥物具有較強(qiáng)的耐藥性，該分離菌株對(duì)頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、呋喃唑酮等藥物高度敏感，而對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、阿莫西林、諾氟沙星等藥物不敏感。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該豬場(chǎng)在日常生產(chǎn)中經(jīng)常采用環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素等藥物進(jìn)行疾病防控，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。

3 討論

對(duì)送檢的病死豬病料，分別進(jìn)行了豬復(fù)紅細(xì)胞體、圓環(huán)病毒、弓形蟲等疾病的病原體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，對(duì)鏈球菌的病原體檢測(cè)從細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR等方面鑒定分離到的病原為鏈球菌，從而確診該豬場(chǎng)發(fā)生了豬鏈球菌病。

鏈球菌具有多種細(xì)菌且在自然界中廣泛分布，引起許多動(dòng)物（如人、豬、牛、馬、綿羊和家禽等）的感染。豬鏈球菌的特征是敗血癥和局灶性淋巴結(jié)病。豬鏈球菌感染豬的生殖和消化道、上呼吸道。其中，以Ⅱ型豬鏈球菌最常見、毒性最強(qiáng)。致病因素包括膠囊、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、細(xì)胞外因子（EF）和溶血素。這種膠囊可以防止細(xì)菌被吞噬。溶菌酶釋放蛋白和細(xì)胞外因子的存在增強(qiáng)了菌株的毒力。這種細(xì)菌的抵抗力不強(qiáng)，對(duì)干燥、濕熱比較敏感，常用的消毒劑就可以殺滅它。

鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，在理論上許多抗生素對(duì)其具有明顯的抗菌作用。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的鏈球菌對(duì)頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、呋喃唑酮等藥物具有較高的敏感性，而其對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、阿莫西林、諾氟沙星等藥物不敏感，主要是由于該豬場(chǎng)在生產(chǎn)過程使用了大量的抗生素，導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。通過藥敏試驗(yàn)篩選合適藥物，結(jié)合豬場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)情況，確定合理的用藥方案，選擇合適的路徑和劑量，可有效控制疫情的發(fā)生。劉佩紅等[10]研究表明不同豬場(chǎng)對(duì)藥物的耐藥性也不同，也說明在豬場(chǎng)日常生產(chǎn)中進(jìn)行臨床用藥時(shí)，應(yīng)盡可能采用輪換用藥、聯(lián)合用藥等方式，避免耐藥菌株的產(chǎn)生[11]。

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