賦型劑乳液粒徑和菠菜加工方式對(duì)菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的影響

袁 曦，劉曉娟*，曹 庸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

蔬菜和水果是人們攝取β-胡蘿卜素的重要膳食來(lái)源[1]，但由于果蔬中的β-胡蘿卜素難以從食物組織中釋放、在胃腸道消化液中的溶解度較低、易發(fā)生轉(zhuǎn)化等原因，其具有較低的生物利用率[2]。如何提高果蔬中類(lèi)胡蘿卜素的生物利用率一直是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。McClements等[3]于2014年首次提出設(shè)計(jì)excipient food（由成策等[4]翻譯為賦型劑食品）與食物或活性成分共同攝入，來(lái)增加活性成分的生物利用率。研究發(fā)現(xiàn)，將酸奶與姜黃素共同攝入可顯著提高姜黃素的生物可給性[5]；將水蘇糖溶液和茶多酚共同攝入可以改善茶多酚在小鼠體內(nèi)的吸收情況[6]。賦型劑乳液是一類(lèi)針對(duì)性設(shè)計(jì)用于與食物或活性成分共同攝入的水包油型乳液，是目前研究較多的一類(lèi)賦型劑食品[3]。Liu Xuan等以玉米油為油相，以吐溫20為乳化劑，制備賦型劑納米乳液與黃椒[7]和芒果[8]共同體外模擬消化，顯著提高了黃椒和芒果中類(lèi)胡蘿卜素的生物可給性。

在大部分類(lèi)胡蘿卜素的體外消化研究中，都采用生物可給性作為評(píng)價(jià)其生物利用率的重要指標(biāo)。在乳液體系中，乳液的粒徑影響著其在胃腸道中的消化速率、吸收和代謝途徑、活性成分的釋放以及向混合膠束的轉(zhuǎn)移，與活性成分的生物可給性有著密切聯(lián)系[9-13]。Salvia-Trujillo等[9]的研究結(jié)果表明，與大粒徑（表面積平均粒徑（d3,2）為19 μm）乳液相比，較小粒徑（d3,2＝170 nm）乳液與番茄汁混合體系中油脂消化速率更快，番茄紅素的生物可給性更高。Zou Liqiang等[10]的研究結(jié)果表明，較小粒徑乳液會(huì)加快其消化速率，可能導(dǎo)致活性物質(zhì)在未到達(dá)吸收部位之前就已發(fā)生轉(zhuǎn)化、降解。調(diào)控乳液粒徑、減少活性物質(zhì)在胃腸道消化過(guò)程中的降解、改善活性物質(zhì)的釋放和溶解對(duì)于提高果蔬中活性物質(zhì)的生物可給性具有重要作用。

食物組織的狀態(tài)是影響類(lèi)胡蘿卜素生物可給性的另一重要因素[14]。一般認(rèn)為，致密的食物組織結(jié)構(gòu)會(huì)在一定程度上抑制活性成分的釋放，因此，常通過(guò)破碎、均質(zhì)、熱燙等機(jī)械處理及熱處理方式來(lái)破壞其組織結(jié)構(gòu)[15-16]。然而，目前熱加工對(duì)類(lèi)胡蘿卜素生物可給性的影響仍無(wú)統(tǒng)一定論。Ryan等[17]的研究表明，蒸煮、燒烤和微波等熱處理方式均提高了紅辣椒和番茄中β-胡蘿卜素的生物可給性；Tydeman等[18]的研究結(jié)果表明，熱處理降低了胡蘿卜中類(lèi)胡蘿卜素的生物可給性。這些研究結(jié)果表明加工方式對(duì)活性成分生物可給性的影響可能與食物和活性成分本身的性質(zhì)密切相關(guān)。針對(duì)特定的食物和活性成分，探討合適的加工方式，對(duì)于促進(jìn)活性成分的釋放、提高生物可給性具有重要意義。

因此，本實(shí)驗(yàn)以β-胡蘿卜素含量豐富的菠菜為原料，利用體外模擬消化模型，研究了賦型劑乳液粒徑和加工方式對(duì)菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的影響。本研究中賦型劑乳液完全由食品級(jí)成分（水、玉米油和酪蛋白酸鈉）組成，安全性高、無(wú)特殊風(fēng)味，可制成沙拉或以醬汁等形式添加到日常膳食中。本研究旨在為科學(xué)合理地設(shè)計(jì)賦型劑乳液，提高菠菜中類(lèi)胡蘿卜素的生物利用率，充分發(fā)揮果蔬中類(lèi)胡蘿卜素的潛在功效，從而改善人體健康狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜、玉米油購(gòu)于廣州當(dāng)?shù)爻?，其中菠菜? ℃冰箱冷藏，玉米油于室溫下避光貯藏。

胃蛋白酶（250 U/mg）、脂肪酶（100～500 U/mg）、Mucin（豬胃黏液素II型） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；酪蛋白酸鈉 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；豬膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、丙酮、正己烷（均為分析純） 天津市富宇精細(xì)化工廠；四氫呋喃、二氯甲烷、三乙胺（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國(guó)J.T.Baker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ200-S型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海嫩谷機(jī)電設(shè)備有限公司；AH-BASIC高壓均質(zhì)機(jī) 德國(guó)ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；D3024R冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽洛捷克公司；LC-15C分析高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；90 Plus動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；CX41光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；DL-55全自動(dòng)電位滴定儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同粒徑賦型劑乳液的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酪蛋白酸鈉溶解于5 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，常溫下磁力攪拌3～5 h，直至酪蛋白酸鈉完全溶解，4 ℃冷藏過(guò)夜，得到水相溶液。水相溶液使用前用濾紙過(guò)濾，去除未溶解的大顆粒物質(zhì)。待水相溶液恢復(fù)至室溫后，將玉米油與水相溶液按照質(zhì)量比1∶9混合，利用高速分散均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下分散2 min（制備10 μm乳液），然后分別利用高壓均質(zhì)機(jī)在20 MPa下均質(zhì)1 次（制備500 nm乳液）、在120 MPa下均質(zhì)5 次（制備200 nm乳液）。均質(zhì)過(guò)程中，外部加冰對(duì)乳液進(jìn)行冷卻，防止不飽和脂肪酸受熱分解。

1.3.2 不同混合體系樣品制備

不同粒徑賦型劑乳液/菠菜混合體系的制備：將菠菜去根、莖，洗凈，瀝干多余水分，葉片切成長(zhǎng)約為15 mm的正方形。將菠菜與PBS（5 mmol/L、pH 7.0）等質(zhì)量混合，用料理機(jī)高速攪拌1 min得到菠菜泥。用PBS（5 mmol/L、pH 7.0）將不同粒徑賦型劑乳液稀釋至含油質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，再分別與菠菜泥以質(zhì)量比1∶1混合。100 r/min磁力攪拌2 min（避光）以保證體系混合均勻，制備得到初始階段樣品。以玉米油（非乳液狀態(tài)）為對(duì)照，進(jìn)行相同操作。

不同加工方式菠菜/賦型劑乳液混合體系的制備：生菠菜/賦型劑乳液混合樣品的制備流程同上；將去根莖的菠菜葉于沸水浴中熱燙1 min，其余操作同上，制備熱燙菠菜/賦型劑乳液混合樣品；使用小粒徑（d3,2≈200 nm）賦型劑乳液。

1.3.3 菠菜與賦型劑乳液共同體外模擬消化

結(jié)合蛋白質(zhì)、油脂的消化特點(diǎn)，參考文獻(xiàn)[19-20]的標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)體外模擬消化程序并稍作修改，構(gòu)建模擬消化道，包括模擬口腔、模擬胃、模擬小腸3 個(gè)消化階段。

模擬口腔消化：模擬唾液由0.03 g/mL Mucin和多種無(wú)機(jī)鹽溶于蒸餾水中配制而成[20]。取20 mL初始階段樣品與20 mL模擬唾液混勻，用鹽酸溶液調(diào)至pH 6.8，在恒溫?fù)u床中（37 ℃、100 r/min）模擬口腔消化10 min，得到口腔消化樣品。

模擬胃消化：模擬胃液由3.2 g/mL胃蛋白酶、2 g/L NaCl和體積分?jǐn)?shù)0.7%鹽酸溶于蒸餾水中配制而成。取20 mL模擬口腔消化后的樣品與20 mL模擬胃液混合，調(diào)節(jié)至pH 2.5，在恒溫?fù)u床中（37 ℃、100 r/min）模擬胃消化2 h，得到胃消化樣品。

模擬小腸消化：取30 mL經(jīng)模擬胃消化的樣品，調(diào)節(jié)至pH 6.8～7.0，加入1.5 mL模擬腸液（36.6 g/L CaCl2·2H2O和219 g/L NaCl溶于蒸餾水中）、3.5 mL膽鹽溶液（0.187 5 g膽鹽溶液溶于3.5 mL PBS（5 mmol/L、pH 7.0）中）。再次調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入2.5 mL脂肪酶溶液（含脂肪酶24 g/L）。然后采用pH-stat法，利用恒電位滴定儀不斷向體系中加入0.25 mol/L NaOH溶液，使體系恒定保持在pH 7.0，并記錄2 h內(nèi)消耗NaOH溶液的體積。在整個(gè)消化過(guò)程中，體系溫度維持在37 ℃，攪拌頭以50%最大速率不斷均勻攪拌。

1.3.4 粒徑和ζ-電位的測(cè)定

采用90 Plus動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀測(cè)定樣品的d3,2、粒徑分布、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）及ζ-電位。在測(cè)量前，先對(duì)賦型劑乳液及各階段消化液進(jìn)行逐級(jí)稀釋和靜置沉淀，以消除多重光散射和菠菜組織對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾。在測(cè)量粒徑時(shí)，用PBS（5 mmol/L、pH 7.0）稀釋賦型劑乳液、初始階段及經(jīng)模擬口腔和小腸消化的樣品，用pH 2.5的去離子水稀釋經(jīng)模擬胃消化的樣品。由于pH值和鹽離子濃度對(duì)ζ-電位有較大影響，應(yīng)盡量使樣品處于原始環(huán)境中，因此在測(cè)定ζ-電位時(shí)使用PBS（5 mmol/L、pH 7.0）稀釋賦型劑乳液、初始階段和經(jīng)模擬小腸消化的樣品；用pH 6.8的模擬唾液稀釋模擬口腔消化的樣品；用pH 2.5的模擬胃液稀釋模擬胃消化的樣品。測(cè)定溫度：為25 ℃，檢測(cè)角度為90°，波長(zhǎng)為658 nm。

1.3.5 消化過(guò)程混合體系微觀結(jié)構(gòu)的觀察

用光學(xué)顯微鏡（10 倍目鏡和100 倍物鏡）對(duì)不同消化階段的樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察。為反映樣品最真實(shí)的狀態(tài)，在各消化階段完成時(shí)立即取消化液進(jìn)行觀察，不需稀釋。

1.3.6 pH-stat測(cè)定游離脂肪酸釋放量

利用恒電位滴定儀不斷向體系自動(dòng)滴加0.25 mol/L NaOH，使消化體系恒定維持在pH 7.0，記錄在120 min消化過(guò)程中NaOH的消耗量，通過(guò)公式（1）計(jì)算游離脂肪酸釋放量，從而反映油脂的消化速率和最終消化程度[21]。利用相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水相溶液/菠菜混合體系進(jìn)行消化，測(cè)定NaOH消耗量并從賦型劑乳液/菠菜混合體系樣品的測(cè)量值中扣除，保證NaOH的消耗是由油脂消化引起。

式中：VNaOH是消耗NaOH的體積/L；cNaOH是用于滴定的NaOH濃度/（mol/L）；mlipid是小腸消化液中油脂的總質(zhì)量/g；Mlipid是油脂的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.7 生物可給性的測(cè)定

β-胡蘿卜素的生物可給性是指經(jīng)體外模擬消化后，消化液中的β-胡蘿卜素進(jìn)入混合膠束中的比例，可反映β-胡蘿卜素進(jìn)入混合膠束的能力[22]。賦型劑乳液/菠菜混合體系經(jīng)體外模擬消化后，取小腸消化液15 000 r/min、4 ℃離心50 min，離心后的消化液分為3 層，從下到上分別為不溶性沉淀、膠束相和未消化油脂。用注射器小心吸取中間層的膠束相，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，提取并檢測(cè)膠束相中的β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度。β-胡蘿卜素生物可給性的計(jì)算如公式（2）所示。

式中：ρ膠束為膠束相中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ小腸消化液為小腸消化液中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.8 類(lèi)胡蘿卜素提取和檢測(cè)

參考Biehler等[23]的方法并加以改進(jìn)，分別取5 mL各階段消化液或10 mL膠束相，加入正己烷-丙酮（體積比1∶1）進(jìn)行振蕩，4 000 r/min離心2 min并收集上層清液，下層溶液重復(fù)該步驟，萃取至上層清液無(wú)色，將所有的上層清液合并。將收集到的上清液與體積分?jǐn)?shù)10%氯化鈉溶液混合、振蕩，再次收集上層清液，利用正己烷萃取下層溶液，萃取至正己烷層溶液呈無(wú)色狀態(tài)。所有上層清液于25 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積小于5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管并氮?dú)獯祾咧劣袡C(jī)溶劑揮發(fā)完畢。冷凍干燥后于－20 ℃下貯存?zhèn)溆?。進(jìn)樣前用二氯甲烷將冷凍干燥后的提取物重新稀釋至合適質(zhì)量濃度。所有步驟均在低溫下進(jìn)行，并注意避光。

利用高效液相色譜法分析和定量樣品中的β-胡蘿卜素。具體條件為：色譜柱：Diamonsil C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇（體積比95∶5）；流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-四氫呋喃（體積比60∶20∶20），所有乙腈中均含有體積分?jǐn)?shù)5%三乙胺；梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，0～30% B；20～30 min，30%～100% B；30～50 min，100% B。流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.5軟件作圖。用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan’s檢驗(yàn)，P＜0.05表明數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粒徑大小賦型劑乳液的表征

利用高速分散均質(zhì)機(jī)和高壓均質(zhì)機(jī)在不同均質(zhì)壓力下均質(zhì)不同次數(shù)，分別制備了小粒徑（d3,2＝205 nm）、中等粒徑（d3,2＝510 nm）和大粒徑（d3,2＝9.822 μm）乳液。小、中、大粒徑乳液的PDI分別為0.099、0.141、0.651。一般認(rèn)為，PDI＜0.3表明乳液具有較好的均一性[24-25]，因此，使用本研究方法制備得到的小粒徑和中等粒徑乳液均一性較好。此外，小、中、大粒徑乳液的ζ-電位分別為－29.87、－26.56、－19.62 mV。這表明3 種乳液表面均帶有大量的負(fù)電荷，且負(fù)電荷的量隨著粒徑的增大而減小。乳液表面帶有較多負(fù)電荷主要是由于酪蛋白酸鈉作為乳化劑包裹在油滴表面，酪蛋白酸鈉的等電點(diǎn)為pH 4.5左右，其在中性條件下會(huì)帶有大量的負(fù)電荷。一般認(rèn)為，ζ-電位的絕對(duì)值越大，乳液的穩(wěn)定性越好[26]。小粒徑（d3,2≈200 nm）和中等粒徑（d3,2≈500 nm）乳液ζ-電位的絕對(duì)值顯著高于大粒徑乳液（d3,2≈10 μm）（P＜0.05），這表明與大粒徑乳液相比，小粒徑和中等粒徑乳液的穩(wěn)定性更好。

2.2 賦型劑乳液粒徑對(duì)乳液/菠菜混合體系消化過(guò)程中粒徑、ζ-電位和微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖 1 不同粒徑賦型劑乳液/菠菜混合體系各消化階段的d3,2Fig. 1 Mean particle size (d3,2) of mixed systems of spinach and excipient emulsions with different particle sizes at each stage of simulated GIT digestion

圖 2 不同粒徑賦型劑乳液/菠菜混合體系各消化階段的ζ-電位Fig. 2 ζ-Potential of mixed systems of spinach and excipient emulsions with different particle sizes at each stage of simulated GIT digestion

在胃腸道消化過(guò)程中，乳液的粒徑影響著油脂暴露于消化酶和消化液其他成分的表面積；油脂的聚集狀態(tài)會(huì)影響消化酶接觸油脂的能力；混合體系的ζ-電位對(duì)于了解消化過(guò)程中乳液與胃腸液中其他帶電組分的相互作用具有重要意義。這些因素都可能對(duì)活性成分的生物可給性造成影響。因此，本研究對(duì)樣品各消化階段的粒徑、ζ-電位和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以了解混合體系在模擬胃腸道消化過(guò)程中發(fā)生的變化，并為生物可給性的差異提供相關(guān)信息。

圖 3 不同粒徑賦型劑乳液/菠菜混合體系各消化階段的粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of mixed systems of spinach and excipient emulsions with different particle sizes at each stage of simulated GIT digestion

由于未經(jīng)均質(zhì)化的油脂粒徑過(guò)大，無(wú)法使用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀進(jìn)行測(cè)量，因此未對(duì)玉米油/菠菜混合物的初始、口腔、胃3 個(gè)階段的粒徑和ζ-電位進(jìn)行表征。不同粒徑賦型劑乳液與菠菜混合后的d3,2（圖1）和ζ-電位（圖2）變化呈相同趨勢(shì)，與混合前的賦型劑乳液相比，各樣品粒徑呈增加趨勢(shì)，ζ-電位的絕對(duì)值呈減小的趨勢(shì)。這可能是由于菠菜釋放出的一些帶電成分（如礦物離子）通過(guò)靜電屏蔽作用降低了乳滴表面的ζ-電位，從而促進(jìn)了乳滴的絮凝。

經(jīng)模擬口腔消化后，小粒徑、中等粒徑和大粒徑乳液/菠菜混合體系經(jīng)模擬口腔消化后的d3,2分別為2.19、2.97、6.73 μm。小粒徑、中等粒徑乳液/菠菜混合體系的d3,2較初始階段顯著增加，大粒徑乳液樣品的d3,2較初始階段顯著減小（P＜0.05）。從粒徑分布圖（圖3）也可以看出，小粒徑和中等粒徑乳液/菠菜混合體系經(jīng)口腔消化后，粒徑峰右移，說(shuō)明體系中小粒徑顆粒減少，大粒徑顆粒增加，表明在口腔消化過(guò)程中油滴可能發(fā)生了聚集。顯微鏡觀察結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，從圖4中可以看到，小粒徑、中等粒徑乳液/菠菜混合體系經(jīng)口腔消化后，油滴發(fā)生了聚集，而初始樣品中的大粒徑乳液/菠菜混合體系在模擬口腔消化階段被分解成了較小的油滴。在模擬口腔消化階段油滴發(fā)生聚集可能是由模擬唾液中的Mucin對(duì)油滴的橋接或消耗絮凝作用引起[27]。橋接是由于Mucin與兩個(gè)或更多油滴的表面結(jié)合引起，而未被吸附的Mucin會(huì)增加油滴之間的滲透吸引力，使得消耗絮凝發(fā)生，最終促使油滴發(fā)生聚集[28-29]。相反，大粒徑乳液/菠菜混合體系和玉米油/菠菜混合體系樣品的粒徑變化呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，可能是由于大油滴（d3,2≥10 μm）能夠抵抗Mucin對(duì)其的絮凝作用，且在消化過(guò)程中這些大油滴易在外力的作用下發(fā)生破裂。經(jīng)模擬口腔消化后，與初始階段（ζ-電位為－8.78～－22.43 mV）相比，所有樣品帶有的負(fù)電荷均顯著減少（ζ-電位為－5.88～－12.34 mV）（P＜0.05）。這種現(xiàn)象可能歸因于模擬唾液溶液的靜電屏蔽效應(yīng)以及Mucin與油滴表面的相互作用[30]。

圖 4 不同粒徑賦型劑乳液/菠菜混合體系各消化階段的顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 4 Microscopic images of mixed systems of spinach and excipient emulsions with different particle sizes after exposure to each stage of simulated GIT

經(jīng)模擬胃消化后，小粒徑和中等粒徑乳液/菠菜混合體系的d3,2（約7 μm）顯著增加（P＜0.05），大粒徑乳液/菠菜混合體系的d3,2（6.40 μm）無(wú)顯著變化。粒徑分布圖（圖3）同樣顯示經(jīng)模擬胃消化后，小粒徑、中等粒徑乳液/菠菜混合體系中出現(xiàn)了大量大粒徑（d3,2≈10 μm）顆粒。顯微鏡觀察結(jié)果（圖4）也表明經(jīng)模擬胃消化后，小粒徑和中等粒徑乳液/菠菜混合體系中的油滴發(fā)生了明顯的聚結(jié)，形狀變得不規(guī)則；大粒徑乳液/菠菜混合體系和玉米油/菠菜混合體系經(jīng)模擬胃消化后仍呈較大油滴，無(wú)明顯變化。小粒徑和中等粒徑乳液/菠菜混合體系的樣品經(jīng)模擬胃消化后粒徑增加可歸因于以下因素：1）在模擬胃液中含有胃蛋白酶，可以酶解吸附在油脂表面的酪蛋白酸鈉，減弱其抑制油脂聚集的能力；2）包裹在油脂表面的蛋白乳化劑處于高度酸性的環(huán)境時(shí)會(huì)帶有正的凈電荷，位于模擬唾液中的陰離子Mucin可能促進(jìn)被陽(yáng)離子蛋白（酪蛋白酸鈉）包裹的油脂發(fā)生絮凝[31]。大粒徑乳液/菠菜混合體系和玉米油/菠菜混合體系中變化趨勢(shì)不同可能是因?yàn)檫@些大油滴容易在外力作用下發(fā)生破裂。經(jīng)模擬胃消化后，所有樣品的ζ-電位都接近于零。這可能也是由于酪蛋白酸鈉被胃蛋白酶水解，導(dǎo)致油滴表面的負(fù)電荷減少。此外，陰離子Mucin被吸收到被陽(yáng)離子蛋白質(zhì)包裹的油滴表面也可能導(dǎo)致電荷中和[31-32]。

從圖4可以看出，與其他階段相比，經(jīng)模擬胃消化后油滴的顏色最深，表明在模擬胃消化階段有大量的脂溶性色素進(jìn)入油脂之中。這是由于在模擬胃消化時(shí)，強(qiáng)酸性的環(huán)境和胃蛋白酶的作用會(huì)增強(qiáng)脂溶性色素（如類(lèi)胡蘿卜素）在菠菜組織中的釋放[33]。同時(shí)，包裹在油脂表面的蛋白乳化劑被胃蛋白酶水解，脂溶性色素更容易進(jìn)入油脂之中。從圖4還可看出，較小粒徑油滴的顏色較大粒徑油滴深，這表明較小粒徑乳液可能更有效地滲入植物組織并溶解一些脂溶性色素物質(zhì)，增強(qiáng)植物組織中脂溶性活性成分的釋放。

所有賦型劑乳液/菠菜混合體系經(jīng)模擬小腸消化后，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得的d3,2均較模擬胃消化階段顯著減?。╠3,2≤1 μm）（P＜0.05）（圖1）。從顯微鏡觀察結(jié)果（圖4）中可以看到，經(jīng)過(guò)模擬小腸消化后，小粒徑和中等粒徑乳液/菠菜混合體系中的油脂幾乎被完全消化；大粒徑乳液/菠菜混合體系或玉米油/菠菜混合體系中油脂未被完全消化。該結(jié)果表明，在模擬小腸消化階段，脂肪酶開(kāi)始水解三?；视头肿樱⑶以谝欢ǖ南瘯r(shí)間內(nèi)，較小粒徑乳液/菠菜混合體系的油脂消化程度更高。經(jīng)模擬小腸消化后，賦型劑乳液/菠菜混合體系所帶負(fù)電荷數(shù)量均顯著增加（ζ-電位為－11.17～－22.01 mV），這種現(xiàn)象可能歸因于模擬小腸消化液中存在著各種類(lèi)型的陰離子膠體，如膽鹽和油脂消化產(chǎn)生的游離脂肪酸等[9]。不同樣品間ζ-電位的差異可能與油脂消化程度以及其他陰離子膠體的形成有關(guān)。

2.3 賦型劑乳液粒徑對(duì)乳液/菠菜混合體系消化過(guò)程中油脂消化特性的影響

圖 5 賦型劑乳液粒徑對(duì)乳液/菠菜混合體系中游離脂肪酸釋放的影響Fig. 5 Effect of excipient emulsion particle size on the amount of free fatty acids released from excipient emulsion/spinach mixtures

小腸中形成的混合膠束的性質(zhì)已被證明是影響類(lèi)胡蘿卜素生物可給性最重要的因素之一，游離脂肪酸是混合膠束的重要組成成分，其影響著混合膠束對(duì)脂溶性活性成分的溶解能力[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了賦型劑乳液粒徑對(duì)乳液/菠菜混合體系消化過(guò)程中油脂消化特性的影響，結(jié)果如圖5所示。不同混合體系中油脂消化的初始速率為：小粒徑乳液≈中等粒徑乳液＞大粒徑乳液＞玉米油（非乳液），即油脂的初始消化速率與乳液初始粒徑成反比。不同混合體系中油脂的最終消化程度為：小粒徑乳液≈中等粒徑乳液＞大粒徑乳液≈玉米油（非乳液）。這種現(xiàn)象可能歸因于油脂與消化酶接觸表面積的差異。粒徑較小的油脂擁有較大的比表面積，更容易與脂肪酶接觸，因此油脂的消化速率隨著油滴粒徑的減小而增加。雖然經(jīng)模擬胃消化后，小粒徑、中等粒徑乳液/菠菜混合體系的d3,2大于大粒徑乳液，但小粒徑、中等粒徑乳液/菠菜混合體系在模擬胃消化階段較大的d3,2主要是由于油滴的聚集和絮凝造成（圖4）；當(dāng)這些油滴暴露在中性的模擬腸液中時(shí)，包裹在油脂表面的蛋白質(zhì)（酪蛋白酸鈉）的ζ-電位會(huì)由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?，?dǎo)致陰離子Mucin的解吸，在一定程度上破壞這些絮狀物的結(jié)構(gòu)，最終重新釋放出具有高比表面積的油脂，從而導(dǎo)致油脂的快速消化[34]。

2.4 乳液粒徑對(duì)菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的影響

圖 6 賦型劑乳液粒徑對(duì)菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的影響Fig. 6 Effect of excipient emulsion particle size on bioaccessibility of β-carotene from spinach

如圖6所示，小粒徑、中等粒徑、大粒徑賦型劑乳液及玉米油與菠菜共同進(jìn)行體外模擬消化時(shí)，β-胡蘿卜素的生物可給性分別為28.78%、28.65%、12.80%和17.93%。較玉米油和大粒徑乳液相比，較小粒徑（d3,2≈200、500 nm）的賦型劑乳液與菠菜共同進(jìn)行體外模擬消化時(shí)，β-胡蘿卜素的生物可給性顯著較高（P＜0.05）。菠菜/乳液混合體系各消化階段高效液相色譜圖如圖7所示。

圖 7 菠菜/乳液混合體系各消化階段高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC profiles of emulsion/spinach mixed system following exposure to different GIT regions

對(duì)于β-胡蘿卜素而言，油脂的加入可促進(jìn)其從植物組織向膠束相轉(zhuǎn)移，油脂消化產(chǎn)生的大量游離脂肪酸有利于混合膠束的形成，這些均有利于提高β-胡蘿卜素的生物可給性[35]。與較大粒徑乳液相比，小粒徑和中等粒徑賦型劑乳液對(duì)提高菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的效果更佳，這是由于：1）小粒徑乳液更加有利于菠菜組織中脂溶性物質(zhì)從植物組織轉(zhuǎn)移到油脂之中，特別是對(duì)于疏水性極強(qiáng)的β-胡蘿卜素而言，油脂是其從菠菜組織轉(zhuǎn)移到膠束的中間介質(zhì)，對(duì)于其生物可給性有重要影響；2）較小粒徑乳液（d3,2≈200、500 nm）油脂的初始消化速率較快、最終消化程度較高，釋放出較多的游離脂肪酸，有利于形成更多的膠束來(lái)容納β-胡蘿卜素；3）大粒徑油脂的消化速率相對(duì)緩慢，從菠菜組織中釋放出來(lái)的類(lèi)胡蘿卜素分子在它們?nèi)苋牖旌夏z束之前可能發(fā)生氧化降解。但大粒徑乳液和普通食用油脂對(duì)β-胡蘿卜素的生物可給性的影響無(wú)顯著差異（P＜0.05），這可能是由于非乳液態(tài)的玉米油經(jīng)模擬胃腸道階段消化時(shí)，在外力及各種消化酶的作用下，其粒徑與大粒徑乳液無(wú)明顯差異。

2.5 菠菜加工方式對(duì)β-胡蘿卜素生物可給性的影響

綜上所述，小粒徑乳液對(duì)于提高菠菜中β-胡蘿卜素的生物可給性效果最佳。因此，選擇粒徑約為200 nm的賦型劑乳液分別與生、熟菠菜開(kāi)展共同體外模擬消化，進(jìn)一步研究日常加工方式對(duì)菠菜中β-胡蘿卜素生物可給性的影響。

圖 8 菠菜加工方式對(duì)乳液/菠菜混合體系體外模擬消化過(guò)程中的d3,2（A）、ζ-電位（B）、油脂消化特性（C）和β-胡蘿卜素生物可給性（D）的影響Fig. 8 Effects of processing methods on mean particle size (d3,2) (A),ζ-potential (B), oil digestibility (C) and bioaccessibility of β-carotene (D)in emulsion/spinach mixtures during simulated GIT digestion

從圖8中可以看出，加工方式總體上并未對(duì)乳液/菠菜混合體系體外模擬消化過(guò)程中的粒徑（圖8A）、ζ-電位（圖8B）及油脂消化特性（圖8C）造成顯著影響，但顯著影響β-胡蘿卜素的生物可給性（圖8D）。生菠菜/賦型劑乳液混合體系和熱燙菠菜/賦型劑乳液混合體系中β-胡蘿卜素的生物可給性分別為28.78%和15.66%，這表明與生菠菜相比，短時(shí)的加熱處理顯著降低了菠菜中β-胡蘿卜素的生物可給性（P＜0.05）。

圖 9 賦型劑乳液與生菠菜或熱燙菠菜共同進(jìn)行體外模擬消化過(guò)程中顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 9 Microscopic images of excipient emulsion co-digested with raw or blanched spinach after exposure to each stage of simulated GIT

此外，加工方式還影響著乳液/菠菜混合體系消化過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)。從圖9中可以看出，熱燙菠菜/賦型劑乳液混合體系經(jīng)模擬小腸消化后，菠菜組織中仍保留著大量色素物質(zhì)，而生菠菜組織中的色素物質(zhì)釋放得更加完全。這一現(xiàn)象表明，β-胡蘿卜素生物可給性的差異可能是由于在機(jī)械處理和胃腸道消化過(guò)程中，生菠菜的組織細(xì)胞更容易發(fā)生破裂，有利于類(lèi)胡蘿卜素的釋放；而熱燙后的菠菜的組織細(xì)胞更傾向于完整地分離，使得類(lèi)胡蘿卜素仍較多被包封在組織細(xì)胞中，限制了其進(jìn)入混合膠束的能力。本研究結(jié)果與Tydeman等[18]的結(jié)果一致。此外，在相同的機(jī)械處理?xiàng)l件下，生菠菜和熱燙菠菜的組織破碎程度可能不同[36]，從而影響了類(lèi)胡蘿卜素從植物組織向混合膠束的轉(zhuǎn)移，在一定程度上造成其生物可給性的差異。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，隨著賦型劑乳液粒徑的減小，菠菜中β-胡蘿卜素的生物可給性逐漸升高。這與乳液初始粒徑影響菠菜組織中類(lèi)胡蘿卜素物質(zhì)的釋放、油脂的消化速率和最終消化程度以及混合膠束的形成有關(guān)。此外，菠菜的加工方式也顯著影響著β-胡蘿卜素的生物可給性，熱燙菠菜的生物可給性顯著低于生菠菜（P＜0.05），這可能是由于經(jīng)熱燙處理的菠菜組織破碎程度和消化程度均低于生菠菜，不利于類(lèi)胡蘿卜素的釋放。這提示可針對(duì)性地設(shè)計(jì)與生果蔬共同食用的賦型劑乳液（如沙拉醬）或與熱加工的果蔬共同食用的賦型劑乳液（如醬汁），以便能更大程度地提高活性成分的生物利用率。