鄭曉杰 何 躍 周 環(huán) 林勝利 熊春華*
(1 浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018 2 溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 浙江溫州325006)
乳酸鏈球菌素(NISIN)是由某些乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的具有較強抗菌作用的細菌素,其對于革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用[1]。乳酸鏈球菌素可被人體中的胰凝乳蛋白酶降解,在腸道中形成無害的氨基酸,是一種世界公認安全的天然生物性食品防腐劑[2-3]。有研究表明,當乳酸鏈球菌素添加到食品中時,容易發(fā)生水解或與食品成分(脂類和蛋白質(zhì))發(fā)生反應[4-5],導致其抑菌活性下降。
甲殼素是有由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過β 酰1,4 糖苷鍵連接而成,是自然界含量僅次于纖維素的天然多糖,主要來自甲殼類動物的外殼[6]。殼寡糖(chitosan oligosaccharides,COS)是甲殼素脫乙酰和降解后的產(chǎn)物,聚合度為2~10。殼寡糖有較高的水溶性和許多生物活性功能,比如抗氧化性、抑菌性和抗腫瘤等[7-10],其在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應用得到較多關(guān)注[10-12]。殼寡糖具有一定的抑菌性能,它也被作為天然的防腐劑。郭新穎等[13]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以將冷藏牛肉的貨架期從10 d 延長至20 d。張開翔等[8]發(fā)現(xiàn)2%的殼寡糖添加量可使豆腐的保質(zhì)期向后延遲將近8 h。穆曉麗等[7]將殼寡糖添加到原料乳中,可以顯著抑制細菌生長。然而,與傳統(tǒng)的化學防腐劑相比,殼寡糖的抑菌能力較弱。劉曉麗等[14]研究表明,殼寡糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的半致死濃度約為苯甲酸鈉的2 倍。此外,殼寡糖的抗菌活性受溶液pH 的影響較大。殼寡糖在酸性條件下具有一定的抑菌活性,而當pH 值大于6.0 時,其抑菌活性大幅下降[15]。這些特性也阻礙了其作為抑菌劑在食品工業(yè)中的廣泛應用。
為了改善殼寡糖的抑菌活性,許多研究通過化學修飾的方法將新的活性基團引入殼寡糖分子鏈中,來提高其抑菌活性和pH 穩(wěn)定性[16-17]。Liu等[17]通過O-烷基化反應制備具有更強抑菌性的殼寡糖-O-曲酸衍生物。Yue 等[16]用香葉溴化鹽取代殼寡糖上的羥基制備殼寡糖-O-香葉醇衍生物。然而,化學修飾方法中使用的有機溶劑和催化劑具有殘留風險[18],這降低了殼寡糖作為綠色防腐劑的安全性。
美拉德反應是廣泛存在于食品中的一種非酶褐變,主要是羰基化合物(還原糖、酮類或醛類)與氨基化合物(氨基酸,蛋白質(zhì)或含氮化合物)之間發(fā)生的一系列復雜反應,最終生成聚合物[19]。由于不需要額外的化學試劑,它被認為是一種綠色的改性方式,在蛋白質(zhì)和多糖的改性研究中被廣泛使用[18,20]。本文通過美拉德反應制備殼寡糖-乳酸鏈球菌素(COS-N)復合物,采用紅外光譜和掃描電鏡對殼寡糖-乳酸鏈球菌素復合物(COS-N)的結(jié)構(gòu)進行表征,并將其應用到對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制試驗中,同時研究其抑菌機理,為殼寡糖的改性提供新的研究思路。
乳酸鏈球菌素,浙江銀象生物工程有限公司;殼寡糖(脫乙酰度為98%,5 000 u),濟南海得貝海洋生物工程有限公司;實驗菌種,北京陸橋技術(shù)有限責任公司;牛肉膏、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限責任公司;牛血清白蛋白(BSA)(分析純),武漢偉盛生物有限公司;超微量ATP 酶測定試劑盒、堿性磷酸酶AKP 測定試劑盒、正苯基奈胺攝入法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒、半乳糖苷酶釋放法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;Tris-HCl 緩沖液、戊二醛、磷酸緩沖液、固定液、乙醇、丙酮、包埋劑、檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液(分析純)。
Nicolet iS 10 紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;Nova 200 NanoSEM 型掃描電鏡,美國FEI 公司;UV-1000 型紫外-可見分光光度計,上海天美;F-7000 型熒光光譜儀,日本日立公司;FOSS 經(jīng)典型全自動凱氏定氮儀,上海瑞汾國際貿(mào)易有限公司,90-2 恒溫磁力攪拌器,上海亞榮生化儀器廠;501 型超級恒溫器,上海市實驗儀器廠;真空冷凍干燥機(ALPHA 1-2LD PLUS),德國CHRIST;手提式高壓滅菌鍋,武漢諾貝思機械制造有限公司;AIRTECH 型無菌操作臺,蘇凈集團安泰公司;SPX 型智能生化培養(yǎng)箱,南京實驗儀器廠。
1.3.1 殼寡糖-乳酸鏈球菌素復合物的制備 將殼寡糖與乳酸鏈球素以質(zhì)量比5∶1 溶于蒸餾水中(總質(zhì)量分數(shù)控制為2%),用食品級HCl 調(diào)節(jié)pH值至2.00±0.01。將混合溶液在室溫下攪拌1 h,充分溶解,隨后將混合溶液在80 ℃下加熱反應12 h。將加熱后的樣品迅速在冰水浴中冷卻,冷凍干燥成粉末,標記為COS-N 復合物。殼寡糖與乳酸鏈球菌素混合溶解后直接冷凍干燥的樣品,標記為COS-N 混合物。所有樣品在-18 ℃下密封保藏。
1.3.2 殼寡糖-乳酸鏈球菌素復合物的表征
1.3.2.1 掃描電鏡分析 將凍干后的樣品 (殼寡糖、乳酸鏈球菌素及殼寡糖-乳酸鏈球菌素復合物)用碳導電膠固定在樣品臺上噴金處理,在Nova 200 NanoSEM 型掃描電鏡下觀察樣品形貌,加速電壓為10 kV。
1.3.2.2 紅外光譜分析 采用粉末研磨法,在室溫下將樣品與KBr 壓片,掃描范圍500~4 000 cm-1。采用Nicolet iS 10 傅里葉紅外光譜儀分析衍生物的光譜吸收。
1.3.3 抑菌率測定 參考Song 等[21]方法,將標準菌種(大腸桿菌與金黃色葡萄球菌)活化并稀釋至適合濃度,將4.5 mL 菌液與0.5 mL 抑菌劑溶液或生理鹽水混合,在37 ℃下培養(yǎng)1 h。隨后,抽取1 mL 混合液平板培養(yǎng)48 h。其中,抑菌劑質(zhì)量分數(shù)分別為0.001%,0.002%,0.004%和0.005%。其結(jié)果以細菌存活率表示,計算公式:
細菌存活率%=[抑菌劑組細菌數(shù)/生理鹽水組細菌數(shù)]×100%。
1.3.4 細菌細胞膜的完整性 參考Chen 等[22]的方法,通過監(jiān)測菌液在260 nm 處的吸光度變化來判斷細菌細胞膜的完整性。分別取對數(shù)生長期的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌菌液,離心,收集菌體,用0.9%的無菌NaCl 溶液洗滌3 次后重新懸浮,使二者的懸液OD420=0.65。將1.0 mg/mL 的COS-N 復合物及COS-N 混合物與稀釋的菌懸液按1∶1(體積比) 混合,置37 ℃搖床中培養(yǎng),每隔1 h,取出5 mL 樣品,用0.22 μm 的微孔濾膜過濾,于260 nm 處測定濾液的吸光值??瞻讓φ战M中以生理鹽水代替抑菌劑,每個樣品重復測定3次。其結(jié)果以O(shè)D260nm 增長率表示,計算公式:
OD 增長率=[培養(yǎng)后菌懸液讀數(shù)/起始菌懸液讀數(shù)]×100%。
1.3.5 細菌細胞膜的滲透性 參考Lee 等[23]的方法,處理方法同1.3.4 節(jié),結(jié)果以相對電導率表示,計算公式:
相對電導率(%)=[(實驗組電導率-空白組電導率)/實驗組電導率]×100%。
1.3.6 與牛血清白蛋白的相互作用 參考劉曉麗等[14]的方法,在比色管中分別加入1.0 mL Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4),1.0 mL 1×10-5mol/L BSA 和不同濃度梯度的COS-N 復合物及COS-N 混合物溶液,室溫下平衡10 min 后,在激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長200~600 nm 范圍掃描,激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度各為3 nm。
1.3.7 對細菌菌體內(nèi)ATP 酶的影響 Na+/K+-ATP酶活力測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。Na+/K+-ATP 酶活力單位的定義為:1 mg 組織蛋白中Na+/K+-ATP 酶每小時分解ATP 產(chǎn)生1μmol 無機磷酸時所對應的Na+/K+-ATP 酶的量。
每種樣品每次測定3 個平行,結(jié)果以X ±SD 表示,采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計分析。組間差異顯著性分析采用方差分析中的Tukey HSD 測試,P 小于0.05 時差異顯著。
2.1.1 掃描電鏡分析結(jié)果 從圖1a 和圖1b 可看出,殼寡糖為近似球狀結(jié)構(gòu)且表面光滑,而乳酸鏈球菌素呈不規(guī)則形狀且表面多孔結(jié)構(gòu)。殼寡糖與乳酸鏈球菌素混合時,其結(jié)構(gòu)如圖1c 所示,為不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)。當兩者發(fā)生美拉德反應,復合物的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化,形成規(guī)則的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)(圖1d)。這與Liu 等[17]報道的將殼寡糖與曲酸共價結(jié)合后,殼寡糖的形態(tài)從球形變成不規(guī)則的片狀相一致。
2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果 圖2a 為NISIN、COS、COS-N 混合物以及COS-N 復合物在500~4 000 cm-1波數(shù)范圍的傅里葉變換紅外光譜。與Liu[17]、Yue[24]和Sun[25]發(fā)表的結(jié)果相似,COS 在3 383 及2 889 cm 處存在較平緩的吸收帶,而在1 626,1 519,1 381 以及1 156 cm-1附近存在特征性吸收峰。這些吸收峰歸結(jié)為氨基和羥基基團的伸縮振動及分子內(nèi)和分子間的氫鍵,亞甲基上C-H 的不對稱或?qū)ΨQ彎曲、酰胺Ⅰ,C-O 鍵的拉伸,酰胺Ⅱ以及C-O-鍵的拉伸[26-27]。COS-N 混合物與COS-N 復合物的傅里葉變換紅外光譜與COS 非常相似。如圖2b 所示,C0S-N 復合物在1 731,1 713,1 704,1 455,1 338 cm-1處形成新的峰,可能是經(jīng)美拉德反應后COS 和NISIN 間形成席夫堿[26-27]。綜上所述,通過對COS-N 復合物的傅里葉變換紅外光譜掃描,證實COS 與NISIN之間的美拉德反應。
圖2 COS,NISIN,COS-N 混合物和COS-N 復合物的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NISIN,COS,COS-N Mixture and COS-N Conjugate
如圖3所示,COS-N 復合物對于大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高于COS-N 混合物。前者對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的半致死劑量為后者的78%和45%。這表明,通過美拉德反應,殼寡糖與乳酸鏈球菌素共價結(jié)合后形成的新產(chǎn)物具有更強的抑菌性能。根據(jù)報道,殼聚糖分別與溶菌酶、果糖、木糖或木聚糖反應產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物具有更強的抑菌活性[21,28-31],這與本研究的結(jié)果相似。同時溶解性的改善被認為是其抑菌性增強的原因之一。COS-N 復合物具有更強的抑菌性,可能是因乳酸鏈球菌素溶解性提高的緣故。
通過監(jiān)測菌液在260 nm 處吸光度的變化,可以判斷細菌細胞膜的完整性[32]。當細菌細胞膜受到損傷時,細胞內(nèi)的小分子物質(zhì)(如Na+、K+等)以及大分子物質(zhì)(如DNA、RNA 等)溢出,而這些物質(zhì)在260 nm 處有很強的紫外吸收,被稱為“260吸收物質(zhì)”[33]。如圖4所示:添加了COS-N 復合物和COS-N 混合物的菌液,其在260 nm 處的吸光度在6 h 內(nèi)隨時間的增加而顯著增加;而對照組僅有小幅度增加。這說明COS-N 復合物與CONN 混合物能夠破壞大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的細胞膜完整性,進而增加細胞內(nèi)物質(zhì)的滲出,這與文獻[14],[34]報道相似。在培養(yǎng)時間6 h 時,COSN 復合物使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的OD260值分別增加50%和48%,COS-N 混合物OD260值為47%和42%。COS-N 復合物具有對這兩種細菌細胞膜更強的破壞作用,這也可能是COS-N 復合物具有更強抑菌性的原因之一。當培養(yǎng)時間繼續(xù)延長,菌液的OD260值不同程度地減少,這可能是釋放出來的部分DNA、RNA 變性所致。
圖3 COS-N 復合物和COS-N 混合物的抑菌活性Fig.3 The antimicrobial activity of COS-N Conjugate and COS-N Mixture
圖4 COS-N 復合物和COS-N 混合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液OD260 的影響Fig.4 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture on the OD260 of E.coli and S.aureus
樣品對細菌細胞膜滲透性的影響可以通過測定菌液電導率的變化來獲得。如圖5所示,添加了COS-N 復合物和COS-N 混合物的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液的電導率的變化規(guī)律與OD260相似,即:在培養(yǎng)時間8 h 內(nèi),空白對照組中菌液電導率沒有顯著增加;而COS-N 復合物和COS-N 混合物處理組中菌液電導率顯著增加。當培養(yǎng)時間超過8 h 后,菌液的電導率增加緩慢,趨于平穩(wěn)。這說明在用抗菌劑作用菌體細胞之后,細菌細胞膜的離子通透性增加,胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲[35]。對于金黃色葡萄球菌,用COS-N 混合物和COS-N 復合物兩種抗菌劑分別作用12 h,其相對電導率分別增加19.84%和23.98%;而對大腸桿菌而言,用COS-N 混合物和COS-N 復合物兩種抗菌劑分別作用12 h,其相對電導率分別增加22.82%和22.94%。以上數(shù)據(jù)表明,COS-N 復合物作用后的菌液電導率要比COS-N 混合物略高。將COS 與NISIN 以美拉德反應方式適度結(jié)合,可提高其增加細胞膜離子通透性的能力。
圖5 COS-N 復合物和COS-N 混合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌電導率的影響Fig.5 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture on the conductivity of E.coli and S.aureus
蛋白質(zhì)分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的氨基酸殘基能夠分別發(fā)射波長為348,303 nm 和282 nm 的熒光,且其強度受其吲哚側(cè)鏈的影響[32-33]。本試驗選取色氨酸(Trp)為檢測氨基酸,當BSA 的濃度為1×10-5mol/L 時,不同濃度的COS-N 復合物和COS-N 混合物對BSA 的熒光光譜的影響如圖6所示。色氨酸(Trp)殘基的熒光強度隨COS-N 復合物和COS-N 混合物濃度的增大而減弱,這說明不同濃度的COS-N 復合物和COS-N 混合物對BSA 的誘導作用,使得包圍在BSA 分子內(nèi)部的色氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團裸露出來,進一步改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。
ATP 酶是生物膜上的一種蛋白酶,它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用。Na+/K+-ATP 酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種極為重要的膜酶,其作用在于維持細胞膜的滲透性,進而維持細胞的正常生命活動。Na+/K+-ATP 酶的泄露會干擾細菌的正常生命活動,通過檢測細菌胞外Na+/K+-ATP 酶的活性變化可以反映細菌細胞膜的完整性。本研究采用試劑盒方法測定COSN 復合物和COS-N 混合物作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后Na+/K+-ATP 酶活性的變化。如圖7所示,對照組中的細菌胞外Na+/K+-ATP 酶活性在培養(yǎng)時間內(nèi)保持穩(wěn)定,說明細菌細胞膜保持完整,抑菌劑處理組的細菌胞外Na+/K+-ATP 酶隨著培養(yǎng)時間的延長活性明顯上升,100 min 時達到最大值,隨后趨于穩(wěn)定。在此期間,COS-N 復合物和COS-N 混合物使得細胞膜發(fā)生破裂,造成Na+/K+-ATP 酶的泄露[36]。與菌液OD260及電導率變化規(guī)律相似。相比COS-N 混合物,COS-復合物對于細胞膜的破壞性更強,能造成更多的Na+/K+-ATP酶泄露。
利用美拉德反應將COS 與NISIN 共價結(jié)合,形成新型殼寡糖-乳酸鏈球菌素復合物。經(jīng)紅外光譜及電鏡掃描證實:殼寡糖與乳酸鏈球菌素共價結(jié)合后形成新物質(zhì)且其微觀結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)均發(fā)生改變。抑菌試驗結(jié)果表明:相比COS-Nisin 混合物,COS-Nisin 復合物在相同條件下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的半致死濃度分別從0.0037%降到0.0017%和從0.0029%降到0.0023%。抑菌機理研究顯示:相比COS-Nisin 混合物,COS-Nisin 復合物能在更大程度上破壞細菌細胞壁的完整性,增加離子通透性以及增加細菌體內(nèi)ATP 酶的泄露。綜上所述,在適當條件下美拉德反應增強天然抑菌劑的抑菌性能。
圖6 COS-N 復合物和COS-N 混合物對BSA(1×10-5mol/L)的熒光光譜的影響Fig.6 Fluorescence spectra of BSA (1×10-5mol/L) with COS-N Conjugate and COS-N Mixture
圖7 COS-N 復合物和COS-N 混合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后對ATP 酶活的影響Fig.7 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture onNa+/K+-ATPase activity in cell membrane of E.coli and S.aureus ion channels