殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物的制備、表征及其抑菌活性研究

鄭曉杰 何 躍 周 環(huán) 林勝利 熊春華*

（1 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018 2 溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江溫州325006）

乳酸鏈球菌素（NISIN）是由某些乳酸鏈球菌在代謝過(guò)程中合成和分泌的具有較強(qiáng)抗菌作用的細(xì)菌素，其對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用[1]。乳酸鏈球菌素可被人體中的胰凝乳蛋白酶降解，在腸道中形成無(wú)害的氨基酸，是一種世界公認(rèn)安全的天然生物性食品防腐劑[2-3]。有研究表明，當(dāng)乳酸鏈球菌素添加到食品中時(shí)，容易發(fā)生水解或與食品成分（脂類和蛋白質(zhì)）發(fā)生反應(yīng)[4-5]，導(dǎo)致其抑菌活性下降。

甲殼素是有由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)β 酰1，4 糖苷鍵連接而成，是自然界含量?jī)H次于纖維素的天然多糖，主要來(lái)自甲殼類動(dòng)物的外殼[6]。殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）是甲殼素脫乙酰和降解后的產(chǎn)物，聚合度為2～10。殼寡糖有較高的水溶性和許多生物活性功能，比如抗氧化性、抑菌性和抗腫瘤等[7-10]，其在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用得到較多關(guān)注[10-12]。殼寡糖具有一定的抑菌性能，它也被作為天然的防腐劑。郭新穎等[13]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以將冷藏牛肉的貨架期從10 d 延長(zhǎng)至20 d。張開翔等[8]發(fā)現(xiàn)2%的殼寡糖添加量可使豆腐的保質(zhì)期向后延遲將近8 h。穆曉麗等[7]將殼寡糖添加到原料乳中，可以顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。然而，與傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑相比，殼寡糖的抑菌能力較弱。劉曉麗等[14]研究表明，殼寡糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的半致死濃度約為苯甲酸鈉的2 倍。此外，殼寡糖的抗菌活性受溶液pH 的影響較大。殼寡糖在酸性條件下具有一定的抑菌活性，而當(dāng)pH 值大于6.0 時(shí)，其抑菌活性大幅下降[15]。這些特性也阻礙了其作為抑菌劑在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。

為了改善殼寡糖的抑菌活性，許多研究通過(guò)化學(xué)修飾的方法將新的活性基團(tuán)引入殼寡糖分子鏈中，來(lái)提高其抑菌活性和pH 穩(wěn)定性[16-17]。Liu等[17]通過(guò)O-烷基化反應(yīng)制備具有更強(qiáng)抑菌性的殼寡糖-O-曲酸衍生物。Yue 等[16]用香葉溴化鹽取代殼寡糖上的羥基制備殼寡糖-O-香葉醇衍生物。然而，化學(xué)修飾方法中使用的有機(jī)溶劑和催化劑具有殘留風(fēng)險(xiǎn)[18]，這降低了殼寡糖作為綠色防腐劑的安全性。

美拉德反應(yīng)是廣泛存在于食品中的一種非酶褐變，主要是羰基化合物（還原糖、酮類或醛類）與氨基化合物（氨基酸，蛋白質(zhì)或含氮化合物）之間發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，最終生成聚合物[19]。由于不需要額外的化學(xué)試劑，它被認(rèn)為是一種綠色的改性方式，在蛋白質(zhì)和多糖的改性研究中被廣泛使用[18，20]。本文通過(guò)美拉德反應(yīng)制備殼寡糖-乳酸鏈球菌素（COS-N）復(fù)合物，采用紅外光譜和掃描電鏡對(duì)殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物（COS-N）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并將其應(yīng)用到對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制試驗(yàn)中，同時(shí)研究其抑菌機(jī)理，為殼寡糖的改性提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸鏈球菌素，浙江銀象生物工程有限公司；殼寡糖（脫乙酰度為98%，5 000 u），濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)菌種，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白（BSA）（分析純），武漢偉盛生物有限公司；超微量ATP 酶測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶AKP 測(cè)定試劑盒、正苯基奈胺攝入法細(xì)菌膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒、半乳糖苷酶釋放法細(xì)菌膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；Tris-HCl 緩沖液、戊二醛、磷酸緩沖液、固定液、乙醇、丙酮、包埋劑、檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS 10 紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Nova 200 NanoSEM 型掃描電鏡，美國(guó)FEI 公司；UV-1000 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海天美；F-7000 型熒光光譜儀，日本日立公司；FOSS 經(jīng)典型全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海瑞汾國(guó)際貿(mào)易有限公司，90-2 恒溫磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；501 型超級(jí)恒溫器，上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)（ALPHA 1-2LD PLUS），德國(guó)CHRIST；手提式高壓滅菌鍋，武漢諾貝思機(jī)械制造有限公司；AIRTECH 型無(wú)菌操作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；SPX 型智能生化培養(yǎng)箱，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物的制備 將殼寡糖與乳酸鏈球素以質(zhì)量比5∶1 溶于蒸餾水中（總質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制為2%），用食品級(jí)HCl 調(diào)節(jié)pH值至2.00±0.01。將混合溶液在室溫下攪拌1 h，充分溶解，隨后將混合溶液在80 ℃下加熱反應(yīng)12 h。將加熱后的樣品迅速在冰水浴中冷卻，冷凍干燥成粉末，標(biāo)記為COS-N 復(fù)合物。殼寡糖與乳酸鏈球菌素混合溶解后直接冷凍干燥的樣品，標(biāo)記為COS-N 混合物。所有樣品在-18 ℃下密封保藏。

1.3.2 殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物的表征

1.3.2.1 掃描電鏡分析 將凍干后的樣品 （殼寡糖、乳酸鏈球菌素及殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物）用碳導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上噴金處理，在Nova 200 NanoSEM 型掃描電鏡下觀察樣品形貌，加速電壓為10 kV。

1.3.2.2 紅外光譜分析 采用粉末研磨法，在室溫下將樣品與KBr 壓片，掃描范圍500～4 000 cm-1。采用Nicolet iS 10 傅里葉紅外光譜儀分析衍生物的光譜吸收。

1.3.3 抑菌率測(cè)定 參考Song 等[21]方法，將標(biāo)準(zhǔn)菌種（大腸桿菌與金黃色葡萄球菌）活化并稀釋至適合濃度，將4.5 mL 菌液與0.5 mL 抑菌劑溶液或生理鹽水混合，在37 ℃下培養(yǎng)1 h。隨后，抽取1 mL 混合液平板培養(yǎng)48 h。其中，抑菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.001%，0.002%，0.004%和0.005%。其結(jié)果以細(xì)菌存活率表示，計(jì)算公式：

細(xì)菌存活率%=[抑菌劑組細(xì)菌數(shù)/生理鹽水組細(xì)菌數(shù)]×100%。

1.3.4 細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性 參考Chen 等[22]的方法，通過(guò)監(jiān)測(cè)菌液在260 nm 處的吸光度變化來(lái)判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌菌液，離心，收集菌體，用0.9%的無(wú)菌NaCl 溶液洗滌3 次后重新懸浮，使二者的懸液OD420=0.65。將1.0 mg/mL 的COS-N 復(fù)合物及COS-N 混合物與稀釋的菌懸液按1∶1（體積比） 混合，置37 ℃搖床中培養(yǎng)，每隔1 h，取出5 mL 樣品，用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，于260 nm 處測(cè)定濾液的吸光值?？瞻讓?duì)照組中以生理鹽水代替抑菌劑，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。其結(jié)果以O(shè)D260nm 增長(zhǎng)率表示，計(jì)算公式：

OD 增長(zhǎng)率=[培養(yǎng)后菌懸液讀數(shù)/起始菌懸液讀數(shù)]×100%。

1.3.5 細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性 參考Lee 等[23]的方法，處理方法同1.3.4 節(jié)，結(jié)果以相對(duì)電導(dǎo)率表示，計(jì)算公式：

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組電導(dǎo)率-空白組電導(dǎo)率）/實(shí)驗(yàn)組電導(dǎo)率]×100%。

1.3.6 與牛血清白蛋白的相互作用 參考劉曉麗等[14]的方法，在比色管中分別加入1.0 mL Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4），1.0 mL 1×10-5mol/L BSA 和不同濃度梯度的COS-N 復(fù)合物及COS-N 混合物溶液，室溫下平衡10 min 后，在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)200～600 nm 范圍掃描，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度各為3 nm。

1.3.7 對(duì)細(xì)菌菌體內(nèi)ATP 酶的影響 Na+/K+-ATP酶活力測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。Na+/K+-ATP 酶活力單位的定義為：1 mg 組織蛋白中Na+/K+-ATP 酶每小時(shí)分解ATP 產(chǎn)生1μmol 無(wú)機(jī)磷酸時(shí)所對(duì)應(yīng)的Na+/K+-ATP 酶的量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每種樣品每次測(cè)定3 個(gè)平行，結(jié)果以X ±SD 表示，采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異顯著性分析采用方差分析中的Tukey HSD 測(cè)試，P 小于0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物的表征

2.1.1 掃描電鏡分析結(jié)果 從圖1a 和圖1b 可看出，殼寡糖為近似球狀結(jié)構(gòu)且表面光滑，而乳酸鏈球菌素呈不規(guī)則形狀且表面多孔結(jié)構(gòu)。殼寡糖與乳酸鏈球菌素混合時(shí)，其結(jié)構(gòu)如圖1c 所示，為不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)兩者發(fā)生美拉德反應(yīng)，復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化，形成規(guī)則的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)（圖1d）。這與Liu 等[17]報(bào)道的將殼寡糖與曲酸共價(jià)結(jié)合后，殼寡糖的形態(tài)從球形變成不規(guī)則的片狀相一致。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果 圖2a 為NISIN、COS、COS-N 混合物以及COS-N 復(fù)合物在500～4 000 cm-1波數(shù)范圍的傅里葉變換紅外光譜。與Liu[17]、Yue[24]和Sun[25]發(fā)表的結(jié)果相似，COS 在3 383 及2 889 cm 處存在較平緩的吸收帶，而在1 626，1 519，1 381 以及1 156 cm-1附近存在特征性吸收峰。這些吸收峰歸結(jié)為氨基和羥基基團(tuán)的伸縮振動(dòng)及分子內(nèi)和分子間的氫鍵，亞甲基上C-H 的不對(duì)稱或?qū)ΨQ彎曲、酰胺Ⅰ，C-O 鍵的拉伸，酰胺Ⅱ以及C-O-鍵的拉伸[26-27]。COS-N 混合物與COS-N 復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜與COS 非常相似。如圖2b 所示，C0S-N 復(fù)合物在1 731，1 713，1 704，1 455，1 338 cm-1處形成新的峰，可能是經(jīng)美拉德反應(yīng)后COS 和NISIN 間形成席夫堿[26-27]。綜上所述，通過(guò)對(duì)COS-N 復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜掃描，證實(shí)COS 與NISIN之間的美拉德反應(yīng)。

2.2 抑菌性能測(cè)定

圖2 COS，NISIN，COS-N 混合物和COS-N 復(fù)合物的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NISIN，COS，COS-N Mixture and COS-N Conjugate

如圖3所示，COS-N 復(fù)合物對(duì)于大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高于COS-N 混合物。前者對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的半致死劑量為后者的78%和45%。這表明，通過(guò)美拉德反應(yīng)，殼寡糖與乳酸鏈球菌素共價(jià)結(jié)合后形成的新產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抑菌性能。根據(jù)報(bào)道，殼聚糖分別與溶菌酶、果糖、木糖或木聚糖反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抑菌活性[21，28-31]，這與本研究的結(jié)果相似。同時(shí)溶解性的改善被認(rèn)為是其抑菌性增強(qiáng)的原因之一。COS-N 復(fù)合物具有更強(qiáng)的抑菌性，可能是因乳酸鏈球菌素溶解性提高的緣故。

2.3 細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性

通過(guò)監(jiān)測(cè)菌液在260 nm 處吸光度的變化，可以判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[32]。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)（如Na+、K+等）以及大分子物質(zhì)（如DNA、RNA 等）溢出，而這些物質(zhì)在260 nm 處有很強(qiáng)的紫外吸收，被稱為“260吸收物質(zhì)”[33]。如圖4所示：添加了COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物的菌液，其在260 nm 處的吸光度在6 h 內(nèi)隨時(shí)間的增加而顯著增加；而對(duì)照組僅有小幅度增加。這說(shuō)明COS-N 復(fù)合物與CONN 混合物能夠破壞大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲出，這與文獻(xiàn)[14]，[34]報(bào)道相似。在培養(yǎng)時(shí)間6 h 時(shí)，COSN 復(fù)合物使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的OD260值分別增加50%和48%，COS-N 混合物OD260值為47%和42%。COS-N 復(fù)合物具有對(duì)這兩種細(xì)菌細(xì)胞膜更強(qiáng)的破壞作用，這也可能是COS-N 復(fù)合物具有更強(qiáng)抑菌性的原因之一。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，菌液的OD260值不同程度地減少，這可能是釋放出來(lái)的部分DNA、RNA 變性所致。

圖3 COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物的抑菌活性Fig.3 The antimicrobial activity of COS-N Conjugate and COS-N Mixture

圖4 COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液OD260 的影響Fig.4 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture on the OD260 of E.coli and S.aureus

2.4 不同處理組對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的影響

樣品對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的影響可以通過(guò)測(cè)定菌液電導(dǎo)率的變化來(lái)獲得。如圖5所示，添加了COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液的電導(dǎo)率的變化規(guī)律與OD260相似，即：在培養(yǎng)時(shí)間8 h 內(nèi)，空白對(duì)照組中菌液電導(dǎo)率沒有顯著增加；而COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物處理組中菌液電導(dǎo)率顯著增加。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)8 h 后，菌液的電導(dǎo)率增加緩慢，趨于平穩(wěn)。這說(shuō)明在用抗菌劑作用菌體細(xì)胞之后，細(xì)菌細(xì)胞膜的離子通透性增加，胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲[35]。對(duì)于金黃色葡萄球菌，用COS-N 混合物和COS-N 復(fù)合物兩種抗菌劑分別作用12 h，其相對(duì)電導(dǎo)率分別增加19.84%和23.98%；而對(duì)大腸桿菌而言，用COS-N 混合物和COS-N 復(fù)合物兩種抗菌劑分別作用12 h，其相對(duì)電導(dǎo)率分別增加22.82%和22.94%。以上數(shù)據(jù)表明，COS-N 復(fù)合物作用后的菌液電導(dǎo)率要比COS-N 混合物略高。將COS 與NISIN 以美拉德反應(yīng)方式適度結(jié)合，可提高其增加細(xì)胞膜離子通透性的能力。

圖5 COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture on the conductivity of E.coli and S.aureus

2.5 不同處理組與牛血清白蛋白的相互作用

蛋白質(zhì)分子中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的氨基酸殘基能夠分別發(fā)射波長(zhǎng)為348，303 nm 和282 nm 的熒光，且其強(qiáng)度受其吲哚側(cè)鏈的影響[32-33]。本試驗(yàn)選取色氨酸（Trp）為檢測(cè)氨基酸，當(dāng)BSA 的濃度為1×10-5mol/L 時(shí)，不同濃度的COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)BSA 的熒光光譜的影響如圖6所示。色氨酸（Trp）殘基的熒光強(qiáng)度隨COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物濃度的增大而減弱，這說(shuō)明不同濃度的COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)BSA 的誘導(dǎo)作用，使得包圍在BSA 分子內(nèi)部的色氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來(lái)，進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

2.6 不同處理組對(duì)細(xì)菌菌體內(nèi)ATP 酶的影響

ATP 酶是生物膜上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用。Na+/K+-ATP 酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種極為重要的膜酶，其作用在于維持細(xì)胞膜的滲透性，進(jìn)而維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)。Na+/K+-ATP 酶的泄露會(huì)干擾細(xì)菌的正常生命活動(dòng)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌胞外Na+/K+-ATP 酶的活性變化可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。本研究采用試劑盒方法測(cè)定COSN 復(fù)合物和COS-N 混合物作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后Na+/K+-ATP 酶活性的變化。如圖7所示，對(duì)照組中的細(xì)菌胞外Na+/K+-ATP 酶活性在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，說(shuō)明細(xì)菌細(xì)胞膜保持完整，抑菌劑處理組的細(xì)菌胞外Na+/K+-ATP 酶隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)活性明顯上升，100 min 時(shí)達(dá)到最大值，隨后趨于穩(wěn)定。在此期間，COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物使得細(xì)胞膜發(fā)生破裂，造成Na+/K+-ATP 酶的泄露[36]。與菌液OD260及電導(dǎo)率變化規(guī)律相似。相比COS-N 混合物，COS-復(fù)合物對(duì)于細(xì)胞膜的破壞性更強(qiáng)，能造成更多的Na+/K+-ATP酶泄露。

3 結(jié)論

利用美拉德反應(yīng)將COS 與NISIN 共價(jià)結(jié)合，形成新型殼寡糖-乳酸鏈球菌素復(fù)合物。經(jīng)紅外光譜及電鏡掃描證實(shí)：殼寡糖與乳酸鏈球菌素共價(jià)結(jié)合后形成新物質(zhì)且其微觀結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)均發(fā)生改變。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：相比COS-Nisin 混合物，COS-Nisin 復(fù)合物在相同條件下對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的半致死濃度分別從0.0037%降到0.0017%和從0.0029%降到0.0023%。抑菌機(jī)理研究顯示：相比COS-Nisin 混合物，COS-Nisin 復(fù)合物能在更大程度上破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，增加離子通透性以及增加細(xì)菌體內(nèi)ATP 酶的泄露。綜上所述，在適當(dāng)條件下美拉德反應(yīng)增強(qiáng)天然抑菌劑的抑菌性能。

圖6 COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)BSA（1×10-5mol/L）的熒光光譜的影響Fig.6 Fluorescence spectra of BSA （1×10-5mol/L） with COS-N Conjugate and COS-N Mixture

圖7 COS-N 復(fù)合物和COS-N 混合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后對(duì)ATP 酶活的影響Fig.7 Effect of COS-N Conjugate and COS-N Mixture onNa+/K+-ATPase activity in cell membrane of E.coli and S.aureus ion channels