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    超聲波-纖維素酶輔助提取紅樹莓籽黃酮及其體外消化研究

    2019-12-03 03:27:10呂長(zhǎng)鑫紀(jì)秀鳳王圓圓王維民王貴虹勵(lì)建榮
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:樹莓消化黃酮

    蘆 宇 呂長(zhǎng)鑫* 紀(jì)秀鳳 王圓圓 常 俏 孫 彤 王維民 王貴虹 勵(lì)建榮

    (1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 大連中超食品有限公司 遼寧大連116400 3 遼寧新大地實(shí)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司 沈陽110168)

    紅樹莓(Rubus ideaus L.)又名覆盆子,果實(shí)色澤鮮艷,享有“黃金水果”的美譽(yù)[1]。由于紅樹莓果實(shí)貨架期短,易腐敗變質(zhì),因此常將其加工成果酒、果汁等,延長(zhǎng)保質(zhì)期,而加工產(chǎn)生的果渣往往被丟棄。果渣中含有大量樹莓籽,其籽中不僅含有油脂、有機(jī)酸、纖維素和粗蛋白,還含有黃酮、原花青素、花色苷等多種活性成分[2-3]。本文以紅樹莓籽為研究對(duì)象,提取活性成分黃酮,提高紅樹莓的利用率。采用超聲波與酶聯(lián)合法提取黃酮,Cellulase可將纖維素水解成水溶性糖,使植物細(xì)胞壁水解破裂[4-5],同時(shí)聯(lián)合超聲波在液體中高頻振動(dòng)并產(chǎn)生“空穴作用”,破壞細(xì)胞組織,加速黃酮類化合物溶出和擴(kuò)散[6]。此法既能充分利用酶安全無污染的特性,又能通過超聲波輔助縮短提取時(shí)間,有效提高黃酮得率[7]。

    胃、腸道是營(yíng)養(yǎng)成分消化吸收的重要場(chǎng)所,食物經(jīng)過胃腸道消化后,吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)排出廢物[8]。體外胃腸道消化模型,最早是由Miller 提出建立的,其成功測(cè)定了膳食中鐵的生物利用率[9]。體外消化模型通過模擬人體的胃、腸道消化來研究食物中功能性成分在人體的消化情況,能既準(zhǔn)確又快捷地對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。目前針對(duì)黃酮的研究一般是研究其的功能性質(zhì),少有考慮經(jīng)胃、腸消化吸收后黃酮的活性變化。本文通過建立體外胃腸道消化模型,研究黃酮在經(jīng)胃、腸道消化后的含量變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    紅樹莓籽,紅樹莓果渣分離所得;纖維素酶(50 000 U/g,食品級(jí)),深圳恒生生物科技有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶(10 000 U/g),sigma 公司;檸檬酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠。

    ALPHA1-2 LD plus 冷凍干燥機(jī),北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司;UV2700 紫外分光光度計(jì),日本島津公司;RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,成都康宇儀器有限公司;SHB-3A 循環(huán)水多用真空泵,鄭州杜甫儀器廠;KQ-250E 超聲波清洗器,昆山市超聲波儀器有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 紅樹莓籽粉制備 紅樹莓籽經(jīng)真空冷凍干燥24 h,研磨過60 目篩得紅樹莓籽粉,待用。

    1.2.2 紅樹莓籽黃酮提取工藝流程

    1.2.3 紅樹莓籽黃酮測(cè)定方法 取1 mL 提取液于25 mL 容量瓶中,加入0.75 mL 5 mg/mL 亞硝酸鈉溶液,混勻、靜置6 min,加入0.75 mL 5 mg/mL 硝酸鋁溶液,搖勻、靜置反應(yīng)6 min,向其中加入10 mL 4 mg/mL 氫氧化鈉溶液,混勻、定容15 min,在510 nm 處測(cè)定吸光值[10-11]。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.75x+0.047,R2=0.9996 計(jì)算黃酮濃度。根據(jù)計(jì)算黃酮得率公式:

    式中,C——黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V——測(cè)定體積(mL);m——樣品質(zhì)量(g)。

    1.2.4 單因素試驗(yàn)

    1.2.4.1 纖維素酶添加量對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,纖維素酶添加量分別為0.000,0.005,0.010,0.015,0.020 mg/mL,在料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,利用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值至5.5,在55 ℃、超聲功率100 W 條件下提取45 min,迅速升溫至90 ℃滅酶10 min,冷卻至室溫,抽濾定容。取1 mL 提取液按照

    1.2.3 節(jié)方法顯色測(cè)定其吸光值,計(jì)算黃酮得率。做3 次平行試驗(yàn),考察纖維素酶添加量對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。

    1.2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅樹莓籽黃酮得率影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,在纖維素酶添加量為0.010 mg/mL,料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)分別為40%,50%,60%,70%,80%乙醇,利用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值至5.5,在55 ℃超聲功率100 W 提取45 min,其它操作同1.2.4.1 節(jié),考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅樹莓籽黃酮得率影響。

    1.2.4.3 pH 值對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,纖維素酶添加量為0.010 mg/mL,在料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值分別至4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,在55 ℃超聲功率100 W 提取45 min,其它操作同1.2.4.1 節(jié),考察pH 對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。

    1.2.4.4 超聲功率對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,纖維素酶添加量為0.010 mg/mL,在料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值至5.5,超聲功率分別為50,100,150,200,250 W,55 ℃提取45 min,其它操作同1.2.4.1 節(jié),考察超聲波功率對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。

    1.2.4.5 提取溫度對(duì)紅樹莓籽黃酮得率影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,纖維素酶添加量為0.010 mg/mL,在料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值至5.5,在超聲功率100 W,提取溫度分別為35,45,55,65,75 ℃下,提取45 min,其它操作同1.2.4.1 節(jié),考察提取溫度對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。

    1.2.4.6 提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響 稱取一定量紅樹莓籽粉置于錐形瓶中,纖維素酶添加量為0.010 mg/mL,在料液比1∶40 g/mL 條件下,向其中加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇,用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH 值至5.5,在超聲功率100 W,提取溫度55 ℃條件下,提取時(shí)間分別15,25,35,45,55 min,其它操作同1.2.4.1 節(jié),考察提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。

    1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以黃酮得率(Y)為響應(yīng)值,選取對(duì)黃酮得率影響較大的3 個(gè)因素(纖維素酶添加量、超聲功率和pH)為考察因素,優(yōu)化紅樹莓籽黃酮提取工藝。響應(yīng)面組合的試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)實(shí)際操作,調(diào)整工藝參數(shù)做3 次平行試驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果是否可靠。

    1.2.7 體外模擬胃腸道消化研究

    1.2.7.1 體外模擬胃消化對(duì)紅樹莓籽黃酮濃度影響 參照李俶等[12]方法,略有改動(dòng)。取0.9%氯化鈉溶液10 mL 置于離心管中,加入0.1 mol/L 鹽酸4 mL,再加入8 mg/mL 胃蛋白酶溶液4 mL,調(diào)節(jié)pH 2~2.5,向其中加入0.25 g 紅樹莓籽黃酮凍干粉,充分混合,置于150 r/min、37 ℃的水浴恒溫振蕩器中分別消化0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h,以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min,以生理鹽水替代胃蛋白酶溶液作為空白,取上清液測(cè)定其紅樹莓籽黃酮濃度,做3 次平行試驗(yàn)。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

    1.2.7.2 體外模擬腸消化對(duì)紅樹莓籽黃酮濃度的影響 體外模擬腸電解質(zhì)溶液的配制:取0.540 g氯化鈉、0.065 g 氯化鉀、0.033 g 氯化鈣溶于100 mL 去離子水中。腸消化液配制:0.07 g/mL 胰蛋白酶溶液25 mL 與25 mL 腸電解質(zhì)溶液混合均勻。參照閔芳芳等[13]方法,略有改動(dòng)。1.2.7.1 節(jié)中樣品胃消化2.5 h 后釋放量趨于平穩(wěn)(P<0.05)。經(jīng)體外模擬胃消化2.5 h 的消化樣液作為腸消化初始的反應(yīng)液,用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH 值至7,向離心管中加入6 mL 腸消化液充分混合,置于150 r/min、37 ℃的水浴恒溫振蕩器中分別消化0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h,以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min,以腸電解液替代腸消化液溶液作為空白,取上清液測(cè)定其紅樹莓籽黃酮濃度,做3 次平行試驗(yàn)。

    1.2.8 數(shù)據(jù)處理 對(duì)上述每組試驗(yàn)均做3 次平行試驗(yàn)。單因素?cái)?shù)據(jù)采用office 辦公軟件處理,取平均值作圖,采用IBM SPASS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行方差分析,顯著水平P<0.05。響應(yīng)面數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.1 軟件分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅樹莓籽黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 Cellulase 添加量對(duì)黃酮得率影響分析 植物細(xì)胞壁主要由纖維素構(gòu)成,纖維素酶能夠破壞細(xì)胞壁,促進(jìn)有效成分的溶出[14]。如圖1所示,當(dāng)纖維素酶添加量在0~0.01 mg/mL 范圍時(shí)黃酮得率迅速上升,這是由于酶與底物接觸充分,使黃酮得率提高,當(dāng)酶添加量為0.01 mg/mL 時(shí),黃酮得率32.74 mg/mL,而后黃酮得率逐漸下降。選擇0.01 mg/mL 為纖維素酶最佳添加量。

    2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響 由圖2可知,紅樹莓籽黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),紅樹莓籽黃酮得率為33.08 mg/g,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%,黃酮得率開始下降,可能是由于乙醇濃度過高,脂溶性雜質(zhì)相繼溶出,與黃酮競(jìng)爭(zhēng)同種溶劑而致[15]。確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳條件。

    2.1.3 pH 值對(duì)黃酮得率的影響 pH 值對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響如圖3所示。紅樹莓籽黃酮得率隨著pH 值的升高顯著增大,當(dāng)pH 5.5 時(shí)黃酮得率達(dá)32.82 mg/g,當(dāng)pH 大于5.5 時(shí)得率迅速下降,可能是纖維素酶在酸性條件下活性較強(qiáng),催化效果較好。確定pH 5.5 為最佳條件。

    2.1.4 超聲功率對(duì)黃酮得率的影響 超聲波可以產(chǎn)生“空穴作用”,破壞細(xì)胞組織,促進(jìn)黃酮溶出[16]。由圖4可知,隨著超聲功率的增加,紅樹莓籽黃酮得率呈先增加后降低趨勢(shì)。在超聲功率50~100 W范圍,黃酮溶出量逐漸增加,這是由于功率增加,其產(chǎn)生的空化效應(yīng)增強(qiáng),細(xì)胞破裂更加完全,使黃酮溶出量升高。當(dāng)功率100 W 時(shí)黃酮得率最高為33.08 mg/g。功率超過100 W 后黃酮得率開始下降,可能是因黃酮已充分溶出,繼續(xù)增加功率,反而可能造成局部高溫,從而影響黃酮穩(wěn)定性[17]。最優(yōu)提取功率選擇為100 W。

    圖1 酶添加量對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.1 Effects of cellulose concentration on the flavonoids yield of red raspberry seed

    圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the flavonoids yield of red raspberry seed

    圖3 pH 值對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.3 Effects of pH on the flavonoids yield of red raspberry seed

    圖4 超聲功率對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic frequency onthe flavonoids yield of red raspberry seed

    2.1.5 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響 溫度可以改變酶的活性,從而影響酶解效果,進(jìn)而影響黃酮溶出[18]。如圖5所示,酶解溫度35~55 ℃范圍,黃酮得率顯著上升;當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)黃酮得率呈下降趨勢(shì),可能是溫度過高,使紅樹莓籽黃酮溶出量減少所致。當(dāng)溫度為55 ℃時(shí),紅樹莓籽黃酮得率達(dá)32.73 mg/g。選取55 ℃作為最佳提取溫度。

    2.1.6 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響如圖6所示。在提取時(shí)間15~45 min 時(shí)紅樹莓籽黃酮得率逐漸上升,45 min 時(shí)達(dá)到最大值,之后黃酮得率下降。提取時(shí)間過長(zhǎng)使得體系溫度升高,溶劑揮發(fā),從而降低黃酮得率[19]。最終選取提取時(shí)間為45 min。

    圖5 提取溫度對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on dissolution quantity of red raspberry seed flavonoids

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

    圖6 提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the flavonoids yield of red raspberry seed

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),選擇纖維素酶添加量(A)、超聲功率(B)和pH(C)為響應(yīng)因素,響應(yīng)面優(yōu)化以黃酮得率(Y)為響應(yīng)值做試驗(yàn),結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得到紅樹莓籽黃酮得率對(duì)纖維素酶添加量、超聲功率和pH 值的回歸方程為:Y=32.81-1.21A-0.53B+0.34C+1.00AB-0.17AC+1.41BC-3.88A2-0.84B2-2.22C2。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface methodology

    由表3可知,模型P 值極顯著,失擬項(xiàng)P 值不顯著,說明模型擬合度良好,誤差較小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.98,調(diào)整相關(guān)系數(shù)Radj2=0.97,二者數(shù)值較為接近,說明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間相關(guān)性較高。由F 值可知,各因素對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響排序依次為纖維素酶添加量>超聲功率>pH,其中纖維素酶添加量和超聲功率對(duì)黃酮得率的影響極顯著,纖維素酶添加量和超聲功率交互作用、超聲功率和pH 交互作用極顯著。模型能較好地反映紅樹莓籽黃酮得率隨各因素的變化規(guī)律。

    表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

    2.2.2 響應(yīng)面各因素間交互作用的優(yōu)化分析 響應(yīng)面圖是由響應(yīng)值和各自變量所構(gòu)成的三維立體曲面圖,是反映各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響,等高線圖直觀反映自變量的取值以及各因素間的交互作用。等高線圖中橢圓排列越密集,因素變化對(duì)黃酮得率影響越大,等高線圖形較圓說明因素交互作用不顯著[20]。圖7為各因素間的相互作用對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的影響。圖7b 中纖維素酶和超聲功率交互作用的等高線呈圓形,交互作用不顯著;由圖7a 可知纖維素酶和超聲功率的交互作用的等高線呈橢圓形,交互作用顯著,其響應(yīng)面圖曲線較陡,對(duì)紅樹莓籽黃酮得率影響較大;圖7c 超聲功率和pH 交互作用顯著,隨著超聲功率和pH 值的增加,紅樹莓籽黃酮得率提高,當(dāng)超聲功率升至74 W 時(shí),紅樹莓籽總黃酮含量達(dá)33.07 mg/g;當(dāng)超聲功率和pH 值繼續(xù)增大時(shí),紅樹莓籽黃酮得率反而下降,可能是由于功率過大使得局部溫度過高,從而影響黃酮的穩(wěn)定性,導(dǎo)致黃酮溶出量下降[17]。若能將超聲功率控制在74 W,pH 5.52,則能顯著提高黃酮得率。

    圖7 各因素間交互作用對(duì)紅樹莓籽黃酮得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for the effect of red raspberry seed on the flavonoids yield

    2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

    由響應(yīng)面軟件分析可知,當(dāng)纖維素酶添加量0.009 mg/mL、超聲功率74 W、pH 5.52 時(shí),黃酮得率預(yù)測(cè)值為33.07 mg/g。考慮實(shí)際操作條件,將工藝參數(shù)優(yōu)化為:纖維素酶添加量0.009 mg/mL,pH 5.5,超聲功率70 W,以此工藝參數(shù)做3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn),紅樹莓籽黃酮平均得率為34.33 mg/g,相對(duì)誤差3.81%,說明此回歸模型與實(shí)際情況具有良好的擬合性,所建模型準(zhǔn)確、可靠且具有實(shí)用價(jià)值。

    2.4 體外模擬胃腸道消化對(duì)紅樹莓籽黃酮濃度的影響

    2.4.1 體外胃消化對(duì)紅樹莓籽黃酮濃度的影響 紅樹莓籽黃酮體外模擬胃消化變化規(guī)律如圖8所示。胃消化0~0.5 h,空白組與消化組的黃酮濃度均有所上升,說明酸性環(huán)境能夠促進(jìn)黃酮釋放。在消化0.5~2.5 h 組的黃酮濃度逐漸升高,而空白黃酮濃度無顯著變化,且消化組黃酮濃度始終大于空白組。消化2.5 h 組黃酮濃度達(dá)到最大值1.01 mg/mL,是0 h 的1.51 倍,是空白組2.5 h 的1.28倍。2.5 h 后消化組黃酮濃度無顯著變化,表明酸性環(huán)境有利于黃酮釋放。紅樹莓籽黃酮經(jīng)體外胃消化后黃酮濃度有所增加,說明胃蛋白酶促進(jìn)黃酮的釋放,易于人體吸收。

    2.4.2 體外腸消化對(duì)紅樹莓籽黃酮的影響 紅樹莓籽黃酮體外模擬腸消化規(guī)律如圖9所示。0~3.0 h 內(nèi)空白組黃酮濃度無顯著變化;模擬腸消化在0~1.5 h 內(nèi)消化組紅樹莓籽黃酮濃度顯著升高,而在1.5~3.0 h 內(nèi)消化組的黃酮濃度趨于平緩、無顯著變化。腸消化2.5 h 消化組黃酮質(zhì)量濃度最高1.32 mg/mL,是初始的1.30 倍,是空白組的1.59倍,消化組的濃度始終高于空白組。結(jié)果表明紅樹莓籽黃酮經(jīng)體外腸消化后濃度有所上升,說明胰蛋白酶能促進(jìn)紅樹莓籽黃酮的釋放。

    圖8 紅樹莓籽黃酮對(duì)體外胃消化的影響Fig.8 The effect of the flavonoids on the stomach digestion in vitro

    圖9 紅樹莓籽黃酮對(duì)體外腸消化的影響Fig.9 The effect of the flavonoids on the intestinal digestion in vitro

    3 結(jié)論

    1) 通過單因素試驗(yàn)確定超聲波與纖維素酶輔助提取紅樹莓籽黃酮的最佳條件為:超聲功率100 W、纖維素酶添加量0.01 mg/mL、pH 5.5、提取溫度55 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間45 min。利用Box-Behnken 法得到優(yōu)工藝條件為:纖維素酶添加量0.009 mg/mL、超聲功率70 W、pH 5.5,此條件下紅樹莓籽黃酮得率達(dá)34.33 mg/g,模型與實(shí)際擬合度良好,可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

    2) 通過建立體外胃腸道消化模型可知,模擬胃消化2.5 h 的黃酮濃度是空白組2.5 h 的1.28倍,說明胃蛋白酶促進(jìn)黃酮釋放。模擬腸消化2.5 h 黃酮濃度是空白組的1.59 倍,是模擬腸液0 h的1.30 倍,說明胰蛋白酶也促進(jìn)黃酮的釋放。紅樹莓籽黃酮經(jīng)過體外消化釋放量增加,可供人體進(jìn)一步吸收、利用。

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