培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌LIP-1抗冷凍活性的影響

李明慧 尚一娜 霍麒文 陳 境 張曉寧 邢葉妮 楊姝玉 王俊國(guó)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

高密度發(fā)酵技術(shù)（High Cell Density Culture）是指微生物在液體培養(yǎng)基中菌體發(fā)酵密度較普通培養(yǎng)方法顯著提高，且超過常規(guī)培養(yǎng)10 倍以上的培養(yǎng)技術(shù)[1]。優(yōu)化菌體的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件是目前常用的技術(shù)方法[2]。相比于培養(yǎng)基成分的改變，培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法更加簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本更加低廉，更有利于實(shí)施工業(yè)化。

真空冷凍干燥技術(shù)（Vacuum Freeze -Drying Technology）是將細(xì)胞懸浮液凍結(jié)后，在真空低溫環(huán)境下使冰晶升華，物料脫水變成凍干菌粉的一種干燥技術(shù)[3]。冷凍干燥技術(shù)能長(zhǎng)時(shí)間地保持菌株的活力，便于發(fā)酵劑的貯存和工業(yè)化應(yīng)用[4]。在凍干過程中會(huì)給菌體帶來(lái)傷害，導(dǎo)致菌種活力下降，甚至失水死亡。許多研究證實(shí)通過添加保護(hù)劑或改善冷凍干燥的工藝條件均能提高菌株的凍干存活率[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件也可以提高菌體抗冷凍干燥的性能。

綜上所述，通過改變培養(yǎng)條件不但能夠增加高密度發(fā)酵的活菌數(shù)，而且有可能對(duì)菌株的冷凍干燥抗性產(chǎn)生影響。目前研究培養(yǎng)條件對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)影響的課題很多，而兼顧提高高密度發(fā)酵后的活菌數(shù)的同時(shí)，增強(qiáng)菌株冷凍干燥抗性的研究卻很少。

本試驗(yàn)中以益生菌植物乳桿菌 （L.plantarum）LIP-1 為研究對(duì)象，該菌株具有良好的降血脂功效[6]。以實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用高密度發(fā)酵的活菌數(shù)及冷凍干燥菌株的存活率為對(duì)象，探討改變培養(yǎng)條件是否可增加菌種的冷凍干燥抗性及其穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。

1 材料與方法

1.1 菌種

采用植物乳桿菌LIP-1，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

冷凍保護(hù)劑，MRS優(yōu)化培養(yǎng)基[7]、MRS培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基。

1.3 儀器、設(shè)備

ZHJH-1214B 凈化工作臺(tái)，南京依貝儀器設(shè)備有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋MLS-3750；高速離心機(jī)，德國(guó)eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272 型），上海；全自動(dòng)干熱滅菌器（ADVANTEC SP-650 型），日本；真空冷凍干燥機(jī)，Labconco FreeZone。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用單因素試驗(yàn)研究不同培養(yǎng)條件（溫度、培養(yǎng)基初始pH 及其接種量） 對(duì)菌株高密度發(fā)酵活菌數(shù)和凍干存活率的影響。以此為結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)條件。

2.2 菌株的活化

本試驗(yàn)的接種量為2%（體積分?jǐn)?shù)，下同），37℃，培養(yǎng)18 h?；罨瓴捎妹撝榕囵B(yǎng)基，再傳代MRS 培養(yǎng)基中，采用3 代菌株做試驗(yàn)。

2.3 最適培養(yǎng)溫度的確定

以優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以25，30，34，37，42 ℃5 個(gè)溫度為改變因素，按2%接種量接種發(fā)酵18 h，4 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水按上述方法洗滌兩次，添加滅菌的冷凍保護(hù)劑2 mL，振蕩混勻，取1 mL 計(jì)算活菌數(shù)。另取1 mL 置離心管中-70 ℃預(yù)凍，冷凍干燥18 h 后復(fù)水1 mL，計(jì)算冷凍干燥存活率，確定最適培養(yǎng)溫度。

2.4 最適培養(yǎng)基初始培養(yǎng)pH 的確定

將前優(yōu)化培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至5.0，5.6，6.2，6.8，7.4，按2%接種量接種，在最適培養(yǎng)溫度下發(fā)酵18 h 后測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)pH，計(jì)算活菌數(shù)和凍干存活率，具體方法同上，確定最適培養(yǎng)基初始培養(yǎng)pH。

2.5 最適接種量的確定

以前面試驗(yàn)確定的最適培養(yǎng)溫度和初始培養(yǎng)pH 為條件，將接種量分別設(shè)定為2%，4%，6%，8%，10%，發(fā)酵18 h 后，計(jì)算活菌數(shù)和凍干存活率，具體方法同上，確定最適接種量。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化高密度發(fā)酵存活率和抗冷凍性能的培養(yǎng)條件。

采用響應(yīng)面優(yōu)化法，根據(jù) Box-Behnken 原理，以發(fā)酵培養(yǎng)基的初始培養(yǎng)pH 值、培養(yǎng)溫度、接種量3 個(gè)因素為自變量，以高密度發(fā)酵后的菌落數(shù)及凍干存活率為響應(yīng)值，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)條件。根據(jù)響應(yīng)面分析法得出的最佳生長(zhǎng)條件，驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 22.0 系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)。以Box－Behnken 進(jìn)程對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行二次響應(yīng)面分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)冷凍干燥存活率的作用效果

培養(yǎng)溫度是影響菌株發(fā)酵活力的一項(xiàng)重要因素。從圖1可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，高密度發(fā)酵菌數(shù)最高，達(dá)9.9456 lg（CFU/mL），其后隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)，37 ℃時(shí)菌數(shù)為9.8823 lg（CFU/mL），減少1%，差異顯著（P<0.05）。培養(yǎng)溫度的改變對(duì)菌體的抗冷凍干燥性能的影響差異顯著，37 ℃時(shí)LIP-1 的冷凍干燥存活率最高，為81.61%，較30 ℃高8.80%，差異顯著（P<0.05）。綜合考量?jī)蓚€(gè)因素，選擇37 ℃做下一步試驗(yàn)。

周金雨等[8]對(duì)植物乳桿菌KLDS 1.0391 的研究證實(shí)了植物乳桿菌在34 ℃環(huán)境下高密度發(fā)酵效果更好。白永強(qiáng)等[9]對(duì)植物乳桿菌Zhang-LL 高密度發(fā)酵的研究也證實(shí)高密度發(fā)酵植物乳桿菌的最適溫度為34 ℃。而植物乳桿菌LIP-1 在30 ℃時(shí)高密度發(fā)酵活菌數(shù)最高，這可能與其特性有關(guān)，該菌株分離自新疆地區(qū)的酸馬奶中，所屬環(huán)境溫度較低，最適培養(yǎng)溫度與其它植物乳桿菌相比較低。

Li 等[10]對(duì)保加利亞乳桿菌L2 的研究表明，在較低溫度下培養(yǎng)乳酸菌，可以提高菌株冷凍干燥存活率，這是由于在低溫條件下，細(xì)胞膜中乳酸脫氫酶數(shù)量增多，使細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性得到改善，減少了細(xì)胞膜的損傷[11]，從而提高菌體的抗冷凍性[12]。大量研究表明在較低的溫度下培養(yǎng)細(xì)菌，使細(xì)胞膜中乳酸脫氫酶增加[11]，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量增加，提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高菌體的抗冷凍性[13]。Liu 等[14]將羅伊氏乳桿菌I5007 的培養(yǎng)溫度從37 ℃提至42 ℃，6 h 后與37 ℃對(duì)比，其冷凍的存活率提至17.87%，細(xì)胞膜中UFA/SFA 的比值明顯提高。植物乳桿菌LIP-1 最適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃，37 ℃培養(yǎng)的凍干存活率顯著高于25 ℃的，這可能與菌株的特異性有關(guān)。

3.2 不同培養(yǎng)pH 值對(duì)冷凍干燥存活率的作用效果

由圖2可知，37 ℃培養(yǎng)時(shí)活菌數(shù)因初始培養(yǎng)pH 值的升高，高密度發(fā)酵活菌數(shù)呈先增加后減少的趨勢(shì)，在初始pH 值6.8 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，為9.924 lg（CFU/mL），隨后活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)；冷凍干燥后的活菌數(shù)在初始培養(yǎng)pH 值為6.8時(shí)最高（82.39%），明顯多于其它4 組（P<0.05）。最終確定最適培養(yǎng)pH 值為6.8。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)植物乳桿菌LIP-1 的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on Lactobacillus plantarum LIP-1

圖2 不同初始培養(yǎng)pH 值對(duì)植物乳桿菌LIP-1 的影響Fig.2 Effect of different culture pH on Lactobacillus plantarum LIP-1

表1 初始培養(yǎng)pH 值和發(fā)酵終點(diǎn)pH 值Table 1 Initial culture pH and end point of fermentation pH

不同乳酸菌的生長(zhǎng)最適pH 值是不同的，選擇適宜的pH 值對(duì)其高密度發(fā)酵能力起促進(jìn)作用[15]。試驗(yàn)結(jié)果表明：pH 6.8 時(shí)高密度發(fā)酵產(chǎn)生的活菌數(shù)最多。這可能是因?yàn)椴贿m宜的pH 值抑制試驗(yàn)菌株細(xì)胞內(nèi)酶的活性，以及細(xì)胞膜攜帶電荷的狀態(tài)[16]，改變細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，影響菌體代謝和吸收，抑制菌體生長(zhǎng)。

初始培養(yǎng)pH 6.8 較pH 5.0 時(shí)菌株冷凍干燥存活率最高，這與Liu 等[17]的試驗(yàn)結(jié)果相似，羅伊氏乳桿菌I5007 在pH 5.7 與pH 6.7 的培養(yǎng)條件下，其冷凍存活率從12.95%提高到27.38%，這可能是由于pH 6.8 時(shí)菌株與酸的作用能力強(qiáng)，中和性能好，可以快速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。研究表明發(fā)酵過程中的pH 值變化會(huì)引起細(xì)胞膜中的脂肪酸這類成分變化[18]，改變其流動(dòng)性，影響菌體抗性[12]。李華等[11，19]也認(rèn)為發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，較低的培養(yǎng)基pH 更有助于C19cyc11 的合成，可以提高冷凍干燥存活率。在pH 6.8 時(shí)發(fā)酵終點(diǎn)pH 值為3.91，這是因?yàn)榘l(fā)酵結(jié)束時(shí)較低的pH 值更有利于合成不飽和脂肪酸，調(diào)節(jié)冷凍干燥過程中細(xì)胞膜的流動(dòng)性，提高菌體抗冷凍活性。

3.3 接種量對(duì)冷凍干燥存活率的作用效果

如圖3可知，接菌量在2%，4%，6%，8%時(shí)，隨著接種量的增大，高密度發(fā)酵活菌數(shù)增加，在接種量為10%時(shí)，高密度發(fā)酵活菌數(shù)較8%有所降低。由此可以看出，在一定的范圍，接種濃度越高，菌體的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值越大，然而當(dāng)接種量過多時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分不能供給菌體生長(zhǎng)，菌體的繁殖受到限制，菌體產(chǎn)酸過快，在相對(duì)適應(yīng)的環(huán)境下菌體生長(zhǎng)受到酸性環(huán)境的抑制。因接種量為8%時(shí)活菌數(shù)最多達(dá)9.998lg（CFU/mL），故選擇8%接種量為宜（P<0.05）。

接種濃度過低，影響菌株生長(zhǎng)的速度，而菌種濃度過高使其發(fā)酵和產(chǎn)酸的能力下降[20]。接種量的多少可以改變菌體的密度，菌體密度的多少可以改變發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間。本試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間都是18 h，造成菌體密度差異（P=0.05）。

從圖3可以看出，冷凍干燥后的存活率在81%左右，并未隨著接種量的改變有明顯差異（P＜0.05），說明接種量的多少雖然對(duì)發(fā)酵有影響，但是并不能改變凍干存活率，這可能是由于接種量的增加提高了植物乳桿菌LIP-1 的活菌數(shù)，而不能提高菌體的冷凍干燥抗性。

3.4 二次響應(yīng)面分析對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以單因素的試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，通過Box-Behnken 對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量3 個(gè)因素進(jìn)行雙因素三水平分析，結(jié)果見表2。

圖3 接菌量增加對(duì)植物乳桿菌LIP-1 影響Fig.3 Effect of different inoculum size on Lactobacillus plantarum LIP-1

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 高密度發(fā)酵后活菌數(shù)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation for the number of high cell density cultivation of Lactobacillus plantarum LIP-1

（續(xù)表3）

表4 冷凍干燥后凍干存活率的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equation for the survival rate of freeze-drying

通過Design Expert 軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量及高密度發(fā)酵菌數(shù)、冷凍干燥存活率間的回歸方程，如（1）（2）所示。

對(duì)表3數(shù)據(jù)的分析表明，高密度發(fā)酵后活菌數(shù)模型P＜0.0001（極顯著），失擬項(xiàng)=0.1590（不顯著），模型確定系數(shù)R2=0.9931，校正系數(shù)R2adj=0.9842；對(duì)菌株抗冷凍干燥性的預(yù)測(cè)方差（表4）分析表明，模型P＜0.0001（極顯著），失擬項(xiàng)=0.4058（不顯著），模型確定系數(shù)R2=0.9837，校正系數(shù)R2adj=0.9627，以上結(jié)果均說明本預(yù)測(cè)模型和實(shí)際試驗(yàn)設(shè)計(jì)的擬合度較高，可以用來(lái)預(yù)測(cè)菌體的生長(zhǎng)情況和冷凍干燥后的存活率。對(duì)任兩個(gè)組數(shù)據(jù)對(duì)比來(lái)探討試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見響應(yīng)曲面圖4；任兩組數(shù)據(jù)對(duì)比試驗(yàn)菌株的冷凍干燥存活率見圖5。響應(yīng)面圖的曲率反映各因素相互作用對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的影響，若曲率呈圓形，則交互作用不顯著；若曲率是橢圓形，則交互作用顯著[21]。

圖4 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量相互影響LIP-1 高密度發(fā)酵活菌數(shù)的響應(yīng)效果圖Fig.4 Response surface plots showing the effects of culture temperature，culture pH and inoculation amount on the cell concentration of Lactobacillus plantarum LIP-1

圖4表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度一定時(shí)，高密度發(fā)酵活菌數(shù)隨著初始培養(yǎng)pH 值的增加不斷增加，達(dá)到一定的pH 值時(shí)，高密度發(fā)酵的活菌數(shù)緩慢降低；當(dāng)初始培養(yǎng)pH 值一定時(shí)高密度發(fā)酵活菌數(shù)隨著培養(yǎng)溫度的升高逐漸增加，達(dá)到一定溫度時(shí)，活菌數(shù)緩慢降低，說明培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)的初始pH 值對(duì)活菌數(shù)的增長(zhǎng)有一定的作用，曲率成圓形說明交互效果不顯著；溫度和接菌量的的曲率呈橢圓形，說明溫度和接菌量對(duì)活菌數(shù)的增加是有影響的，且交互效應(yīng)較為顯著；培養(yǎng)pH 值和接種量對(duì)植物乳桿菌LIP-1 菌體的生長(zhǎng)也有一定的影響，曲率呈圓形說明作用效果并不明顯。

由圖5可看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度一定時(shí)，冷凍干燥的存活率隨著接菌量的增加不斷增加，達(dá)到一定的接菌量時(shí)，冷凍干燥緩慢降低；當(dāng)接菌量一定時(shí)冷凍干燥存活率隨著培養(yǎng)溫度的升高逐漸增加，達(dá)到一定溫度時(shí)，凍干存活率緩慢降低，培養(yǎng)溫度和接菌量值對(duì)菌體的繁殖也有一定的作用，曲率成橢圓形說明交互效果顯著。對(duì)3 組圖的分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度和pH 值以及接種量的改變對(duì)LIP-1菌體的凍干存活率均有較顯著的影響。

圖5 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量相互影響LIP-1 冷凍干燥凍干存活率的響應(yīng)效果圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of culture temperature，culture pH and inoculation amount on the survival rate of freeze-drying of Lactobacillus plantarum LIP-1

從單因素和響應(yīng)面結(jié)果得出，在30 ℃培養(yǎng)條件下，植物乳桿菌LIP-1 的發(fā)酵活性較好，然而相對(duì)于初始培養(yǎng)溫度37 ℃來(lái)說，其抗冷凍干燥的能力較差。經(jīng)響應(yīng)面分析的培養(yǎng)溫度為36 ℃時(shí)菌體抗冷凍干燥性好，這可能是與37 ℃的培養(yǎng)溫度相比，低溫培養(yǎng)時(shí)可以促進(jìn)環(huán)丙烷脂肪酸的合成，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，穩(wěn)定細(xì)胞膜的組成成分，并可調(diào)節(jié)胞內(nèi)酶的活性。

響應(yīng)面優(yōu)化的pH 值為6.7 時(shí)菌體的高密度發(fā)酵活力及抗冷凍干燥活力最佳，這可能是菌株與酸的作用能力最強(qiáng)，中和性能較好，有利于菌體發(fā)酵。雖然不同的培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌LIP-1造成一定的影響，但不同的接菌量并不能改善高密度發(fā)酵和冷凍干燥損傷情況。

綜上，預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件為：溫度35.91℃、pH 值6.7、接種量為8.83%。預(yù)測(cè)高密度發(fā)酵后LIP-1 的活菌數(shù)為10.175 lg（CFU/mL），經(jīng)過冷凍干燥的凍干存活率可達(dá)到83.48%。

以預(yù)測(cè)結(jié)果為條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，將LIP-1以8.8%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，在pH 6.7、36 ℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)18 h。試驗(yàn)測(cè)得高密度發(fā)酵菌數(shù)為10.1855 lg（CFU/mL），這與預(yù)測(cè)的結(jié)果相似率為99.89%；凍干存活率為83.40%，與預(yù)測(cè)值的相似率為99.90%。

4 結(jié)論

通過改變培養(yǎng)條件（溫度、接種量、初始培養(yǎng)pH）以提高植物乳桿菌LIP-1 高密度發(fā)酵活菌數(shù)以及抗冷凍干燥的存活率。在響應(yīng)面優(yōu)化后獲得最佳培養(yǎng)條件參數(shù)：發(fā)酵溫度36 ℃、初始培養(yǎng)pH 6.7、接種量8.8%，在此條件下植物乳桿菌LIP-1活菌數(shù)為10.1855 lg（CFU/mL），冷凍干燥后的存活率達(dá)83.40%，較優(yōu)化培養(yǎng)條件前均有顯著提高（P<0.05）。該結(jié)果為通過改變培養(yǎng)條件提高菌株的高密度發(fā)酵活菌數(shù)以及凍干存活率提供了試驗(yàn)依據(jù)。