藍莓采后病原菌胞外脂肪酶的提取及粗酶性質研究

柳 萌 劉瑞玲 郜海燕* 吳偉杰 孫 健 吳曉蒙 周劍忠 李 斌

（1 浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所 農業(yè)農村部果品產后處理重點實驗室中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室 浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室 杭州310021 2 廣西農業(yè)科學院農產品加工研究所 南寧530007 3 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083 4 江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所 南京210014 5 沈陽農業(yè)大學食品學院 沈陽110866）

藍莓（Vaccinium corymbosum），杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp.），富含花色苷、維生素C 等營養(yǎng)成分[1]，具有良好的保健作用。藍莓在貯藏期間極易受到病原真菌的侵染，使得藍莓行業(yè)發(fā)展受到嚴重限制，它的主要致病菌為灰霉菌[2-5]。灰霉菌（Botrytis cinerea）是一種空氣傳播的植物病原菌[6]，在入侵宿主表面時分泌，減小表面疏水性，分解蠟質層的蛋白（主要為角質酶、絲氨酸酯酶、脂肪酶和其它非特異性酯酶[7]等胞外酶）及代謝物，為其它致病因子提供入口[8]，最終引起果實腐爛。近10年關于灰霉菌胞外酶與發(fā)病機理的相關性研究主要集中于果膠酶及細胞壁降解酶。

脂肪酶（三酰甘油?；饷福珽C 3.1.1.3）在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，可在非水相條件下催化酯化、酯交換、醇解和酸解等反應[9]。擬南芥中的酯酶基因AtCXE8 在真菌感染后高度表達[10]。在一些谷物、果蔬貯藏期間使用脂肪酶抑制劑，其發(fā)病率顯著降低，貯藏期得到延長，進一步的研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌的脂肪酶基因FGL1 被抑制后毒力顯著降低[11]。這些結果均表明脂肪酶在植物-病原菌相互作用過程中的重要性。灰霉菌的胞外脂肪酶成為采后保鮮技術的可能關鍵控制點。

本文針對藍莓采后病原菌灰霉分泌的胞外脂肪酶，通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高其產率，并對酶學性質進行初步研究，為灰霉菌胞外酶的后續(xù)研究，藍莓采前病害防治及采后品質保護提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：實驗室保藏菌株，從自然發(fā)病的"燦爛"藍莓中分離獲得。

PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL。基礎培養(yǎng)基：KH2PO4200 g、MgSO45 g、KCl 5 g、蒸餾水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，氯化鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硝酸鈉2 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。

棕櫚酸對硝基苯酯及阿拉伯膠，阿拉?。涣姿釟涠c、碳酸鈉等試劑均為國產分析純級。

1.2 設備與儀器

水浴鍋；臺式冷凍離心機，德國Thermo 公司；超凈工作臺，蘇靜集團安泰有限公司；恒溫搖床，上海智能分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株氏會社；Cintra404 紫外-可見光分光光度計，澳大利亞GBC 科技儀器公司。

1.3 酶活力測定

采用橄欖油乳化法[12]及棕櫚酸-對硝基苯酯法測定[13]。

1.4 發(fā)酵條件的確定

1.4.1 發(fā)酵時間的確定 灰霉菌在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 后，用打孔器在菌落邊緣打下直徑約1 cm 的菌餅，接種到液體培養(yǎng)基中，在25 ℃下160 r/min 震蕩培養(yǎng)[14]。分別培養(yǎng)48，60，72，84，96，108 h，研究不同發(fā)酵時間對灰霉菌產脂肪酶的影響。

1.4.2 發(fā)酵溫度的確定 以液體培養(yǎng)基為基質，分別置于20，25，30，35，40 ℃的搖床中，以160 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h，研究不同發(fā)酵溫度對灰霉菌產脂肪酶的影響。

1.5 培養(yǎng)基的確定

1.5.1 碳源種類對灰霉菌產脂肪酶的影響 添加1%（質量分數(shù)）牛肉膏作為基礎培養(yǎng)基的氮源，分別以蔗糖、乳糖、無水葡萄糖、無水碳酸鈉及橄欖油作為碳源，培養(yǎng)5 d 后置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，按確定的最佳發(fā)酵溫度及時間培養(yǎng)，測定酶活力來確定最佳碳源[15]。以接種灰霉菌菌餅的發(fā)酵液為試驗組，不接種菌餅的為對照組。

1.5.2 氮源種類對灰霉菌產脂肪酶的影響 添加1%（質量分數(shù)）橄欖油作為基礎培養(yǎng)基的碳源，分別以牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉及尿素作為氮源，發(fā)酵培養(yǎng)后測定酶活力來確定最佳氮源。

1.5.3 初始pH 對灰霉菌產脂肪酶的影響 分別添加1%（質量分數(shù)）牛肉膏和1%（質量分數(shù)）橄欖油作為基礎培養(yǎng)基的氮源和碳源，將初始培養(yǎng)基的pH 設定為5.0，6.0，7.0，8.0，9.05 個梯度，發(fā)酵培養(yǎng)后測定酶活力，確定最佳初始pH。

1.6 粗酶酶學性質研究

灰霉菌經固體培養(yǎng)基培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，得到上清液。在冰浴條件下，取10 mL 上清液加入飽和度為85%的硫酸銨。4 ℃下靜置過夜后以10 000 r/min 的速度離心30 min，棄上清液，沉淀用10 mL 20 mmol/L PB 緩沖溶液（pH 7.0）溶解。將上述溶解在PB 緩沖溶液中的粗酶液轉移到透析袋中，期間更換2～3 次緩沖溶液，透析24 h，所得液體即灰霉菌脂肪酶粗酶液，用于后續(xù)酶學性質研究。

1.6.1 酶反應最適pH 及酸堿耐受性 在50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH4.0～8.0）和50 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.0～10.0）中測定不同反應pH 下的酶活力，最高酶活力設為100%。在不同pH 緩沖液中，28 ℃水浴處理1 h，測定殘余酶活力，確定pH 穩(wěn)定性，設定pH7.0 時的殘余酶活力為100%[16]。

1.6.2 酶作用最適溫度及熱穩(wěn)定性 取1 mL 粗酶液，調節(jié)pH 至酶反應最適pH，分別于25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃中 反 應10 min，測定酶活力，以確定該酶的最適反應溫度。取粗酶液分別置于40，50，60，70，80 ℃的水浴環(huán)境中，期間每隔10 min 測定酶活力，持續(xù)1 h，以確定該酶的熱穩(wěn)定性。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，每組重復3 次。

1.6.3 有機溶劑耐受性能 取1 mL 粗酶液，分別加入甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、丙酮、二甲苯、三氯甲烷，將有機溶劑的體積分數(shù)設置3 個水平，分別為10%，30%，50%，加入等量蒸餾水的粗酶液為對照組，28 ℃搖床處理1 h，測定殘余酶活力[17]。

1.6.4 金屬離子對脂肪酶粗酶活力的影響 取5 mL 粗酶液，分別加入終濃度為10 mmol/L 的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+。以加入等量蒸餾水的粗酶樣品為對照，28 ℃搖床處理1 h，測定殘余酶活力。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有指標均重復測定3 次，結果為3 次平行試驗的平均值。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 23軟件進行差異顯著性分析 （P<0.05，表示差異顯著），圖片繪制采用GraphPad Prism 5 處理。

2 結果與分析

2.1 灰霉菌產酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時間對灰霉菌產脂肪酶的影響 發(fā)酵時間對灰霉菌產胞外脂肪酶的影響如圖1所示。隨著發(fā)酵時間的加長，脂肪酶活性呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)至48 h 時，灰霉菌胞外脂肪酶活力較低，僅為0.25 IU/mL；當培養(yǎng)至60 h 時，灰霉菌胞外脂肪酶活力較培養(yǎng)48 h 時顯著升高（P＜0.05）；培養(yǎng)72 h 和84 h 的脂肪酶活均顯著高于48 h 的，稍高于培養(yǎng)60 h 時的且無顯著性差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)至96 h 時，脂肪酶活達到培養(yǎng)期間最高值，顯著高于培養(yǎng)84 h（P<0.05）；然后隨著培養(yǎng)時間的延長，脂肪酶活力下降，在108 h 時脂肪酶活未檢出。96 h 為產酶最佳發(fā)酵時間。

2.1.2 發(fā)酵溫度對灰霉菌產脂肪酶的影響 發(fā)酵溫度對灰霉菌產胞外脂肪酶的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵溫度的增加，脂肪酶的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為20 ℃時，胞外脂肪酶活為0.5 IU/mL；25 ℃時，脂肪酶活為0.67 IU/mL，顯著高于20 ℃培養(yǎng)時的酶活；隨著發(fā)酵溫度的增加，胞外酶活力持續(xù)增加，在35 ℃時酶活達到最高值，然而與25 ℃、30 ℃培養(yǎng)時均無顯著性差異（P＞0.05）；當40℃培養(yǎng)時，灰霉菌胞外脂肪酶活較35 ℃培養(yǎng)時顯著下降，并顯著低于20 ℃培養(yǎng)時的脂肪酶活（P＜0.05）。25，30 ℃和35 ℃培養(yǎng)的脂肪酶活雖顯著高于20 ℃，但它們之間無顯著性差異?？紤]到25 ℃更適合灰霉菌生長繁殖[18]，因此選擇25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵時間對灰霉菌產酶的影響Fig.1 Effect of fermentation time on lipase production by Botrytis cinerea

圖2 發(fā)酵溫度對灰霉菌產酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on lipase production by Botrytis cinerea

2.1.3 碳源種類對灰霉菌產脂肪酶的影響 不同碳源對灰霉菌產胞外脂肪酶的影響如圖3所示。分別以橄欖油和蔗糖作碳源時，灰霉菌胞外脂肪酶活力較高，顯著高于以乳糖、無水葡萄糖、無水碳酸鈉作為碳源時的脂肪酶活（P＜0.05）。橄欖油作為碳源培養(yǎng)時脂肪酶活稍高于蔗糖，然而兩者間無顯著性差異（P＞0.05）；以乳糖和無水碳酸鈉分別作為碳源的酶活力相近，無顯著性差異（P＞0.05）；而以無水葡萄糖為碳源培養(yǎng)時，基本無酶活性?？紤]到橄欖油在整個發(fā)酵過程中既作為碳源又是脂肪酶的誘導物，不僅有利于菌體生長，提高脂肪酶水解活力，還可使脂肪酶的合成活力顯著增加[19]。選擇橄欖油作為最佳產酶碳源。

2.1.4 氮源種類對灰霉菌產脂肪酶的影響 以牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉和尿素分別作為氮源對灰霉菌進行培養(yǎng)，結果如圖4所示。以蛋白胨作為氮源培養(yǎng)灰霉菌時，脂肪酶活力最高，并顯著高于其余4 種氮源（P<0.05）；其次是以尿素作為氮源培養(yǎng)時的脂肪酶活；以牛肉膏和酵母粉作為氮源培養(yǎng)時，脂肪酶活較低，均顯著低于以蛋白胨和尿素作為氮源培養(yǎng)時的脂肪酶活 （P＜0.05），而以牛肉膏和酵母粉培養(yǎng)時，二者無顯著性差異（P＞0.05）；以硫酸銨為氮源培養(yǎng)時酶活最低，基本無酶活性。最終選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基最優(yōu)氮源。

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH 對灰霉菌產脂肪酶的影響 在不同初始pH 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，脂肪酶活的變化情況如圖5所示。在pH 5.0～7.0 范圍，脂肪酶活隨著培養(yǎng)基中初始pH 值的增加而增加，pH 7.0 是最佳產酶酸堿度。當培養(yǎng)基的pH 值逐漸趨于堿性時，脂肪酶活顯著下降（P＜0.05）。這些結果表明灰霉菌在中性及偏弱酸性的環(huán)境下有利于產酶。

圖3 不同碳源對灰霉菌產酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sourceson lipase production of Botrytis cinerea

圖4 不同氮源對灰霉菌產酶的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sourceson lipase production of Botrytis cinerea

圖5 不同培養(yǎng)基初始pH 對灰霉菌產酶的影響Fig.5 Effects of different initial pH of media on lipase production of Botrytis cinerea

2.2 灰霉菌胞外脂肪酶的粗酶性質

2.2.1 溫度對脂肪酶粗酶活力及穩(wěn)定性的影響在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下獲得脂肪酶粗酶液，在25～80 ℃范圍，每隔5 ℃測定同一酶液的酶活性，結果如圖6a 所示。脂肪酶粗酶的相對酶活力在25～40 ℃之間隨溫度的升高而增大，40 ℃時達到最大值，之后隨著溫度的上升相對酶活力逐漸降低。溫度對脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響如圖6b 所示。灰霉菌所產脂肪酶在40 ℃條件下處理60 min，相對酶活仍保持在50%以上，說明脂肪酶在此溫度下穩(wěn)定性較好。70 ℃處理40 min，相對酶活也保持在50%以上，之后隨著處理時間的延長酶活快速下降。80 ℃條件下處理30 min，相對酶活力下降到40%以下。以上結果表明脂肪酶在40～70℃之間具有較高的酶活性，灰霉菌所產脂肪酶屬于中度耐熱脂肪酶。

圖6 溫度對脂肪酶粗酶酶活（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity （a） and stability （b）of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.2 pH 對脂肪酶粗酶活力及穩(wěn)定性的影響pH 對脂肪酶粗酶活力的影響如圖7a 所示。在pH4～10 的范圍，相對酶活力隨著pH 的增加而逐漸增大，pH 9.0 時相對酶活力最高，隨后逐漸降低。pH 對脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響如圖7b 所示。脂肪酶粗酶在pH 5.0～10.0 范圍比較穩(wěn)定，當pH值低于5.0 時，酶活性受到較大的影響，推斷灰霉菌的胞外脂肪酶可能為堿性酶。

圖7 pH 對脂肪酶粗酶酶活（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.7 Effect of pH on the activity （a） and stability （b） of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.3 灰霉菌脂肪酶粗酶的有機溶劑耐受性能灰霉菌胞外脂肪酶對不同有機溶劑的耐受能力如表1所示。極性強的有機溶劑容易奪取酶分子的結合水而降低酶的活性或使酶完全失活。異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇和丙酮等極性強的有機溶劑，與空白組相比脂肪酶活降低。而在極性較弱的乙酸乙酯和二甲苯中脂肪酶處于激活狀態(tài)。有機溶劑的激活作用可從多方面解釋，比如誘導形成有利的蛋白質構象，增加α-螺旋的比例，促進底物進入活性中心，改變底物-水界面等[20-22]。值得注意的是，脂肪酶在三氯甲烷這一極性較弱的有機溶劑中被顯著抑制。在單一的有機溶劑中，隨著添加量的增加，脂肪酶粗酶的酶活逐漸降低，這可能是因為有機溶劑添加量越高，游離酶越容易聚集，導致單一酶與底物接觸受阻而影響反應速率。

表1 灰霉菌胞外脂肪酶對不同有機溶劑的耐受能力Table 1 Effect of organic solvents on the stability of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.4 金屬離子對脂肪酶粗酶活力的影響 不同金屬離子對脂肪酶粗酶酶活的影響不同。金屬離子對酶活性的發(fā)揮產生影響，它們可與酶活性中心的相關基團作用，改變酶的構象，從而影響酶的活性[23]。在Na+、K+、Cu2+等6 種金屬離子中，與空白組相比，Na+和Fe3+顯著激活脂肪酶活，這一特性與根霉Rhizopus ZM-10 所產脂肪酶相符[24]，而與黑曲霉Aspergillus niger F044 不符[25]。K+、Cu2+、Ca2+、Mg2+顯著抑制脂肪酶活。大量文獻報道，Cu2+和Ca2+能夠促進脂肪酶活[26-28]，而在本試驗中Cu2+和Ca2+抑制了灰霉菌的胞外脂肪酶活，這一特性與黑曲霉Aspergillus niger Li-38[29]和黃青霉Penicillium chrysogenum J23[30]所產的脂肪酶相符，可見同一金屬離子對不同來源的脂肪酶的影響不同。

圖8 金屬離子對脂肪酶粗酶酶活的影響Fig.8 Effects of metal ionson the activity of crude lipase from Botrytis cinerea

3 結論與討論

脂肪酶是藍莓采后病原菌灰霉（Botrytis cinerea）的致病因子之一。通過單因素試驗對其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出的最佳產酶培養(yǎng)基為：橄欖油1%、蛋白胨1%，pH 7.0，發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時間96 h。

本研究發(fā)現(xiàn)，在40 ℃、pH 9.0 的條件下，該灰霉菌胞外脂肪酶具有最佳的酶活力，這與米雁等[31]的研究結果相似，脂肪酶的最適反應溫度范圍為38～45 ℃。此外，微生物脂肪酶屬于中性或堿性脂肪酶[32]。雷建平等[33]在對源于黑曲霉或假絲酵母的脂肪酶進行研究時發(fā)現(xiàn)它們的最適pH 范圍在8～9。本研究中來源于藍莓的灰霉菌胞外脂肪酶的最適pH 值為9，表明灰霉菌所產的脂肪酶為弱堿性脂肪酶[33]。對胞外脂肪酶的穩(wěn)定性進行研究，結果表明：該酶在溫度40～70 ℃，pH 5～10 的范圍較穩(wěn)定。這表明灰霉菌的胞外脂肪酶對溫度和pH 值具有較強的適應性，能在中、高溫和弱酸到強堿環(huán)境中保持穩(wěn)定。有機相中脂肪酶的催化反應是非水相酶催化反應的一個重要方面[34]。本研究中灰霉菌胞外脂肪酶在乙酸乙酯和二甲苯中處于激活狀態(tài)，而在異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮和三氯甲烷中處于被抑制狀態(tài)，其中在三氯甲烷中被抑制的效果最顯著。根據(jù)Log P 規(guī)則，有機溶劑的極性越低，酶在有機溶劑中的活性越強，然而三氯甲烷極性較弱卻顯著抑制酶活，這表明有機溶劑的Log P 值并非是影響酶在有機溶劑中發(fā)揮活性的唯一因素。從果實貯藏的應用而言，可考慮采用乙醇對藍莓采后進行保鮮處理，適當提高乙醇濃度效果更佳。不同金屬離子對酶活力的影響不同，金屬離子可能是酶的組成部分，也有可能是酶的激活劑或抑制劑[35]，因此金屬離子的存在對胞外脂肪酶的穩(wěn)定性影響較大。不同真菌所產脂肪酶對金屬的耐受性不同，如Fe3+和Mg2+能促進根霉的脂肪酶活而抑制曲霉的脂肪酶活[36]。對灰霉菌胞外脂肪酶的金屬耐受性進行研究表明：Na+、Fe3+對粗酶活力具有激活作用，k+、Ca2+、Mg2+、Cu2+對其有輕微抑制作用。缺鈣、鎂元素的藍莓植株易感病[37]，可適當通過肥料補充藍莓植株的鈣、鎂含量，提高其對灰霉病的抗病性。