生物合成柑橘類黃酮研究進(jìn)展

單 楊 劉 娟 王 振 肖業(yè)成

（1 科技部果蔬加工與質(zhì)量安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 長(zhǎng)沙410125 2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)沙410125 3 湖南大學(xué)研究生院隆平分院 長(zhǎng)沙410125）

柑橘是世界上第一大水果，含有豐富的類黃酮化合物等功能活性成分，是人類攝取多酚類化合物的重要來(lái)源之一[1]。類黃酮作為多酚類化合物的典型代表，具有十分重要的功能作用：一方面，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，類黃酮可以有效地提高植物的抗逆性，抵御多種生物和非生物脅迫，如紫外線、病蟲(chóng)害等[2-3]；另一方面，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類疾病研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮具有抗氧化、抗病毒等作用，對(duì)心血管疾病、神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮ＤY、帕金森癥）、癌癥、糖尿病等具有良好的預(yù)防和治療效果[4-7]?；诖?，類黃酮相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與利用一直是食品、藥品等行業(yè)的熱點(diǎn)議題。柑橘類黃酮通常用作抗氧化劑、甜味劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑以及天然色素等[8]。

隨著對(duì)柑橘類黃酮日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，每提取1 t 類黃酮需消耗5.49 t 柑橘幼果（類黃酮含量按18.20%計(jì)）或117.65 t 柑橘皮渣（類黃酮含量按0.85%計(jì)），獲得這些皮渣需要336.14 t 柑橘鮮果（按35%計(jì)），需要耕地面積12.81 hm2（按柑橘年產(chǎn)量26.25 t/hm2計(jì)）[9-11]，同時(shí)還需要使用大量化肥和農(nóng)藥。該方法投入高，消耗高，污染高且產(chǎn)出低，使柑橘類黃酮的大量生產(chǎn)受到限制。發(fā)展綠色環(huán)保的方法是亟需解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題?；瘜W(xué)合成的方法涉及化學(xué)試劑的使用以及嚴(yán)苛的反應(yīng)條件，容易產(chǎn)生溶劑殘留，制得的類黃酮用于食品、保健品、化妝品等產(chǎn)品中容易引起安全問(wèn)題。利用微生物合成柑橘類黃酮越來(lái)越受到關(guān)注。微生物合成類黃酮是利用合成生物學(xué)工具在微生物中異源合成的一種方法，具有環(huán)境友好，資源節(jié)約的優(yōu)勢(shì)，符合可持續(xù)性發(fā)展的應(yīng)用前景，是目前國(guó)內(nèi)外類黃酮合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究也取得巨大的進(jìn)展。本文就柑橘中常見(jiàn)類黃酮化合物的微生物合成進(jìn)行綜述，旨在為目前生物合成類黃酮所面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)提供一些參考。

1 柑橘類黃酮化合物的合成代謝途徑

類黃酮是酚類化合物的主要種類之一，是迄今為止植物中最常見(jiàn)的次生代謝產(chǎn)物。類黃酮化合物由15 個(gè)碳組成基本碳骨架結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)特征是由3 個(gè)碳（C 環(huán)）連接兩個(gè)苯環(huán)（A 環(huán)、B 環(huán)），被稱為C6-C3-C6多酚類化合物[12]。類黃酮化合物主要包括黃烷酮類、黃酮醇類、黃酮類、花青素類、異黃酮類等，其中柑橘中主要的類黃酮化合物包括柚皮苷、橙皮苷、圣草次苷、山奈酚、槲皮素、多甲氧基黃酮、花青素、芹菜素等（表1）。

類黃酮在柑橘中的合成主要經(jīng)過(guò)苯丙烷代謝途徑，由多種酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上催化完成[13]。苯丙烷代謝途徑由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥基化酶（C4H）、4-?；o酶A 連接酶（4CL）分別催化3 個(gè)過(guò)程。首先，PAL 催化苯丙氨酸合成肉桂酸，肉桂酸經(jīng)C4H 轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸，然后三磷酸腺苷、輔酶A 和4CL 將對(duì)香豆酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酰輔酶A（合成C6-C3-C6骨架的前體物質(zhì)之一）。其次，另一個(gè)前體物質(zhì)是丙二酰輔酶A，主要通過(guò)乙酰輔酶A 復(fù)合物作用乙酰輔酶A 生成，然后3 分子的丙二酰輔酶A 和1 分子4-酰基輔酶A 在查爾酮合酶（CHS）作用下縮合生成柚皮素查爾酮，進(jìn)一步通過(guò)查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化，閉環(huán)形成柚皮素。最后，柚皮素經(jīng)甲基化、?；⑻腔刃揎椛刹煌N類的柑橘類黃酮化合物[13-14]（圖1）。

表1 柑橘中主要類黃酮種類Table 1 The main flavonoids in citrus

圖1 柑橘類黃酮的合成代謝途徑Fig.1 Biosynthesis pathway network of flavonoids in citrus

2 柑橘類黃酮化合物的微生物合成研究進(jìn)展

2.1 黃烷酮類

2.1.1 柚皮苷 柚皮苷，全稱柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種廣泛存在于柚、葡萄柚和酸橙中的黃烷酮化合物，既可作為風(fēng)味改良劑、天然色素、苦味劑以及新型甜味劑的原料被應(yīng)用于食品行業(yè)，又具有預(yù)防心血管疾病、癌癥、骨關(guān)節(jié)病等多種疾病的生理活性[9]。柚皮素（5，7，4’-三羥基黃烷酮）是柚皮苷的苷元，可通過(guò)7-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶合成柚皮苷[15]。目前，柚皮苷主要從柑橘中提取，有關(guān)微生物合成柚皮苷尚未見(jiàn)研究報(bào)道。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外大量研究主要聚焦于柚皮素的微生物合成，是微生物合成最多的類黃酮之一。作為合成柚皮苷的苷元，詳細(xì)解析微生物合成柚皮素的過(guò)程，可為柚皮苷的微生物合成提供研究基礎(chǔ)。

最早關(guān)于柚皮素的微生物合成是2003年Hwang 等[16]在大腸桿菌中組裝了3 個(gè)合成黃烷酮的特異性基因：來(lái)自紅酵母的RrPAL、腔隙鏈霉菌A3（2）的ScCCL 和甘草的GeCHS，每個(gè)基因前的T7 啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目不同，并分別以苯丙氨酸和酪氨酸為底物成功合成了兩種黃烷酮，即松屬素和柚皮素。隨后不斷有學(xué)者通過(guò)獲取不同來(lái)源的酶，利用不同的底物在不同的平臺(tái)微生物中構(gòu)建代謝通路，從而異源合成柚皮素。

以大腸桿菌為平臺(tái)微生物，利用不同的底物合成柚皮素。Watts 等[17]將來(lái)自莢膜梭菌的編碼酪氨酸解氨酶基因TAL 和來(lái)自擬南芥的4CL、CHS導(dǎo)入大腸桿菌中，將葡萄糖作為底物成功合成了20.8 mg/L 柚皮素。Santos 等[18]將來(lái)自糯米的RgTAL、紅薯的Pc4CL1、雜交稻的PhCHS、蕓苔的MsCHI 以及三葉草根瘤菌的matB、matC 導(dǎo)入大腸桿菌中，以葡萄糖為底物成功合成了84 mg/L 柚皮素。Wu 等[19]構(gòu)建了相同的重組大腸桿菌，并通過(guò)對(duì)重組菌株中心代謝通路進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，最終合成了421.6 mg/L 柚皮素。除了以葡萄糖為底物外，也有利用氨基酸（如L-酪氨酸）和苯丙素（如對(duì)香豆酸） 作為底物進(jìn)行柚皮素的微生物合成。Miyahisa 等[20]以L-酪氨酸為底物，將來(lái)自刺毛甘草的CHS、龍眼草的PlCHI 構(gòu)建到大腸桿菌中，最終合成57 mg/L 的柚皮素。而以對(duì)香豆酸為底物時(shí)，將不同來(lái)源的基因?qū)氪竽c桿菌中，合成的柚皮素含量達(dá)到474.2 mg/L[21]。

以釀酒酵母作為平臺(tái)微生物，利用不同的底物合成柚皮素。Koopman 等[22]以葡萄糖為底物，將來(lái)自擬南芥的4CL、CHS1、CHI1、C4H、PAL1、CPR，來(lái)自莢膜梭菌的TAL1 構(gòu)建到釀酒酵母中，并在2 L 發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，成功合成了112.9 mg/L 柚皮素。焦亭亭等[23]利用啟動(dòng)子和拷貝數(shù)控制柚皮素合成關(guān)鍵基因，以對(duì)香豆酸為底物合成柚皮素235.9 mg/L。

除了以大腸桿菌和釀酒酵母為平臺(tái)微生物外，也有學(xué)者以委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、產(chǎn)油酵母為平臺(tái)微生物成功合成了柚皮素。Park 等[24]將來(lái)自擬南芥的AtCHS 和AtCHI 導(dǎo)入委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中，并以對(duì)香豆酸為底物合成了35.6 mg/L 柚皮素。Lv等[25]在篩選得到的產(chǎn)油酵母中構(gòu)建柚皮素合成途徑，以葡萄糖為底物成功合成了252.4 mg/L 柚皮素。

目前，微生物合成柚皮素的產(chǎn)量處于較低水平。以廉價(jià)碳源葡萄糖作為底物，柚皮素產(chǎn)量為421.6 mg/L，以成本較高的對(duì)香豆酸為底物合成柚皮素的產(chǎn)量為474.2 mg/L。結(jié)合現(xiàn)有研究分析，導(dǎo)致微生物合成柚皮素產(chǎn)量偏低的原因可能是途徑基因，如CHI 等基因表達(dá)效率較低以及重組菌株中碳通量較少的流向柚皮素合成途徑，導(dǎo)致碳通量分配不平衡。后期可通過(guò)引入強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)提高途徑基因的表達(dá)效率以及運(yùn)用新的合成生物學(xué)工具對(duì)重組菌株的碳通量進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，可望提高柚皮素的產(chǎn)量，為進(jìn)一步對(duì)微生物高產(chǎn)柚皮苷奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

2.1.2 橙皮苷 橙皮苷、橙皮素（橙皮苷苷元）是兩種具有多種生理活性功能的柑橘類黃酮化合物。近10年來(lái)，有關(guān)這些化合物的生物活性及其分子機(jī)制研究方面發(fā)表了大量的論文[26]。橙皮苷、橙皮素具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過(guò)清除自由基，降低Ca2+水平和半胱氨酸蛋白酶-3 活性等途徑來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[27]；抗焦慮、抗驚厥[27]和鎮(zhèn)靜作用[28]、抗抑郁作用[29]以及提高認(rèn)知功能[30]等生理活性。

橙皮苷主要從柑橘幼果中提取，而橙皮素是以橙皮苷為原料，通過(guò)化學(xué)方法水解蕓香糖基后得到的產(chǎn)物。目前，較多類黃酮以橙皮苷為原料，通過(guò)化學(xué)半合成的方法合成[31-32]。大量使用橙皮苷增加了柑橘的消耗，對(duì)環(huán)境造成很大的影響。目前，關(guān)于微生物合成橙皮苷及其苷元的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道，亟待補(bǔ)充和深入研究，為合成橙皮苷及其苷元的下游物質(zhì)，如新橙皮苷等類黃酮提供技術(shù)支撐。

2.1.3 圣草次苷 圣草次苷（圣草素7-O-β-蕓香糖苷）廣泛存在于柑橘等植物中，具有較強(qiáng)的抗氧化、降血脂、抗腫瘤活性，在預(yù)防和改善氧化應(yīng)激、高血脂癥、心腦血管疾病以及癌癥中起重要作用[33-38]。在柑橘類黃酮代謝途徑中，首先通過(guò)葡萄糖合成圣草素，圣草素進(jìn)一步經(jīng)7-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶和1，6-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶合成圣草次苷[15]。目前，微生物合成圣草次苷的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道，且其難點(diǎn)之一是合成圣草素。弄清圣草素合成途徑可為圣草次苷的微生物合成提供技術(shù)參考。

前期許多研究主要以咖啡酸為底物，在大腸桿菌中合成圣草素。Leonard 等[39]通過(guò)過(guò)表達(dá)大腸桿菌中來(lái)自黃檀的4CL、矮牽牛的CHS 以及紫花苜蓿的CHI，并以咖啡酸為底物合成了11 mg/L 圣草素；將來(lái)自三葉草根瘤菌的matB 和matC 導(dǎo)入該重組大腸桿菌中，圣草素的產(chǎn)量提高了近5倍[40]；對(duì)該重組大腸桿菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)和類黃酮合成途徑進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，最終合成了114 mg/L 圣 草 素[41]。

除了以咖啡酸為底物外，研究人員也在探索通過(guò)苯丙烷代謝途徑來(lái)合成圣草素，然而由于合成圣草素的關(guān)鍵酶F3’H 屬于細(xì)胞色素P450 單加氧酶家族，在原核生物中的表達(dá)多與細(xì)胞膜結(jié)合形成包涵體，很難得到有效的可溶性表達(dá)，同時(shí)在原核生物中也缺少該類酶的輔酶因子，因此阻礙了原核生物以L-酪氨酸為底物成功合成圣草素。直到2014年，Zhu 等[42]將來(lái)源非洲菊的F3’H和長(zhǎng)春花的細(xì)胞色素P450 還原酶的N 端膜結(jié)合序列進(jìn)行截短和修飾，然后將二者進(jìn)行有效融合，首次成功地以L-酪氨酸為底物合成了107 mg/L圣草素。2016年，周天山[43]將來(lái)源于茶樹(shù)的F3’H和擬南芥的ATR（ATR1、ATR2）進(jìn)行融合，也成功實(shí)現(xiàn)了微生物合成圣草素。2019年，Lv 等[25]以產(chǎn)油酵母作為宿主菌株，以葡萄糖為底物從頭合成了134.2 mg/L 圣草素。

微生物成功合成圣草素，為圣草次苷的合成奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為合成其它類黃酮所依賴的細(xì)胞色素P450 單加氧酶在原核生物中的成功表達(dá)提供了技術(shù)參考。目前，圣草素途徑基因如F3’H在大腸桿菌中的表達(dá)效率偏低?？紤]到來(lái)源于真核生物的F3’H 的表達(dá)需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的參與，因此，選擇釀酒酵母等真核生物作為宿主菌株可能對(duì)增加F3’H 表達(dá)效率以及提高圣草素的產(chǎn)量起重要作用。同時(shí)，圣草素對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，通過(guò)研究相關(guān)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可提高圣草素的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，減輕對(duì)宿主菌的抑制作用，對(duì)改造工程菌具有重要的指導(dǎo)意義。

2.2 黃酮醇類

2.2.1 山奈酚 山奈酚是一種廣泛分布于柑橘等植物中的黃酮醇類化合物。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，食用含山奈酚的食物與降低患心血管疾病和某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著正相關(guān)，同時(shí)山奈酚在預(yù)防或治療疾病中有明顯的作用，如神經(jīng)退行性疾病、傳染病、焦慮癥、過(guò)敏、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等[44]。山奈酚具有被開(kāi)發(fā)成新藥的潛力。目前，關(guān)于微生物合成山奈酚方面的研究相對(duì)較少。Miyahisa 等[45]以L-酪氨酸為底物，將來(lái)自紅酵母的PAL、腔隙鏈霉菌A3（2）的ScCCL，刺毛甘草的CHS，黃花菜的CHI，紅松的FS1，柑橘的F3H 和FLS 以及谷氨酸棒狀桿菌的accBC、dtsR1 導(dǎo)入大腸桿菌中，成功合成了15.1 mg/L 山奈酚。Trantas等[46]將來(lái)自毛果假單胞菌和三角海棠的PAL、CPR，大豆的C4H、4CL、CHS、CHI、F3H 以及結(jié)核桿菌的FLS 導(dǎo)入釀酒酵母中，以苯丙氨酸為底物，合成了1.3 mg/L 山奈酚。Leonard 等[47]將來(lái)自紅松的Pc4CL-2、擬南芥的FLS1、家蠅的MdF3H 以及來(lái)自薔薇的融合蛋白F3’5’H 和CPR 導(dǎo)入大腸桿菌中，并分別以對(duì)香豆酸、柚皮素為底物合成了0.2 mg/L、0.9 mg/L 山奈酚。

綜上研究發(fā)現(xiàn)，微生物合成山奈酚的產(chǎn)量偏低，主要原因可能是催化該途徑的關(guān)鍵酶如FLS在宿主菌中異源表達(dá)效率偏低。此外，現(xiàn)階段微生物合成山奈酚的研究較不完善，缺乏以葡萄糖等廉價(jià)碳源為底物合成山奈酚的研究。后續(xù)對(duì)微生物合成山奈酚的研究可能需要著重關(guān)注途徑基因的表達(dá)效率以及以廉價(jià)碳源為底物合成山奈酚等方面的問(wèn)題。

2.2.2 槲皮素 槲皮素是人們?nèi)粘ｏ嬍持凶畛Ｒ?jiàn)的黃酮醇類化合物，每日平均攝入量可達(dá)13mg[48]。大量研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有多種生物學(xué)特性：可直接作為自由基清除劑防止DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜損傷[49]，具有抗炎作用[50]及抗腫瘤活性等[51]。目前，槲皮素已在大腸桿菌、釀酒酵母中成功合成。Leonard 等[46]將來(lái)自薯蕷的Pc4CL-2、FLS1、雜交稻的PhCHS 和PhCHI、家蠅的MdF3H 以及玫瑰F3’5’H 和CPR 的融合蛋白導(dǎo)入大腸桿菌中，分別以對(duì)香豆酸和圣草素為底物，合成了0.05 mg/L和1.1 mg/L 槲皮素。Trantas 等[47]將PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H 和FLS 導(dǎo)入釀酒酵母中，并以柚皮素、對(duì)香豆酸為底物分別合成了0.38 mg/L 和0.26 mg/L 槲皮素。除此之外，Marín 等[52]首次在放線菌中構(gòu)建了槲皮素合成代謝途徑，從頭合成了0.028～0.102 mg/L 槲皮素，這為除大腸桿菌和釀酒酵母外其它微生物成功合成槲皮素提供了研究借鑒。

微生物合成槲皮素相比柚皮素等其它類黃酮的研究較少，且通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)合成的槲皮素產(chǎn)量較低。造成這種結(jié)果的原因之一可能是槲皮素合成代謝途徑較長(zhǎng)且較為復(fù)雜，使重組菌株代謝負(fù)荷過(guò)大，降低了槲皮素的產(chǎn)量。后續(xù)研究應(yīng)從減輕重組菌株代謝負(fù)荷出發(fā)，引入多種合成生物學(xué)工具或改變微生物培養(yǎng)模式，可提高微生物合成槲皮素的產(chǎn)量。

2.3 多甲氧基黃酮類

甲基化是許多次級(jí)代謝產(chǎn)物后修飾的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，植物來(lái)源的次生代謝產(chǎn)物特別是類黃酮化合物被S-腺苷-L-蛋氨酸依賴的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶所甲基化。不同O-甲基轉(zhuǎn)移酶如POMT-7、SaOMT-2、ROMT-9、SOMT-2 以 及SpOMT2884 催化黃酮醇類、黃烷酮類、黃酮類和異黃酮類合成不同的甲氧基黃酮。多甲氧基黃酮廣泛存在于柑橘果皮中，與類黃酮苷元相比，甲基化的類黃酮生物利用度明顯提高[53]。川陳皮素是一種具有顯著的抗氧化、抗炎癥，提高免疫力，降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)等生物學(xué)活性的多甲氧基黃酮[54]。目前，川陳皮素等多甲氧基黃酮主要從柑橘中提取，微生物合成多甲氧基黃酮的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道。考慮到多甲氧基黃酮較強(qiáng)的生理活性，利用合成生物學(xué)工具將不同種類的OMTs 導(dǎo)入大腸桿菌、酵母菌等宿主菌中，可實(shí)現(xiàn)微生物合成多甲氧基黃酮。

2.4 花青素類

許多研究證明，在大腸桿菌、釀酒酵母等宿主菌中構(gòu)建花青素合成途徑，以肉桂酸、柚皮素、咖啡酸、葡萄糖或圣草素等不同物質(zhì)為底物，均能成功合成花青素[40，55-58]。由于合成花青素代謝途徑較長(zhǎng)且過(guò)于復(fù)雜，大大增加了宿主菌的代謝負(fù)擔(dān)，因此，多種研究策略如增加尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖利用率，重定向碳通量以及優(yōu)化培養(yǎng)條件等用以提高花青素的產(chǎn)量[57]。除此之外，近年來(lái)以多種微生物共培養(yǎng)的方式合成花青素的研究出現(xiàn)。如Jones 等[59]以4 種大腸桿菌共培養(yǎng)的方式成功合成了9.5 mg/L 天竺葵素3-O-葡萄糖苷；Akdemir等[60]將重組大腸桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)成功合成了吡喃花青素。這種微生物共培養(yǎng)的方法能有效地減輕單一微生物培養(yǎng)的代謝負(fù)擔(dān)，為微生物合成花青素提供了新的技術(shù)思路。

2.5 芹菜素

芹菜素（4，5，7-三羥基黃酮）是一種廣泛分布于水果、蔬菜的黃酮類化合物。前期大量研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理活性[61]。目前，芹菜素已在大腸桿菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中成功合成。Miyahisa 等[62]以L-酪氨酸為底物，將來(lái)自于紅酵母的PAL、腔隙鏈霉菌A3（2）的ScCCL、甘草的CHS、野葛的CHI、薯蕷的FS1 以及谷氨酸棒狀桿菌的accBC 和dtsR1 導(dǎo)入大腸桿菌中，最終合成13mg/L 的芹菜素。Leonard 等[63]以對(duì)香豆酸為底物，將來(lái)自于三葉草根瘤菌的matB和matC、薯蕷的4CL 和FS1、矮牽牛的CHS、蕓苔的CHI 導(dǎo)入大腸桿菌中，并通過(guò)添加淺藍(lán)菌素來(lái)抑制脂肪酸的代謝，從而合成了110 mg/L 的芹菜素。Park 等[24]將來(lái)自擬南芥的AtCHS 和AtCHI、薯蕷的PcFS1 導(dǎo)入委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中，并以肉桂酸為底物合成了15.3 mg/L 的芹菜素。

目前，微生物合成芹菜素的產(chǎn)量較低，主要原因可能是重組菌株中碳通量主要流向中心代謝途徑而較少流向芹菜素合成途徑，最終導(dǎo)致碳通量分配不平衡。后期可以通過(guò)合成生物學(xué)工具如成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)對(duì)芹菜素合成途徑進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，可望使微生物合成芹菜素產(chǎn)量較低的問(wèn)題得到解決。

3 存在的問(wèn)題

利用不同的合成生物學(xué)工具對(duì)重組菌株進(jìn)行改造，在提高類黃酮產(chǎn)量方面的研究已取得較好的進(jìn)展。然而與微生物合成的其它天然產(chǎn)物相比，微生物合成柑橘類黃酮產(chǎn)量偏低，需要使用多種合成生物學(xué)工具來(lái)進(jìn)一步提高產(chǎn)量。主要存在的問(wèn)題歸結(jié)為以下3 點(diǎn)：

1） 重組菌株代謝負(fù)荷大。合成途徑的功能和整體的轉(zhuǎn)化效率取決于很多因素，而當(dāng)重組代謝途徑較長(zhǎng)且過(guò)于復(fù)雜，單一菌株不能滿足途徑需求時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)菌體代謝負(fù)荷大，降低目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的問(wèn)題[64]。

2） 基因表達(dá)效率偏低。微生物合成類黃酮是依賴轉(zhuǎn)入宿主菌中的表達(dá)載體所合成的酶完成，這些酶的含量受到基因表達(dá)效率的影響。在微生物合成過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)單個(gè)基因表達(dá)效率低，多基因協(xié)同表達(dá)時(shí)限速酶基因表達(dá)受到抑制，外源序列含有較多宿主菌的稀有密碼子，導(dǎo)致表達(dá)受阻以及缺少非翻譯區(qū)（UTR）導(dǎo)致核酸穩(wěn)定性不足等問(wèn)題。

3） 中心代謝途徑和類黃酮合成途徑之間碳通量的平衡。中心代謝途徑是微生物維持生活所必需，絕大部分碳通量均流向中心代謝網(wǎng)絡(luò)以維持微生物的正常生活。在提高類黃酮產(chǎn)量的同時(shí)，一方面在確保微生物正常的生活情況下，盡可能地減少碳通量流向中心代謝網(wǎng)絡(luò)；另一方面要盡可能增加類黃酮合成途徑的碳通量，如何達(dá)到平衡，從而提高類黃酮產(chǎn)量，是一直以來(lái)需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

4 應(yīng)對(duì)策略

4.1 宿主菌株的選擇

微生物合成類黃酮首要的技術(shù)問(wèn)題是宿主菌株的選擇。一直以來(lái)，合成類黃酮的微生物主要分為兩類：一類是原核生物，如大腸桿菌，其具有生長(zhǎng)快，遺傳背景清楚，染色體易操作等優(yōu)勢(shì)，在許多氨基酸等物質(zhì)的微生物合成中被廣泛應(yīng)用。然而，大腸桿菌缺乏與類黃酮化合物合成相關(guān)的細(xì)胞器，如細(xì)胞色素P450 單加氧酶只有與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合才能發(fā)揮重要的作用[65]，因此，在大腸桿菌中依賴于細(xì)胞器表達(dá)的酶較難實(shí)現(xiàn)有效表達(dá)。另一類是釀酒酵母等真核生物，具有和高等真核生物相同的細(xì)胞器，能滿足那些來(lái)源于真核生物的酶的表達(dá)。然而，與原核生物相比，真核生物生長(zhǎng)速度慢，操作難度較大且遺傳背景更為復(fù)雜。目前，微生物合成類黃酮的宿主菌株主要選擇大腸桿菌和釀酒酵母，其它種類微生物的研究相對(duì)較少。

丙二酰輔酶A 是類黃酮合成中重要的前體物質(zhì)，因主要參與脂肪酸的代謝途徑而被大量消耗。大量研究主要通過(guò)引入、調(diào)控相關(guān)代謝基因來(lái)提高宿主菌中丙二酰輔酶A 的含量。而Lv 等[25]從優(yōu)化宿主菌選擇的角度出發(fā)，篩選脂肪酸合成豐富的產(chǎn)油酵母作為宿主菌株，通過(guò)提高丙二酰輔酶A 的含量，增加類黃酮的產(chǎn)量。除此之外，鏈霉菌也被認(rèn)為是合成類黃酮化合物重要的平臺(tái)微生物[66]。

4.2 微生物共培養(yǎng)

當(dāng)重組代謝途徑較長(zhǎng)且過(guò)于復(fù)雜，單一菌株不能滿足途徑需求時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)菌體代謝負(fù)擔(dān)的問(wèn)題[64]。為了克服微生物代謝負(fù)擔(dān)的局限性，將復(fù)雜而較長(zhǎng)的合成途徑分配到不同的菌株，減輕菌體代謝負(fù)擔(dān)來(lái)提高共培養(yǎng)體系的生產(chǎn)性能方面的研究在近年來(lái)取得重大的進(jìn)展[59，67-71]。相比單一微生物傳統(tǒng)的培養(yǎng)模式，微生物共培養(yǎng)可減輕菌體代謝負(fù)擔(dān)[72]，避免中間物質(zhì)對(duì)底物的反饋抑制作用[73-74]，為不同酶特別是來(lái)自于真核微生物的酶的表達(dá)提供了最適的表達(dá)環(huán)境[71]。相比兩步發(fā)酵模式，可避免菌體轉(zhuǎn)移造成的污染[75]，通過(guò)菌體間的共生關(guān)系去除不需要的副產(chǎn)物，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量[76]。

微生物共培養(yǎng)是代謝工程的一個(gè)新興領(lǐng)域，對(duì)微生物共培養(yǎng)合成類黃酮的研究尚處于起步階段。雖然，這種方法較傳統(tǒng)培養(yǎng)模式具有一定的優(yōu)勢(shì)，但仍存在如菌株間的親和性、底物的競(jìng)爭(zhēng)、代謝中間體的轉(zhuǎn)運(yùn)等問(wèn)題[72]。采用合成生物學(xué)和代謝工程的手段來(lái)解決微生物共培養(yǎng)所帶來(lái)的問(wèn)題，可望將來(lái)開(kāi)發(fā)出適用于合成類黃酮的微生物共培養(yǎng)體系，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

4.3 優(yōu)化表達(dá)體系

圖2 微生物共培養(yǎng)示意圖 （a）兩種相同微生物共培養(yǎng)；（b）兩種不同微生物共培養(yǎng)；（c）多種微生物共培養(yǎng)）[72]Fig.2 Schematic representation of artificial consortium for bioproductions （a） Co-cultivation comprising strains of the same species，（b） Co-cultivation comprising strains from different species and （c） Co-cultivation comprising mixed strains i.e.polyculture[72]

優(yōu)化表達(dá)載體是提高異源基因表達(dá)效率的重要手段。在微生物合成柑橘類黃酮的研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮合成基因在宿主菌中可能由于DNA 轉(zhuǎn)錄水平低，編碼基因的密碼子與宿主菌偏好性不同以及轉(zhuǎn)錄后mRNA 在宿主菌內(nèi)不穩(wěn)定等問(wèn)題，導(dǎo)致基因的表達(dá)效率偏低，最終使柑橘類黃酮的產(chǎn)量偏低。需要對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化以提高基因的表達(dá)效率，主要從啟動(dòng)子優(yōu)化，基于限速酶的表達(dá)效率調(diào)節(jié)，密碼子優(yōu)化以及UTR 優(yōu)化入手。

不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率不同，選擇適合宿主菌的強(qiáng)啟動(dòng)子有助于提高目的基因的表達(dá)率[77]。選擇啟動(dòng)子時(shí)主要考察3 點(diǎn)：1） 啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性；2）在低轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，啟動(dòng)子能表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性和可誘導(dǎo)性；3） 當(dāng)表達(dá)的蛋白或次生代謝物對(duì)宿主菌株產(chǎn)生毒性時(shí)，可通過(guò)控制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。此外，在序列中通過(guò)插入增強(qiáng)子可以提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。優(yōu)化啟動(dòng)子能顯著提高目的基因的表達(dá)效率，然而表達(dá)效率過(guò)高并不適合反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)多個(gè)基因協(xié)同表達(dá)時(shí)，非限速酶表達(dá)效率過(guò)高可能會(huì)影響限速酶的正常表達(dá)。下調(diào)非限速酶的基因表達(dá)可減輕菌體代謝負(fù)擔(dān)，提高限速酶的表達(dá)。由于微生物合成柑橘類黃酮的途徑較長(zhǎng)，所以通過(guò)不同強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)不同酶的表達(dá)效率進(jìn)行調(diào)控，對(duì)優(yōu)化柑橘類黃酮的表達(dá)體系具有重要意義。

密碼子優(yōu)化也是提高基因表達(dá)效率的重要方法。不同微生物對(duì)核苷酸序列的偏好性不同，導(dǎo)致對(duì)基因的表達(dá)效率存在差異。柑橘類黃酮合成基因主要來(lái)自植物等高等生物中，而類黃酮的微生物合成則在大腸桿菌、酵母菌等低等生物中進(jìn)行?？紤]到宿主菌對(duì)不同密碼子的偏好性不同，在導(dǎo)入類黃酮合成途徑基因之前，需經(jīng)適合于大腸桿菌或釀酒酵母等微生物的密碼子優(yōu)化，避免稀有密碼子，從而有效提高目的基因在宿主菌中的表達(dá)效率[78]。

位于mRNA 上游的5’端和下游的3’端UTR在mRNA 降解過(guò)程中的重要作用，可能對(duì)mRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。在構(gòu)建柑橘類黃酮的表達(dá)載體時(shí)，常常僅包含啟動(dòng)子、目的基因的編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）等“有效”的基因序列，而不包含兩端UTR 的基因序列，這使編碼柑橘類黃酮合成相關(guān)酶的mRNA 在宿主菌內(nèi)可能發(fā)生降解。在對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，可以考慮對(duì)UTR進(jìn)行優(yōu)化以提高目的蛋白的表達(dá)效率[79]。

4.4 碳通量重定向

丙二酰輔酶A 的供給問(wèn)題一直以來(lái)被認(rèn)為是微生物合成類黃酮的主要瓶頸問(wèn)題之一。丙二酰輔酶A 是脂肪酸合成的重要中間物質(zhì)，在脂肪酸代謝途徑中被利用消耗。為了避免丙二酰輔酶A的消耗，引入多種研究策略：一是過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A 羧化酶復(fù)合物編碼基因、生物素連接酶基因、乙酸同化基因，可使工程菌合成類黃酮的產(chǎn)量能提高183%～1 379%[39]；二是在培養(yǎng)基中添加淺藍(lán)菌素來(lái)抑制脂肪酸代謝途徑基因，可使類黃酮含量提高900%[80]；三是導(dǎo)入三葉草根瘤菌丙二酰輔酶A 途徑，通過(guò)外源添加丙二酸鹽可使丙二酰輔酶A 含量提高近兩倍[81]。

這些策略的使用往往對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成不利影響，如高劑量淺藍(lán)菌素會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，從而會(huì)降低類黃酮的產(chǎn)量和細(xì)胞的生長(zhǎng)率[80]，因此利用合成生物學(xué)工具進(jìn)行菌株改造尤為重要。研究表明，RNA 介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制對(duì)碳通量的精細(xì)調(diào)控十分重要[82]，然而RNA 干擾（RNAi）技術(shù)在細(xì)菌中存在效率低的問(wèn)題[83-84]。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列干擾 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference，CRISPRi）系統(tǒng)可以將sgRNA（small guide RNA）定向到目標(biāo)基因的非模板DNA 鏈的不同區(qū)域，從而方便地對(duì)細(xì)菌基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[85]，這為調(diào)控類黃酮合成基因的表達(dá)提供了可能性。Wu 等[86]采用CRISPRi 系統(tǒng)來(lái)精細(xì)調(diào)控大腸桿菌的中心代謝途徑，使碳通量盡可能高效地流向丙二酰輔酶A 合成途徑，并在多基因的協(xié)同表達(dá)下，最終使柚皮素的產(chǎn)量提高到421.6 mg/L。此外，其它限速酶也可能是導(dǎo)致類黃酮產(chǎn)量偏低的原因，需要采用CRISPR 系統(tǒng)或其它合成生物學(xué)工具來(lái)平衡碳通量，從而提高類黃酮的產(chǎn)量。

5 展望

近年來(lái)，分子生物學(xué)、系統(tǒng)和合成生物學(xué)工具的應(yīng)用為大腸桿菌和釀酒酵母合成類黃酮化合物奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。然而，宿主菌利用廉價(jià)碳源作為底物合成類黃酮化合物的產(chǎn)量偏低，是工廠大規(guī)模生產(chǎn)和類黃酮在商業(yè)應(yīng)用中的限制因素之一。限速酶的鑒定，類黃酮合成途徑基因的精準(zhǔn)調(diào)控和優(yōu)化，宿主菌中平衡碳通量的技術(shù)難度大。藥理活性明顯高于頭孢呋辛類藥物的橙皮素[87]、新橙皮苷、多甲氧基黃酮、香葉木素等類黃酮的微生物合成研究尚處于起步階段。

隨著生命科學(xué)研究的快速發(fā)展，結(jié)合代謝工程、系統(tǒng)和合成生物學(xué)工具以及微生物共培養(yǎng)模式用于菌株設(shè)計(jì)、途徑構(gòu)建和優(yōu)化，可望使微生物合成類黃酮產(chǎn)量偏低的問(wèn)題得到解決，也為微生物合成其它植物功效成分提供參考方法和模式。此外，微生物合成類黃酮可以改變天然產(chǎn)物從植物中提取的傳統(tǒng)模式，為類黃酮的大量獲得提供綠色、可持續(xù)的替代方案?？蓽p輕種植柑橘等果樹(shù)需要大量土地資源的壓力，減少化肥、農(nóng)藥的使用；還可滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的健康生活水平對(duì)柑橘類黃酮等功效成分的需求，為我國(guó)環(huán)境友好、資源節(jié)約型社會(huì)的建設(shè)以及大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科技支撐。