基于MTT 法研究唐古特大黃多糖對不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用

李龍昱

(青海省人民醫(yī)院藥學(xué)部)

大黃含有豐富的多糖類物質(zhì)，具有抗腫瘤的生理效能，但具體情況不明[1]。本研究采用MTT法研究唐古特大黃多糖在不同濃度(25～500μg/mL)和不同作用時間(24、48、72h)對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12、肝癌細(xì)胞HepG2、肺癌細(xì)胞549、胃癌細(xì)胞SGC-790生存率的影響，來明確唐古特大黃多糖對不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone)；RPMI-1640培養(yǎng)基(南京建成)；胎牛血清(以色列Bioind)；青鏈霉素混合液(雙抗)(美國Gibco)；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液(德國BioFroxx)；DMSO(德國BioFroxx)；乙二胺四乙酸(廣州臻萃質(zhì)檢服務(wù)有限公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone)；MTT噻唑蘭(德國BioFroxx)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)；移液器器(Eppendorf)；細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)。D-葡萄糖醛酸(南京春秋生物有限公司，純度98%)。

1.2 試藥與細(xì)胞株

唐古特大黃多糖的制備方法參照文獻(xiàn)方法[5]，冷凍干燥后分裝與凍存管中，置-20 ℃冰箱備用。

人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12(ATCC細(xì)胞庫)；人肝癌細(xì)胞HepG2(ATCC細(xì)胞庫)；人肺癌細(xì)胞A549(ATCC細(xì)胞庫)；人胃癌細(xì)胞SGC-790(ATCC細(xì)胞庫)。

1.3 儀器與設(shè)備

細(xì)胞實驗超凈工作臺(SW-CJ-4FD，蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司)；二氧化碳孵箱(MCO-20AIC，美國Thermo)；倒置顯微鏡(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司，BLD-200)；高壓鍋(TOMY Autoclave ES-315)；離心機(jī)(美國LabNet公司)；-80 ℃冰箱(TH-86-150-WA，上海精若科學(xué)儀器)；全自動酶標(biāo)儀(SpectraMaxiD，美谷分子儀器(上海)有限公司)；電熱恒溫干燥箱(gz008，東莞市格普電子科技有限公司)；震蕩混懸儀(HYG-803，武漢華能陽光電氣有限公司)；高速臺式離心機(jī)(H1650，湘儀集團(tuán))；分析天平(AR224CN，上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

采用MTT法研究唐古特大黃多糖對不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用，具體研究方法參照文獻(xiàn)方法[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 唐古特大黃多糖對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12的抑制作用

唐古特大黃多糖在不同作用時間下對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12抑制率如圖1所示，濃度范圍介于25～500 μg/mL的唐古特大黃多糖在24、48、72 h時對胰腺癌細(xì)胞的抑制率隨著濃度的增加對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12的抑制作用越明顯，不同濃度的抑制作用具有顯著性差異(P<0.05)。比較相同濃度不同的作用時間，發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長，抑制率逐漸提高。由于多糖是大分子物質(zhì)，不易被細(xì)胞所吸收，所以其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用隨時間的延長而增強，當(dāng)作用時間為72 h、濃度為500 μg/mL的唐古特大黃多糖對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12的抑制率為80.25±3.44%。結(jié)果顯示唐古特大黃多糖對結(jié)腸癌細(xì)胞具有較好的抑制作用。

2.2 唐古特大黃多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用

唐古特大黃多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2抑制作用如圖2所示，濃度范圍介于25～500 μg/mL的唐古特大黃多糖作用于人肝癌細(xì)胞24、48、72 h后，均有明顯的抑制作用，且量效關(guān)系明顯(P<0.05)。抑制作用隨著作用時間的延長而增加。如圖2所示當(dāng)作用時間為72 h、濃度為500 μg/mL的唐古特大黃多糖對人肝癌細(xì)胞的抑制率為88.23±2.12%。結(jié)果顯示唐古特大黃多糖對肝癌細(xì)胞具有較好的抑制作用。

2.3 唐古特大黃多糖對人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用

唐古特大黃多糖在不同作用時間下對人肺癌細(xì)胞A549抑制率如圖3所示，唐古特大黃多糖在濃度范圍介于25～500 μg/mL時對肺癌細(xì)胞的抑制作用不太顯著，作用時間為24 h時，抑制率最高為5.65%，且不同劑量之間無顯著性差異。隨著作用時間的延長，表現(xiàn)出微弱的抗腫瘤活性，作用時間為72 h、濃度為500 μg/mL的唐古特大黃多糖抑制率僅為35.32±3.34%。結(jié)果顯示唐古特大黃多糖對人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用較弱。

圖1不同作用時間下唐古特大黃多糖對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12的抑制率圖

Figure1Inhibition rate of tanguficanmaxim polysaccharides on human colon cancer cells KM12at different time

圖2 不同作用時間下唐古特大黃多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率圖

圖3 不同作用時間下唐古特大黃多糖對人肺癌細(xì)胞A549的抑制率圖

2.4 唐古特大黃多糖對人胃癌細(xì)胞SGC-790的抑制作用

唐古特大黃多糖對人胃癌細(xì)胞SGC-790抑制作用如圖4所示，濃度范圍介于25～500 μg/mL的唐古特大黃多糖作用于SGC-790人胃癌細(xì)胞24、48、72 h后，均有明顯的抑制作用，且量效關(guān)系明顯(P<0.05)。抑制作用隨著作用時間的延長而增加。作用時間為72 h、濃度為500 μg/mL的唐古特大黃多糖對胃癌細(xì)胞SGC-790抑制率為89.54±4.25%結(jié)果顯示唐古特大黃多糖對胃癌細(xì)胞SGC-790具有一定的抑制增殖作用。

圖4不同作用時間下唐古特大黃多糖對人胃癌細(xì)胞SGC-790的抑制率圖

Figure4Inhibition rate of tanguficanmaxim polysaccharides on human gastric cancer cells SGC-790at different time

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，惡性腫瘤與熱毒蘊結(jié)密切相關(guān)。因此，具有清熱解毒的中藥，是近年來防治惡性腫瘤的研究熱點。通過查閱不同文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)清熱解毒中藥抗腫瘤的作用機(jī)制主要為：直接殺滅腫瘤細(xì)胞、調(diào)控機(jī)體中的特定信號使腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗炎、抗氧化[8，9]。大黃味苦性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具沉降之性，有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，活血祛瘀之功效，是一味瀉火、破積、行瘀的中藥，因此適用于癌癥的治療[10]。研究結(jié)果表明，唐古特大黃多糖對人結(jié)腸癌細(xì)胞KM12、肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞SGC-790具有顯著抑制作用，且表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系和時間依賴關(guān)系，而對肺癌細(xì)胞的抑制作用不明顯，推測唐古特大黃多糖抗腫瘤活性可能與其性味歸經(jīng)有關(guān)。中醫(yī)藥的治療注重歸經(jīng)。歸經(jīng)能從一定程度反映出中藥的作用部位或者作用靶點。藥物進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)過吸收后在不同的組織中分布差異較大[11]。藥物的作用與人體的臟腑經(jīng)絡(luò)密切相關(guān)，藥物對機(jī)體作用部位也具有選擇性，結(jié)合中藥的歸經(jīng)可以為臨床辯證用藥提供依據(jù)[12]。本次研究結(jié)果從側(cè)面上反映了唐古特大黃在抗腫瘤方面具有一定的選擇性。因此后續(xù)可結(jié)合性味歸經(jīng)理論探究唐古特多糖治療腫瘤的作用靶點。多糖是大黃中一類重要的活性成分，其抗腫瘤作用逐漸被人認(rèn)可，前期已經(jīng)證實唐古特大黃具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，其抗腫瘤活性與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系是一個值得探究的科學(xué)問題。本研究通過體外實驗明確了唐古特大黃多糖對不同腫瘤細(xì)胞生存率的影響，而藥物進(jìn)入人體需經(jīng)吸收、分布、代謝和排泄四個步驟，影響因素較多，因此體內(nèi)實驗結(jié)果是否與體外實驗一致還有待進(jìn)一步明確。