低氧預(yù)處理和七氟醚預(yù)處理對(duì)短暫性全腦缺血成年大鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制

王道合，趙秀麗，拜承萍

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

對(duì)缺血性腦卒中的治療原則是早期恢復(fù)腦灌注。隨著該治療方法的應(yīng)用，腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIR)的發(fā)生率也隨之上升。大量證據(jù)表明，亞致死預(yù)處理可以提供神經(jīng)保護(hù)，提高缺血耐受性[1]，這個(gè)流程被稱為預(yù)處理或缺血耐受。預(yù)處理有利于識(shí)別潛在的內(nèi)源性保護(hù)信號(hào)級(jí)聯(lián)，在目標(biāo)允許治療下，啟動(dòng)增強(qiáng)腦缺血中的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，并可能在缺血的情況下激活大腦的保護(hù)狀態(tài)[2]。

七氟醚可在體內(nèi)外誘導(dǎo)缺血耐受[3，4]。最近的研究表明，1.24%的七氟醚在體內(nèi)和體外均能有效預(yù)防鼠類CIR[5]。

即刻早基因(IEGs)是一類異質(zhì)基因，它能被大量的刺激因素(包括環(huán)境因素)迅速而短暫地激活[6]，可以編碼具有不同功能的蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子JunB。IEGs的誘導(dǎo)是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)外界刺激反應(yīng)的最早的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制之一[7]，因而IEGs誘導(dǎo)被認(rèn)為是近期的一種活動(dòng)性標(biāo)志物。

本研究應(yīng)用兩種預(yù)處理方法，研究不同時(shí)間點(diǎn)(T1、T2、T3)海馬神經(jīng)元的壞死情況以及即刻早基因Jun-B mRAN在I/R組、Hyp組、Sev組之間的表達(dá)情況，初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

TRIZOL(Invitrogen，10296028)，DEPC水(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司MDL，md911875)，ULtraPureAgarose(ABI-invitrogen，16500100)，SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen，11752050)，Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen，4472920)。

1.1.2 主要儀器

正置熒光顯微鏡(Leica，DM3000)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(THERMO，LEGEND MICRO 21R)，核酸濃度測(cè)定儀(THERMO，Nanodrop little)，qPCR儀[Applied biosystems(USA)，7900 Fast ]，電泳儀(biorad EPS，300)，凝膠成像儀(biorad，2500)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型

動(dòng)物：

成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF級(jí)；體重240～250g)由斯貝福(北京)生物技術(shù)公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)：11401500040906)。將大鼠分成全腦缺血再灌注損傷組(I/R組)、低氧預(yù)處理組(Hyp組)、七氟醚預(yù)處理組(Sev組)。每組12只(使用了40只，其中4只在造模后死亡)。

模型：

I/R組模型：按照 Pulsinelli經(jīng)典的大鼠四血管閉塞法[8]制作tGCI動(dòng)物模型。用10%水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉。行頸部正中橫切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈(約1cm)后用硅膠管系于頸總動(dòng)脈周圍并將其穿過聚乙烯紐扣的兩個(gè)小孔，再穿過一個(gè)2 cm長(zhǎng)的塑膠圓筒打結(jié)(避免血管受壓和血流受阻)，簡(jiǎn)易縫合切口。將大鼠固定于定位儀上，于枕部做縱切口，暴露第一頸椎板及橫突板上的翼小孔，用雙極電凝針電凝雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，縫合切口。待動(dòng)物完全蘇醒后將其移至籠內(nèi)飼養(yǎng)，夜間禁食，此時(shí)動(dòng)物行為正常，沒有明顯的腦損傷。24 h后在大鼠完全清醒的狀態(tài)下，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。大鼠在缺血30～60 s內(nèi)昏迷(翻正反射消失，雙側(cè)瞳孔放大，痛覺反射消失，這些癥狀持續(xù)于整個(gè)缺血過程中，凡未出現(xiàn)以上癥狀或這些癥狀未能持續(xù)整個(gè)缺血過程的大鼠棄用)。缺血10 min后恢復(fù)腦血流，大鼠恢復(fù)知覺開始活動(dòng)，未見明顯障礙(凡缺血后有癲癇、偏癱、驚厥等癥狀的大鼠均棄用)。

Hyp組模型：用低壓氧艙預(yù)處理大鼠。將低壓氧倉(cāng)(XF-2CL)氧氣濃度設(shè)定為8%(模擬海拔4000m)，關(guān)閉箱門排氣1 min后，將大鼠放入箱內(nèi)，每天1 h(同一時(shí)間，連續(xù)5d)。

Sev組模型：用七氟醚預(yù)處理大鼠。將大鼠放置在密閉的麻醉箱內(nèi)，接受2.4%七氟醚與100%氧氣混合氣體的預(yù)處理，每天1 h(同一時(shí)間，連續(xù)5d)。

各組在缺血10 min后恢復(fù)血流灌注，于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)[4h(T1)、24h(T2)、168h(T3)]斷頭取材(海馬組織)，部分置于20%蔗糖中固定用于FJB染色；部分置于-70 ℃冰箱保存用于Qpcr檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FJB染色

將海馬組織用20%蔗糖固定過夜后行冰凍切片(25μm)；切片用0.1 M的磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗后覆蓋2%的明膠，在50 ℃的烘箱中烘干(至少半小時(shí))。將烘干的切片依次浸入含1%NaOH的80%乙醇(將20mL 5% NaOH加入80mL無(wú)水乙醇中)內(nèi)5 min，然后浸入70%乙醇中，最后置于雙蒸水中(2min)。從雙蒸水中將切片轉(zhuǎn)移至0.06%的高錳酸鉀溶液10 min后在ddH2O中沖洗2 min。

準(zhǔn)備0.01%的FJB儲(chǔ)存液，將10 mg的染料粉末加到100 mL的ddH2O中，充分混合。準(zhǔn)備100 mL的0.0004% FJB染色溶液，加入4 mL的FJB儲(chǔ)存液到96 mL的0.1%醋酸溶液中。

將切片置于染色溶液中20 min后用ddH2O沖洗(1min×3times)。

1.2.2 Qpcr檢測(cè)

1.2.2.1 RNA提取

將樣本分別用液氮冷凍后研磨粉碎，加1 mL Trizol(invitrogen)到1.5 mL EP管中，加入500 μL酚氯仿，振蕩混勻，靜置5 min后離心(4℃，12000r/min)10 min，小心吸取上層上清液加入700 μL異丙醇，混勻后離心(4℃，12000r/min)10 min，小心去上清液，用75%乙醇洗滌一次，晾干，溶于50 μL DEPC處理液中，溶解沉淀。

1.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄

按照以下方法建立10 μL反應(yīng)體系(RNA200ng、MDL Oligo-dT1μL、MDL Random 1μL)：混勻，離心(65℃，12000r/min)5 min，結(jié)束后置于冰上。

在上述反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)液：10 mmd/L dNTP(1μL，MDL )、0.1 M DTT(2μL)、5×Buffer(4μL)、RT酶(1μL，ABI)?；靹?，離心，水浴(42℃，60min)。取出后繼續(xù)水浴(85℃，10min)，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后置-20 ℃冰箱待用。

1.2.3 擴(kuò)增

每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3遍，按照以下體系建立擴(kuò)增體系(20μL)：cDNA(2μL)，qPCR mix(10μL)，primer F(1μL)，primer R(1μL)，ddH2O(6μL)。于qPCR(ABI 7900)儀上，按照以下反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn)(40個(gè)循環(huán))：95 ℃(2min)、94 ℃(20s)、60 ℃(20s)、72 ℃(30s)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬神經(jīng)元壞死情況

結(jié)果顯示，三組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織海馬壞死神經(jīng)元數(shù)目不同：與I/R組相比，在T1、T2、T3點(diǎn)，各組FJB陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(P<0.01)。見表1、圖1。

Table 1 Necrosis of hippocampal neurons in different groups

*：與I/R組比較，P<0.01

綠色熒光表示海馬中FJB陽(yáng)性細(xì)胞

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)腦組織海馬Jun-B mRAN表達(dá)情況

三組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織海馬Jun-B mRAN表達(dá)含量不同：(1)與I/R組相比，在T1、T2、T3點(diǎn)，各組海馬Jun-B mRAN表達(dá)量均有顯著較少(P<0.01)。見表2。

Table 2 Contents of Jun-B mRAN

*：與I/R組比較，P< 0.01

3 討論

缺血性中風(fēng)是死亡的第二大原因，也是長(zhǎng)期致殘的最常見原因[9]，其發(fā)生與代謝紊亂、興奮性氨基酸釋放、鈣超載、自由基損傷、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[10]。腦缺血主要有三種病理類型：(1)缺血性卒中；(2)原發(fā)性腦出血；(3)蛛網(wǎng)膜下腔出血[11]。然而，目前針對(duì)缺血性卒中有效的臨床治療方法很少[12]。缺血早期再灌注對(duì)缺血腦組織血流的迅速恢復(fù)至關(guān)重要[13]。但在某些情況下，再灌注的使用并不利于大腦功能的恢復(fù)，反而會(huì)進(jìn)一步加劇缺血引起的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，即CIR[14]。作為對(duì)缺血缺氧最敏感的神經(jīng)元細(xì)胞，在腦CIR過程中神經(jīng)元遭受CIR損傷產(chǎn)生再灌注預(yù)后不良現(xiàn)象[15]。顯然，針對(duì)CIR的保護(hù)策略對(duì)缺血性腦卒中的治療具有重要意義，而目前針對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)策略仍然不足，需要探究更多的方法。低氧預(yù)處理(HPC)可增強(qiáng)缺氧缺血性損傷的耐受性，通過特定的機(jī)制提供神經(jīng)保護(hù)，減少細(xì)胞損傷凋亡[16，17]；麻醉預(yù)處理在體內(nèi)外均對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[18]，七氟醚預(yù)處理通過減少細(xì)胞損傷和抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[19]。此外，七氟醚亦被證明可以通過減少梗死周圍區(qū)域的神經(jīng)元凋亡和炎癥來(lái)保護(hù)受損的神經(jīng)元[20]。JunB屬激活蛋白-1(AP-1)蛋白亞家族JUN成員，而AP-1是一種二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由Jun(c-Jun、JunB、JunD)、Fos(c-Fos、FosB、Fra1、Fra2)和活化轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族等蛋白組成。AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族通過不同的刺激，如炎癥因子、應(yīng)激誘導(dǎo)因子或病原體等激活，此外此信號(hào)傳導(dǎo)還可以控制多種細(xì)胞活動(dòng)過程(包括增殖、分化、遷移、生存或死亡[21，22])，通過MAP激酶(MAPK)為基礎(chǔ)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與c-Jun n -末端激酶(JNKs)或細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激活A(yù)P-1復(fù)合物的信號(hào)[23，24]。

本研究結(jié)果提示：

(1)FJB染色檢測(cè)中：Hyp組、Sev組壞死神經(jīng)元比I/R組顯著降低(P<0.01)；(2)Qpcr檢測(cè)中：Hyp組、Sev組Jun-B mRAN表達(dá)含量比I/R組顯著降低(P<0.01)，說明以上兩種預(yù)處理方法對(duì)tGCI大鼠有明顯的保護(hù)作用，且此保護(hù)作用是通過調(diào)控Jun-B表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理、七氟醚預(yù)處理是通過調(diào)控JunB 發(fā)揮腦保護(hù)作用的。雖然其具體機(jī)制還有待研究，但已明確的具體調(diào)控因子為臨床CIR防治提供了新策略。