甘西鼠尾草對(duì)高原肺動(dòng)脈高壓大鼠的干預(yù)作用及可能機(jī)制※

王亞峰，王愛霞，王生彪，朵德龍，嚴(yán)英俊，李 茜

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007)

甘西鼠尾草(Salvia przewalskii Maxim.SPM)是唇形科鼠尾草屬多年生植物，又名大紫丹參和甘肅丹參，以根入藥，主要分布在我國(guó)甘肅西部、四川西部、云南西北部及西藏等地，四川和云南分別將其作為秦艽和丹參的代用品使用[1-3]。HAPH是一種因高原環(huán)境缺氧，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓和肺血管抵抗增加，并伴隨肺血管重構(gòu)和血管平滑肌細(xì)胞增殖增加為特征的疾病，該疾病最終可發(fā)展為右心衰竭甚至引起死亡，其機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括血管平滑肌細(xì)胞的增殖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及離子通道的改變等[4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道[6]和本課題組前期所獲結(jié)果都表明SPM具有明顯抗急性缺氧的作用，但該藥是否能防治大鼠HAPH還未定論，故本課題組以大鼠mPAP及RVHI為評(píng)價(jià)指標(biāo)探究了SPM對(duì)大鼠HAPH的干預(yù)作用。另外，通過(guò)測(cè)定肺組織中介導(dǎo)增殖和炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子(包括HIF-1α、NF-κB和MCP1mRNA)的表達(dá)水平來(lái)探究SPM發(fā)揮干預(yù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重120～160 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。

1.1.2 藥品與試劑

SPM藥液制備：SPM藥材經(jīng)潔凈、干燥和粉碎等步驟后用70%的乙醇溶液超聲提??；提取液經(jīng)離心、干燥及研磨后得浸膏粉。臨用前用蒸餾水配成混懸液。

藥品和試劑：氨基甲酸乙酯(烏來(lái)糖)購(gòu)自上海展云化工有限公司；肝素鈉注射液購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司；RT-PCR實(shí)驗(yàn)所需試劑和引物均購(gòu)自TaKaRa公司(HIF-1α上游引物序列：CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA，下游引物序列：GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA；NF-κB上游引物序列：CGACGTATTGCTGTGCCTTC，下游引物序列：TTGAGATCTGCCCAGGTGGTA；MCP1上游引物序列：CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC，下游引物序列：CAGCCGACTCATTGGGATCA)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MP150十六導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioPac公司、電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司(型號(hào)：BT 224S)、StepOnePlus Real Time PCR儀購(gòu)自賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

大鼠隨機(jī)分成5組，每組14只，分別為對(duì)照組(飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，海拔2260m)和缺氧組及缺氧+SPM低、中、高劑量組(低、中、高劑量為0.5、1、2g·kg-1。缺氧組及缺氧+SPM低、中、高劑量組均飼養(yǎng)于青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院，海拔4260m)，其中低、中、高劑量分別是臨床成人常用劑量的0.5、1.0、2.0倍。大鼠在相應(yīng)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后灌胃給藥(對(duì)照組和缺氧組給予相應(yīng)體質(zhì)量的蒸餾水)，連續(xù)4 w，期間所有大鼠均予自由飲食(水)。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

4 w后參照文獻(xiàn)[7]方法麻醉大鼠；測(cè)定mPAP；分離右心室(RV)、左心室(LV)和室間隔(S)并分別稱重。通過(guò)RV/(LV+S)公式計(jì)算右心室肥大指數(shù)(RVHI)。然后取相同部位肺組織置液氮保存，采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠肺組織中的HIF-1α、NF-κB和MCP1的mRNA表達(dá)情況。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SPM對(duì)大鼠mPAP及RVHI的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠的mPAP和RVHI均明顯升高(P<0.05)，且大鼠mPAP均大于30 mmHg，提示大鼠HAPH模型造模成功。與缺氧組比較，SPM劑量組大鼠的mPAP和RVHI均呈劑量依賴性降低，其中除低劑量組(0.5g·kg-1)的mPAP無(wú)明顯降低(P>0.05)外，中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的mPAP及各劑量組的RVHI均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見表1。

Table 1 Levels of mPAP and

#：與對(duì)照組比較P<0.05；*：與缺氧組比較P<0.05

2.2 SPM對(duì)HIF-1α、NF-κB及MCP1mRNA表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠肺組織中HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與缺氧組比較，SPM劑量組的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA表達(dá)水平均呈劑量依賴性降低，其中除低劑量組(0.5g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯降低外(P>0.05)，中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達(dá)水平及各劑量組的NF-κB和MCP1 mRNA表達(dá)水平均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見表2。

Table 2 HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA expression in the lung

#：與對(duì)照組比較P<0.05；*：與缺氧組比較P<0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組大鼠置于青海西寧(海拔約2260m)，缺氧組和缺氧+SPM劑量組均置于青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院(海拔約4260m)，每組大鼠均在相應(yīng)海拔連續(xù)處理4 w。在結(jié)果測(cè)定過(guò)程中，對(duì)照組、缺氧組、缺氧+低劑量SPM組、缺氧+中劑量SPM組分別有1、2、3、4只大鼠在采用右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓過(guò)程中因未能成功插管未得到相應(yīng)數(shù)據(jù)。

根據(jù)第六屆國(guó)際高原醫(yī)學(xué)和生理學(xué)術(shù)大會(huì)頒布的青海診斷標(biāo)準(zhǔn)，mPAP>30 mmHg是診斷HAPH的臨界指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果顯示缺氧組即高原連續(xù)處理4 w大鼠的mPAP顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且均在30 mmHg以上，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中大鼠HAPH模型造模成功。同時(shí)，結(jié)果顯示SPM可劑量依賴性地降低大鼠的mPAP，且中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的mPAP均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且均降至30 mmHg以下，提示SPM可預(yù)防大鼠HAPH的發(fā)生和發(fā)展。

HAPH是一種可引起肺血管收縮、重構(gòu)和肺循環(huán)功能障礙的疾病，其可造成右心室壓力持續(xù)超負(fù)荷，引起進(jìn)行性右心室肥大，若不能得到有效診治，最終會(huì)發(fā)展為右心衰竭而引起死亡[9]。本研究結(jié)果顯示，缺氧組和給藥組大鼠的RVHI均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明在高海拔環(huán)境下，持續(xù)的低壓低氧引起大鼠發(fā)生HAPH的同時(shí)還導(dǎo)致了進(jìn)行性的右心室肥大，而SPM干預(yù)組的RVHI較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且降低作用具有一定的劑量依賴性，提示SPM可明顯改善大鼠HAPH誘導(dǎo)的右心室肥大癥狀，從而在一定程度上阻止HAPH的進(jìn)一步發(fā)展。

此外，在高原環(huán)境下低氧是引起HAPH的主要因素，而HIF-1α作為調(diào)節(jié)低氧適應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)都表明其激活和過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的重要分子機(jī)制[10]。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)低氧處理4 w后，HAPH大鼠肺組織中的HIF-1α mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，提示HIF-1α處于一種過(guò)度激活和表達(dá)的狀態(tài)，而SPM干預(yù)組顯示出劑量依賴性地下調(diào)HIF-1α mRNA表達(dá)的作用，且中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達(dá)水平較缺氧組明顯降低(P<0.05)，提示SPM預(yù)防大鼠HAPA的發(fā)生可能與抑制HIF-1α mRNA過(guò)度表達(dá)有關(guān)。同時(shí)NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并對(duì)細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等起關(guān)鍵的調(diào)控作用[11-12]，各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究表明抑制NF-κB激活及其活性可明顯抑制HAPH的發(fā)展[13-14]。本研究結(jié)果顯示，缺氧組大鼠肺組織中NF-κB mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而SPM劑量組的NF-κB mRNA表達(dá)水平均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且降低作用具有明顯的劑量依賴性，提示SPM亦可能通過(guò)下調(diào)NF-κB mRNA過(guò)度表達(dá)而預(yù)防大鼠發(fā)生HAPH。另外，MCP1屬于趨化因子家族，是活化和聚集單核炎癥細(xì)胞至血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要介導(dǎo)者[15]，研究表明，其可以趨化和活化包括單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞等在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生與肺血管損傷等炎癥相關(guān)的正反饋過(guò)程，從而參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生和發(fā)展[16]。本研究結(jié)果顯示，缺氧組大鼠肺組織中MCP1 mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)，而SPM組可劑量依賴性地下調(diào)這一表達(dá)，提示SPM還可通過(guò)下調(diào)HAPH大鼠肺組織中的MCP1 mRNA表達(dá)水平來(lái)減輕炎癥癥狀而預(yù)防其發(fā)生HAPH。

綜上所述，SPM對(duì)高原環(huán)境誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓及右心室肥大具有明顯的預(yù)防和改善作用，且其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與下調(diào)HAPH大鼠肺組織中的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA過(guò)度表達(dá)有關(guān)。結(jié)合前期SPM抗急性缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究報(bào)道[17]即可發(fā)現(xiàn)，SPM在抗急慢性缺氧方面均有一定的作用，故有必要對(duì)其在防治急慢性高原病方面的作用進(jìn)行挖掘性研究。同時(shí)，其發(fā)揮抗缺氧作用的確切物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)行大量的研究工作。

(致謝：感謝青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院、青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心在本研究中所給予的大力支持和幫助！)