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    黃酒發(fā)酵菌株篩選、鑒定及應(yīng)用

    2019-12-03 02:13:02溫承坤李小強方尚玲陳茂彬
    釀酒科技 2019年11期
    關(guān)鍵詞:態(tài)氮黃曲霉黃酒

    陳 孝,溫承坤,張 玉,李小強,方尚玲,陳茂彬

    (湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心,湖北武漢 430068)

    黃酒作為一種發(fā)酵酒,氨基態(tài)氮(氨基酸)含量是其中的一項重要指標。氨基酸是組成生命的重要元素,是人體不可或缺的物質(zhì),同時在代謝和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。人體有8種必需氨基酸不能合成,需要從外界食物中攝入。目前很多中小型廠家黃酒中氨基酸含量較低,不能夠達到標準中的最低值。黃酒中氨基酸主要來源于原材料中蛋白質(zhì)的分解。本研究主要是為了增加黃酒發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分解力,通過提高氨基酸含量來完善黃酒品質(zhì),提高營養(yǎng)價值[1]。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑及儀器

    原料:酒曲,主要來源于麻城、房縣和孝感等酒廠;大米和小麥。

    試劑:Rnase、異丙醇、乙醇、SDS、無水乙醇、1X T(pH 8.0)、Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸溶液等。

    儀器設(shè)備:電子分析天平、搖床、pH計、磁力攪拌器、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、氣相色譜儀、糖度計、離心機、純水儀、電泳儀、研缽、酒精燈等。

    1.2 培養(yǎng)基

    ②土豆培養(yǎng)基:土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂2%。

    ③牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%。

    復(fù)篩培養(yǎng)基:①發(fā)酵培養(yǎng)基:大米粉5%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.1%、KH2PO40.5%、NaCl 0.5%。

    鑒定培養(yǎng)基:①察氏培養(yǎng)基:蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂2%。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 菌株篩選

    1.3.1.1 預(yù)處理

    將酒曲研磨成粉狀,準確稱取1 g加入裝有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中。加入滅菌的玻璃珠放入搖床,180 r/min振蕩30 min。取1 mL樣液并加入9 mL無菌生理鹽水,配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度菌懸液。

    1.3.1.2 初級篩選

    伴隨科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,為水輪發(fā)電機組容量的增大創(chuàng)造了良好的條件。水輪發(fā)電機組作為水電站最重要的設(shè)備,與水電站的經(jīng)濟效益和社會效益密切相關(guān)。為了確保水輪發(fā)電機組安全穩(wěn)定地運行,就必須對其配置進行可靠的保護。由于不同容量的水輪發(fā)電機組,其保護配置與特點不盡相同,但是無論怎么配置,都必須確保所配置保護動作可靠、經(jīng)濟合理,最大程度降低水輪發(fā)電機組因故障造成的損害,提升機組運行的高效性、安全性,促進水電站實現(xiàn)最大化經(jīng)濟效益。

    將上述菌液涂布于牛奶培養(yǎng)基上,32℃恒溫2~5 d。觀察菌落周圍有無透明圈出現(xiàn),并測量透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比。并將得到的菌株接種于土豆培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2~3 d,甘油管保存?zhèn)溆肹2]。

    1.3.1.3 復(fù)篩

    將得到的純種菌株接種于種子培養(yǎng)基中,以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中,32℃培養(yǎng)5~7 d。發(fā)酵結(jié)束后按照GB/T 13662—2018測量發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量,同時測量蛋白酶酶活,挑選性質(zhì)優(yōu)良的菌株作為目的菌株[3]。

    在pH3.0,40℃的條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位(U/g)。

    1.3.2 產(chǎn)酶曲線以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中,180 r/min、30℃搖床培養(yǎng),每隔24 h取5 mL菌液,按照斐林酚法測定酸性蛋白酶酶活,繪制不同時間下蛋白酶活曲線[4]。

    1.3.3 菌種鑒定

    將篩選得到的目的菌株編號為CX1,并進行菌種鑒定。

    菌落菌株觀察:經(jīng)過稀釋涂布、平板劃線、鏡檢,觀察到菌落形狀和菌株形態(tài)。

    18s rRNA菌株鑒定:取培養(yǎng)基上的菌株于研缽,液氮研磨。將研磨好的菌轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入0.6 mL TE(pH 8.0),攪勻,使菌體充分懸浮。加入250μL 10%SDS,倒轉(zhuǎn)混勻。加入3μL蛋白酶K(20 ng/μL),輕輕混勻,37℃水浴1 h。加入150μL 5 mol/L NaCl,輕輕混勻。加入150μL 2%CTAB,輕輕混勻,65℃水浴20 min。12000 r/min常溫離心20 min。取上清液移至新的15 mL離心管,加入等體積異丙醇,充分混勻,室溫放置30 min,12000 r/min,4℃離心10 min。棄上清液,在吸水紙上吸干液體,加750μL 70%vol乙醇,輕彈管壁,使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒幾次,12000 r/min,4℃離心2 min。每管加入30μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase,終濃度10 ng/μL),用手輕彈管壁,4℃溶解過夜[5]。

    目的菌株CX1利用18s引物(引物序列為ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4;5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增,利用常規(guī)PCR反應(yīng)體系和程序進行實驗。得到的PCR產(chǎn)物交由華大基因進行測序鑒定。對于測序結(jié)果利用DNAMAN和Mega X構(gòu)建NJ算法系統(tǒng)進化樹,最終確定菌株的進化地位。

    1.3.4 毒理試驗

    根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下發(fā)熒光,將分離得到的黃曲霉菌株接種在察氏培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)5~7 d后,于360 nm紫外燈下觀測,有熒光斑點的菌株為產(chǎn)毒菌株,沒有則為不產(chǎn)毒菌株[6]。

    1.3.5 菌種應(yīng)用

    1.3.5.1 酒曲制作

    以小麥為主要原料,同時按照0%、10%、20%、30%、40%、50%麩皮添加量進行混合。取原料3%~4%(v/w)的種子液,用無菌水定容至30%(v/w),接入原料中混勻。32℃培養(yǎng)5~7 d后進行干燥處理。

    1.3.5.2 發(fā)酵實驗

    將得到的酒曲進行發(fā)酵實驗。

    (1)選擇無蟲蛀、無霉變、無雜質(zhì)的干凈大米按重量比1∶1.5~1∶2與水浸泡12~18 h,108℃下蒸煮20 min,取大米質(zhì)量30~50%(v/w)的無菌水進行冷卻。

    (2)稱取0.8%米飯質(zhì)量的麥曲,充分混勻,待發(fā)酵5~7 d后,10000 r/min離心5 min取上清液,保存?zhèn)溆谩?/p>

    將得到的上清液進行理化實驗,檢測其總糖、氨基態(tài)氮含量。同時利用氣相色譜對其風味物質(zhì)進行檢測[7-8]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株篩選

    將牛奶培養(yǎng)基篩選出來的菌株利用土豆培養(yǎng)基進行劃線純化,純化后的菌株編號為1、2、3、4、5、6,并進行發(fā)酵實驗,測定蛋白酶酶活(圖1-I)和氨基態(tài)氮含量(圖1-II)。得到目的菌株,命名為CX1,其初始酶活為95 U/mL,發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量為1.1 g/L。

    2.2 菌種鑒定

    目的菌株CX1進行菌落(圖2左)與菌株(圖2右)形態(tài)觀察,初步鑒定為霉菌。

    對目的菌株CX1進行測序鑒定,測序結(jié)果通過Blast進行比對。利用Mega X與DNAMAN進行系統(tǒng)進化樹的繪制(圖3),最終確定為Aspergillus flavus。

    2.3 產(chǎn)酶曲線

    每隔24 h取5 mL的CX1發(fā)酵液進行酶活檢測,圖4說明1 d時蛋白酶活力較低,為71 U/mL,4 d時蛋白酶活力達到最高值196 U/mL、7 d時酶活力下降為101 U/mL,發(fā)現(xiàn)其最佳產(chǎn)酶時間為4 d,此時酶活力達到最大值。

    2.4 毒理試驗

    圖1 菌株蛋白酶酶活及氨基態(tài)氮含量

    圖2 CX1菌落圖與菌株形態(tài)圖

    根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下顯色,將分離得到的黃曲霉菌株接種在YES培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)7 d后,于紫外燈下觀測,CX1菌株(圖5左)與文獻中產(chǎn)黃曲霉毒素菌株(圖5右)進行對比[9],圖5左結(jié)果顯示,CX1菌株不產(chǎn)熒光斑點,此黃曲霉不產(chǎn)毒素。

    2.5 菌株應(yīng)用

    對黃酒發(fā)酵結(jié)果進行檢測,圖6-I說明當麩皮含量為20%、30%、40%時糖化力最高,能夠達到96.95 g/L。圖6-II說明麩皮添加量為0%、20%時氨基態(tài)氮含量較高,能達到1.51 g/L,當麩皮含量為50%時,氨基態(tài)氮含量最低為0.96 g/L,酒中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為異丁醇、己偶姻、乙酸糠酯、5-甲基糠醛和4-甲基愈創(chuàng)木酚。氨基態(tài)氮含量較高,可以解決大部分廠家黃酒中氨基態(tài)氮含量不能達標的技術(shù)難題。

    圖3 黃曲霉菌株CX 1與近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖4 蛋白酶活曲線

    圖5 紫外燈下黃曲霉顯色圖

    3 結(jié)論與討論

    從酒曲中篩選得到6株產(chǎn)蛋白酶的菌株,編號為CX1、CX2、CX3、CX4、CX5、CX6。通過斐林酚法復(fù)篩,得到高蛋白酶活力菌株CX1。對CX1進行鑒定,確定其為黃曲霉。利用黃曲霉毒素在紫外燈下有熒光反應(yīng)進行毒理試驗,發(fā)現(xiàn)無熒光斑點,檢測無毒。CX1的蛋白酶活力最高可達到196 U/mL,進行發(fā)酵實驗測得氨基態(tài)氮1.51 g/L、糖度96.95 g/L。氨基態(tài)氮大于優(yōu)質(zhì)甜型黃酒的標準值。

    圖6 糖度、氨基態(tài)氮含量

    CX1菌株蛋白酶活力較強,在黃酒發(fā)酵中能產(chǎn)生大量的氨基態(tài)氮。能解決大部分中小型廠家氨基態(tài)氮含量不符合最低生產(chǎn)標準的實際生產(chǎn)問題。但CX1菌株的發(fā)酵產(chǎn)物糖度值和酒精度較低,為了滿足生產(chǎn)要求可以與高糖化力和高發(fā)酵力的菌株進行復(fù)配。同時對黃酒的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化,使生產(chǎn)工藝與菌株相適應(yīng)。

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