PITC柱前衍生HPLC法測定黃精紅曲酒中游離氨基酸含量

張 孟，呂啟梅，蘇曉嵐，灑榮波

（山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）生命科學學院，山東泰安 271000）

紅曲酒是中國傳統(tǒng)名酒，屬于漢代制曲釀酒的一個重大發(fā)明[1]。紅曲酒作為黃酒中的一種傳統(tǒng)保健酒，具有活血化瘀、健脾暖胃之療效，現代醫(yī)學證實它還具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗氧化[4]、降血壓[5]等功效。在紅曲酒生產工藝的基礎上，加入一種或多種中藥材混合發(fā)酵，可以釀制保健紅曲酒，在很大程度上迎合了人們對低度保健酒的需求。黃精是我國傳統(tǒng)的中草藥，性平、味甘，具有補血益氣、滋腎潤肺、生津補脾等功效[6]。泰山醫(yī)學院釀造協(xié)會經過兩年潛心研究，研發(fā)出了一種工藝成熟的具有保健功能的黃精紅曲酒，相對于市場上的同類產品，具有獨特的工藝特點和優(yōu)勢。

黃精紅曲酒中含有多種生理活性物質和營養(yǎng)元素，如紅曲色素[7]、Monacolin K[8-10]、氨基酸[11-12]、γ-氨基丁酸[13]等。黃精紅曲酒中的氨基酸一部分來自原料黃精，一部分來自微生物的代謝作用，是評價紅曲黃酒風味和營養(yǎng)質量的一項重要指標[14]。目前，氨基酸的測定方法有顯色法、氨基酸自動分析儀、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法等[15]。其中，高效液相色譜法測定氨基酸以其靈敏度高、重復性好應用最為廣泛，其原理是使用衍生試劑對氨基酸進行衍生后在檢測器下的響應值進行定性和定量。以異硫氰酸苯酯（PITC）作為柱前衍生劑的氨基酸分析方法以其反應速度快，產物單一、穩(wěn)定性好等優(yōu)點而得到廣泛的應用，其與紫外檢測器結合，可提供較高的靈敏度，檢出限約為1 pmol/L[16]。黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量檢測迄今為止未見報道。本文以PITC衍生法檢測了自釀的黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量，為產品的進一步開發(fā)奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

黃精紅曲酒：泰山醫(yī)學院釀造協(xié)會研發(fā)。

糯米購于吉林市永鵬農副產品開發(fā)有限公司；白曲購于廣西全州縣全發(fā)酒曲廠；紅曲米購于麗水力克生物科技有限公司；黃精粉，購于陜西柏科生物工程有限公司。

17種氨基酸混合標樣：天門冬氨酸（Asp）；谷氨酸（Glu）；絲氨酸（Ser）；甘氨酸（Gly）；組氨酸（His）；精氨酸（Arg）；蘇氨酸（Thr）；丙氨酸（Ala）；脯氨酸（Pro）；酪氨酸（Tyr）；纈氨酸（Val）；蛋氨酸（Met）；異亮氨酸（Ile）；亮氨酸（Leu）；苯丙氨酸（Phe）；賴氨酸（Lys），購自美國沃特世公司，氨基酸的濃度均為2.5 mmol/L；乙腈（色譜純）購自德國默克公司；異硫氰酸苯酯，乙酸鈉、正己烷等均為國產分析純試劑。

安捷倫1200高效液相色譜儀；安捷倫1200二極管陣列檢測器；Milli-Q超純水制備機。

1.2 自釀黃精紅曲酒生產操作要點

（1）浸米：選用優(yōu)質糯米，浸米時間為24 h，浸米完畢瀝干。

（2）蒸飯：將浸好的糯米放入蒸鍋中，至有蒸汽產生后繼續(xù)加熱15 min。

（3）淋飯：糯米蒸透后，立即用冷水沖淋，使其降溫至30℃左右。

（4）落缸搭窩：將蒸好涼透的糯米置于發(fā)酵罐中，加入0.5%的白曲混合均勻。將中間的糯米挖空，搭窩。

（5）糖化：糖化48 h，窩內聚集至五分之四的液體后，糖化結束。

（6）發(fā)酵：向糖化好的糯米醅中加入10%的紅曲米，另加入與原料米量1∶1的純凈水，攪拌混合均勻，進入紅曲發(fā)酵階段。每隔2 d攪拌糯米醅，將上面的糯米粒壓到下面，直到發(fā)酵結束。發(fā)酵階段持續(xù)10 d。

（7）從發(fā)酵的第5天開始，向糯米醅中加入0.5%的黃精粉，混合均勻。

（8）壓榨過濾：發(fā)酵結束后，用200目的束口布袋過濾酒醅，過濾液投入到澄清罐中自然沉降。2 d后用虹吸管將澄清罐中的上清液移入玻璃瓶中。

（9）巴氏滅菌：將裝滿紅曲酒的玻璃瓶放入巴氏滅菌器中滅菌后，放于陰涼處保存。

1.3 試劑配制

0.1mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液：準確移取120μL異硫氰酸苯酯溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

1 mol/L三乙胺-乙腈溶液：準確移取1.398 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

乙酸鈉緩沖鹽溶液：準確稱量2.72 g三水乙酸鈉于1000 mL水中，充分溶解后，用0.45μm水相濾膜過濾后備用。

1.4 樣品衍生化

向2 mL離心管中加入氨基酸混合標樣或經0.45μm濾膜過濾的黃精紅曲酒樣品50μL和150μL超純水，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液100μL和1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100μL后振蕩混勻。靜置1 h后加入正己烷400μL，充分振蕩后靜置10 min，待溶液分層后取下層溶液進行HPLC分析。

1.5 色譜條件

色譜柱使用美國SMA氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為乙酸鈉緩沖液-乙腈（97∶3，V/V），流動相B為乙腈-水（4∶1，V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃，進樣量10μL，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.6 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，每組進行3次平行實驗，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 氨基酸標樣的定性

本文試驗了Agilent TC-C18柱、Ultimate XB C-18、ODS通用柱和美國SMA氨基酸專用分析柱對氨基酸標樣中的17種氨基酸進行檢測，發(fā)現使用美國SMA氨基酸專用分析柱檢測可以使氨基酸標樣中的17種氨基酸達到基線分離，在選定的分離條件下，其分離效果和穩(wěn)定性最好。17種氨基酸分離色譜圖如圖1—圖3所示。

圖1 17種氨基酸混合標樣高效液相色譜圖

圖2 自釀黃精紅曲酒中氨基酸檢測色譜圖

圖3 市售黃精紅曲酒中氨基酸檢測色譜圖

2.2 檢測方法的標準曲線和檢測限（表2）

表2 17種氨基酸的線性回歸方程、檢測限和分離度

將氨基酸混和標準溶液（2.5 mmol/L）按2倍梯度逐漸稀釋至0.01 mmol/L，按照上述的色譜條件進行紫外檢測，以各氨基酸色譜峰峰面積y對氨基酸濃度x進行回歸分析，得到線性回歸方程。結果表明，除天冬氨酸和谷氨酸檢測標準曲線的線性范圍較窄外（分別為0.08～2.5 mmol/L和0.16～2.5 mmol/L），其他氨基酸基本在0.02～2.5 mmol/L范圍內均具有較好的線性關系，所有氨基酸的標準曲線在設定的線性范圍內的相關系數均≥0.99。

2.3 樣品中氨基酸種類和含量的測定

自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中氨基酸的HPLC檢測色譜圖如圖2和圖3所示。從檢測結果來看，自釀黃精紅曲酒中氨基酸的種類比市售黃精紅曲酒氨基酸的種類要少，自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中均沒有天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸，自釀黃精紅曲酒中檢測到了13種氨基酸，市售黃精紅曲酒中檢測到了14種氨基酸。從氨基酸含量來看，除丙氨酸外，自釀黃精紅曲酒中所能檢測到的氨基酸含量均比市售黃精紅曲酒中的要高，如自釀黃精紅曲酒比市售黃精紅曲酒中賴氨酸含量要高出5倍。自釀黃精紅曲酒中的總氨基酸含量為3947.1 mg/L，市售黃精紅曲酒中的總氨基酸含量為2701.1 mg/L，前者比后者在氨基酸總量上多出近50%。

2.4 加標回收率和精密度實驗

對自釀黃精紅曲酒進行等量的加標實驗，平行測定3次，實驗結果如表3。樣品平均加標回收率在73.6%～102.5%之間，相對標準偏差在2.45%～6.34%范圍之間，可以滿足自釀黃精紅曲酒中氨基酸含量測定的要求。

表3 自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中的氨基酸種類和含量檢測結果

2.5 重復性實驗

將17種氨基酸混合標樣在本實驗的檢測條件下連續(xù)進樣3次，考察檢測方法的重復性。結果顯示，17種氨基酸的峰面積的相對標準偏差RSD在0.2%～0.7%范圍以內。

3 結論與討論

本研究成功建立了一種快速有效的檢測自釀黃精紅曲酒中的游離氨基酸含量的方法，經PITC衍生后，17種氨基酸在36 min以內均得到了基線分離，檢測時間優(yōu)于已經報道的文獻中氨基酸的檢測時間。利用建立的方法對自釀黃精紅曲酒和一種市售黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量進行了檢測，結果發(fā)現，自釀黃精紅曲酒中的氨基酸種類要少于市售黃精紅曲酒；但自釀黃精紅曲酒中氨基酸總量比市售黃精紅曲酒高出近50%。從氨基酸的呈味特征來分析，苦味氨基酸和甜味氨基酸占據了兩種酒樣中氨基酸總量的絕大部分，澀味氨基酸僅占近10%的比例。

在所檢測的氨基酸中，按照呈味特征可以分為4類：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、脯氨酸和蛋氨酸為甜味氨基酸；纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸為苦味氨基酸；天冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸；酪氨酸為澀味氨基酸。從呈味特征方面對酒樣中氨基酸風味進行分析，結果見圖4。從圖4可以看出，苦味氨基酸和甜味氨基酸是兩種紅曲酒樣品中的主要氨基酸組分，分別占到了氨基酸總量的93%和92%，澀味氨基酸含量最少，分別僅占7%和8%，鮮味氨基酸在兩種酒樣中均沒有檢測到。

圖4 兩種酒樣中氨基酸的風味分析

氨基酸作為黃精紅曲酒中非常重要的一類風味物質，其快速和準確的檢測方法，一直受到人們的高度關注。本研究方法的成功建立，為紅曲酒生產企業(yè)研究其風味物質來源研究提供了理論依據，將在很大程度上促進我國保健紅曲酒的發(fā)展。